本發(fā)明涉及一種產(chǎn)2-mib藍(lán)藻的探針雜交快速檢測(cè)方法。

技術(shù)背景

近年來(lái)，隨著水體富營(yíng)養(yǎng)化的日益加重，藍(lán)藻水華在全球尤其是我國(guó)大面積爆發(fā)。水華問(wèn)題已經(jīng)成為我國(guó)環(huán)境保護(hù)領(lǐng)域所面臨的重大問(wèn)題。很多藍(lán)藻會(huì)分泌具有異味的揮發(fā)性次生代謝產(chǎn)物，使水體和水產(chǎn)品產(chǎn)生令人反感的嗅味。水體異味問(wèn)題不僅大大降低了飲用水的水質(zhì)，還對(duì)漁業(yè)、生態(tài)景觀和旅游業(yè)等造成了巨大的損失。2-mib（2-甲基異莰醇）是一種具有強(qiáng)烈氣味的有機(jī)化合物，是飲用水嗅味問(wèn)題存在的主要物質(zhì)。作為富營(yíng)養(yǎng)化水體中重要的生物類群，藍(lán)藻通常被認(rèn)為2-mib合成和釋放的主要生物類群。

納米金即指金的微小顆粒，其直徑在1～100nm，具有高電子密度、介電特性和催化作用，能與多種生物大分子結(jié)合，且不影響其生物活性。檸檬酸鈉還原氯金酸制備的納米金溶液中，納米金顆粒能均勻的分散在溶液中，并呈現(xiàn)出紅色。在一定濃度的鹽作用下，納米金顆粒能快速聚合導(dǎo)致顏色變化，隨便鹽濃度的增加，顏色變紫至無(wú)色。探針是一種短鏈dna，能吸附在納米金顆粒表面從而避免鹽誘導(dǎo)納米金聚合。而探針能與pcr擴(kuò)增產(chǎn)物特異性結(jié)合。目前，納米金被廣泛用于生物標(biāo)記和檢測(cè)，但用于對(duì)產(chǎn)2-mib藍(lán)藻的檢測(cè)尚未見(jiàn)報(bào)道。

傳統(tǒng)的分子生物技術(shù)在對(duì)2-mib合成基因進(jìn)行擴(kuò)增后需要進(jìn)行凝膠電泳進(jìn)行定性分析，這無(wú)疑增加了檢測(cè)成本，且電泳時(shí)通常使用的eb染劑有致癌性。探針雜交法則在擴(kuò)增后與探針進(jìn)行雜交再加入納米金與鹽溶液即可通過(guò)肉眼觀察進(jìn)行定性檢測(cè)，雜交顯色反應(yīng)在10min內(nèi)即可完成。本方法所需成本低，較傳統(tǒng)方法耗時(shí)短，且減少了電泳過(guò)程帶來(lái)的健康風(fēng)險(xiǎn)，對(duì)水質(zhì)監(jiān)測(cè)具有重大的現(xiàn)實(shí)意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種產(chǎn)2-mib藍(lán)藻的探針雜交快速檢測(cè)方法。

為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

一種產(chǎn)2-mib藍(lán)藻的探針雜交快速檢測(cè)方法，其特征在于該方法的具體步驟為：

a.提取含藻水樣中藻類的總基因組dna，并溶于無(wú)菌雙蒸水保存；

b.將步驟a所提取到的dna進(jìn)行pcr擴(kuò)增反應(yīng)，每50μl反應(yīng)體系中含有：

premixextaq酶25μl，

10μmol/l的特異性擴(kuò)增2-mib合成相關(guān)單萜環(huán)化酶基因的正反引物各0.5μl，

待檢測(cè)的dna1μl，

雙蒸水23μl，

所述的特異性擴(kuò)增2-mib合成相關(guān)單萜環(huán)化酶基因的正反引物為：

fip5’-cgcataggcaccccaagagacgcaagtccagcgcacct-3’；

bip5’-ttggaagtatctagccgcgcg-gggtcgattagcgtcatg3’；

反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3min，接著40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)94℃30s、58℃30s和72℃30s，循環(huán)過(guò)后最后72℃延伸5min；

c.將步驟b所得pcr擴(kuò)增產(chǎn)物與特異性探針經(jīng)高溫變性后雜交，探針序列為：f35’-tgggccagtacgccac-3’、b35’-ggaggacgtaccctccaatg-3’，雜交反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃5min，50℃3min；所述的pcr擴(kuò)增產(chǎn)物與特異性探針溶液的體積比為4：1～10：1；所述的探針溶液的濃度是10μmol/l；

d.在步驟c所得雜交反應(yīng)混合物中加入納米金溶液和鹽溶液進(jìn)行顯色反應(yīng)；所述的雜交反應(yīng)混合物與納米金溶液和鹽溶液的體積比為：1：6：3；所述的鹽溶液的濃度為：20mmol/l～50mmol/l；所述的納米金溶液，是由檸檬酸三鈉還原1%氯金酸制備而成，納米金的粒徑為13～25nm。

所述的鹽溶液為：磷酸緩沖鹽溶液pbs、氯化鈉溶液、氯化鈣溶液或氯化鎂溶液。

所述的步驟d中的顯色反應(yīng)采用紫外分光光度計(jì)，測(cè)定吸光度值范圍為450～650nm之間。

傳統(tǒng)的分子生物方法對(duì)2-mib合成基因進(jìn)行擴(kuò)增后需要進(jìn)行凝膠電泳進(jìn)行定性分析，本方法在擴(kuò)增后與探針進(jìn)行雜交再加入納米金與鹽溶液即可通過(guò)肉眼觀察進(jìn)行定性檢測(cè)，雜交顯色在10min內(nèi)即可完成，總檢測(cè)時(shí)長(zhǎng)不超過(guò)2小時(shí)。方法簡(jiǎn)單易行，所需成本低，無(wú)需貴重儀器，節(jié)約了時(shí)間，且減少了電泳過(guò)程帶來(lái)的健康風(fēng)險(xiǎn)。

附圖說(shuō)明

圖1為2-mib合成基因的pcr產(chǎn)物與探針雜交反應(yīng)后顏色對(duì)比；

圖2為2-mib合成基因的pcr產(chǎn)物與探針雜交反應(yīng)后吸光度的對(duì)比，以不含2-mib合成基因的擴(kuò)增產(chǎn)物為陰性對(duì)照。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體的實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明作詳細(xì)描述。

將本發(fā)明應(yīng)用于檢測(cè)地表水源水中產(chǎn)2-mib的藍(lán)藻，具體實(shí)驗(yàn)操作步驟如下：

材料制備：

在三頸燒瓶中加入100ml、1mmol/l的氯金酸，加熱至沸騰時(shí)加入10ml、38.8mmol/l的檸檬酸三鈉，待顏色變?yōu)榫萍t色后繼續(xù)加熱15min。整個(gè)過(guò)程持續(xù)攪拌、冷凝回流。制備納米金溶液粒徑為13nm，呈紅色。

用磷酸氫二鈉與磷酸二氫鈉配制80mmol/l的pbs鹽溶液。

樣品采集和dna提取

采集2016年9月份華東地區(qū)某飲用水源水庫(kù)中水樣進(jìn)行產(chǎn)2-mib藍(lán)藻的定性檢測(cè)。

將500ml水樣經(jīng)0.45μm醋酸纖維素膜過(guò)濾，對(duì)濾膜進(jìn)行總dna的提取。

pcr擴(kuò)增：將提取到的dna進(jìn)行pcr擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)體系為50μl，包括：25μlpremixextaq（takara，日本）,特異性擴(kuò)增2-mib合成相關(guān)單萜環(huán)化酶基因的正反引物（10nmol/l）各0.5μl，引物序列為：fip5’-cgcataggcaccccaagagacgcaagtccagcgcacct-3’、bip5’-ttggaagtatctagccgcgcg-gggtcgattagcgtcatg-3’。待檢測(cè)的dna1μl，雙蒸水23μl。

反應(yīng)程序?yàn)椋海?4℃預(yù)變性3min，接著40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)94℃30s、58℃30s和72℃30s，循環(huán)過(guò)后最后72℃延伸5min。

探針雜交反應(yīng)：在pcr擴(kuò)增產(chǎn)物中加入1μl特異性探針，陰性對(duì)照為與探針不匹配的擴(kuò)增產(chǎn)物，經(jīng)高溫變性后雜交，所用探針濃度為10μmol/l，序列為：5’-tgggccagtacgccac-3’、5’-ggaggacgtaccctccaatg-3’，雜交反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃5min，50℃3min。

鹽誘導(dǎo)納米金顯色反應(yīng)：取10μl雜交反應(yīng)混合物，加入90μl納米金溶液后混合均勻，再加入終濃度為20mmol/l鹽溶液進(jìn)行顯色反應(yīng)，觀察顏色變化并用紫外光譜掃描加以驗(yàn)證。結(jié)果如圖1所示，含產(chǎn)2-mib合成基因的反應(yīng)液顏色由紅色變成紫色（圖1左），而陰性對(duì)照顏色仍保持紅色不變（圖1右）。如圖2，在520nm左右波長(zhǎng)處，含2-mib合成基因的反應(yīng)液有較大的吸收峰（峰值接近2.0），而對(duì)照組的吸光度值有明顯的降低（1.0-1.5之間）。

<110>上海大學(xué)

<120>一種產(chǎn)2-mib藍(lán)藻的探針雜交快速檢測(cè)方法

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<212>dna

<213>人工引物

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<212>dna

<213>人工引物

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<212>dna

<213>探針

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<212>dna

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