本發(fā)明涉及細胞內(nèi)巰基化合物的檢測及靶向給藥技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種多功能磁性DNA納米球及其制備方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

脫氧核糖核苷酸(DNA)的互補性表現(xiàn)在胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)、腺嘌呤(A)和鳥嘌呤(G)這四種核苷酸的互補性上。就本質(zhì)上而言，DNA的互補性是DNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的基礎(chǔ)，造就了DNA雙鏈的雙螺旋結(jié)構(gòu)。與傳統(tǒng)觀念認為DNA具有遺傳性相比較，已經(jīng)發(fā)展了越來越多的利用其生物相容性與納米技術(shù)相結(jié)合的成功案例，比如DNA納米籠，是一種可有效封裝酶的結(jié)構(gòu)，六分之五的被檢測的代謝酶表現(xiàn)出比一般代謝酶高4到10倍的轉(zhuǎn)換率。DNA納米花也是一種該方面的發(fā)現(xiàn)，被用于選擇性識別癌細胞并進行相應(yīng)藥物的輸送等。這些都表現(xiàn)出了DNA極大的可塑性。然而，這些方法也存在一些固有的缺點，尤其在生物分離上。因此，易于生物分離與純化的納米技術(shù)或新型材料的創(chuàng)新是非常重要的。而磁性納米材料作為候選材料在磁性領(lǐng)域引起了極大反響。

作為最具有代表性的磁珠被廣泛應(yīng)用到生物學(xué)和診斷學(xué)當中，磁珠擁有磁性納米顆粒和進口材料所有的特性，在磁性材料領(lǐng)域內(nèi)被廣泛拓展使用。它具有易操作的特點，被研究者們用在搭載，吸附和富集等各個步驟上，比如最簡單有效地磁性分離和回收利用等操作。此外，醫(yī)學(xué)上的核磁共振成像則是利用了其高空間分辨率和組織穿透力。與傳統(tǒng)方法相比，所有此方面的研究都提高了實驗的靈敏度和選擇性。

在醫(yī)療診斷領(lǐng)域，僅靠單一目標來判斷結(jié)果容易導(dǎo)致“假陽性”，因為疾病大都跟多種生物分子有關(guān)，傳統(tǒng)的單一方式的檢測方法不能滿足疾病診斷的需要，疾病早期診斷的精確度可以通過對多個目標的檢測來提高，目前生物醫(yī)療領(lǐng)域已經(jīng)設(shè)計出多種目標檢測的方案，多目標材料和技術(shù)與生物成像及傳感等方面的結(jié)合仍具有巨大的應(yīng)用潛能。與傳統(tǒng)的單一功能納米粒子相比較，多功能的磁珠可以優(yōu)化在生物傳感、目標靶向、藥物輸送和治療等方面的個性化診療。

DNA滾環(huán)復(fù)制擴增技術(shù)可實現(xiàn)對靶向核酸和蛋白質(zhì)的靈敏檢測，而且滾環(huán)復(fù)制產(chǎn)物可定量目標物，滾環(huán)復(fù)制產(chǎn)物不光靠自組裝形成納米結(jié)構(gòu)，還可形成可溶性的線狀長鏈。通過設(shè)計合理的DNA合成方案，可以形成納米結(jié)構(gòu)，DNA納米球就是這樣一種納米結(jié)構(gòu)。但目前對于DNA納米球的研究較少，特別是能夠特異性識別靶細胞，作為靶向藥物輸送的載體，同時還能檢測細胞內(nèi)的谷胱甘肽的多功能DNA納米球目前尚未見報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種多功能磁性DNA納米球及其制備方法。

本發(fā)明的另一目的在于提供上述多功能磁性DNA納米球在制備檢測細胞內(nèi)巰基化合物的試劑中的應(yīng)用和/或制備靶向給藥系統(tǒng)中的應(yīng)用。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

本發(fā)明的第一方面，提供一種多功能磁性DNA納米球，所述多功能磁性DNA納米球包括：結(jié)合有磁珠的DNA納米球(MNP/DNA-SP)和/或含雙硫鍵的結(jié)合磁珠的DNA納米球(MNP/DS-SP)；

所述結(jié)合有磁珠的DNA納米球由如下方法制備而成：

(1)構(gòu)建反應(yīng)體系，進行DNA鏈的環(huán)化和連接，得到結(jié)合了磁珠的環(huán)狀DNA；所述反應(yīng)體系包括：磷酸化的線性DNA模板單鏈、DNA引物單鏈I、T₄DNA連接酶、D-PBS溶液和磁珠(MNPs)溶液；

(2)將結(jié)合了磁珠的環(huán)狀DNA與phi29DNA聚合酶和dNTP溶液混合，進行滾環(huán)擴增反應(yīng)，即得結(jié)合有磁珠的DNA納米球。

優(yōu)選的，步驟(1)中，所述磷酸化的線性DNA模板單鏈的序列如SEQ ID NO.1所示，具體如下：

Phosphate-TTC CCG GCG GCG CAG CAG TTA GAT GCT GCT GCA GCG ATA CGC GTA TCG CTA TGG CAT ATC GTA CGA TAT GCC GCAGCAGCA TCT AAC CGT ACA GTA TT；(SEQ ID NO.1)其中，斜體標注的區(qū)域為sgc8序列，即CEM細胞的核酸適配體序列。

優(yōu)選的，步驟(1)中，所述DNA引物單鏈I與磷酸化的線性DNA模板單鏈部分互補。作為優(yōu)選的方案，所述DNA引物單鏈I為多聚(T)DNA引物單鏈或修飾生物素分子的DNA引物單鏈。其中：

多聚(T)DNA引物單鏈的序列如SEQ ID NO.2所示，具體如下：

AAA AAA AAA AAA AAA TCT AAC TGC TGC GCC GCC GGG AAA ATA CTG TAC GGT TAG ATG CTG CTG C；(SEQ ID NO.2)。

修飾生物素分子的DNA引物單鏈的序列如SEQ ID NO.3所示，具體如下：

Bio-TCT AAC TGC TGC GCC GCC GGG AAA ATA CTG TAC GGT TAG ATG CTG CTG C；(SEQ ID NO.3)

優(yōu)選的，步驟(1)中，所述反應(yīng)體系中，磷酸化的線性DNA模板單鏈和DNA引物單鏈的濃度為80-120μM，優(yōu)選為100μM；T₄DNA連接酶的濃度為1800-2200U/μL，優(yōu)選為2000U/μL；所述D-PBS溶液的pH值為7.4。

所述磷酸化的線性DNA模板單鏈、DNA引物單鏈、T₄DNA連接酶、D-PBS溶液和磁珠溶液加入的體積比為0.6：1.2：0.5：(97-98)：10。

優(yōu)選的，步驟(1)中，DNA鏈的環(huán)化和連接的操作為：將磷酸化的線性DNA模板單鏈與D-PBS溶液混合均勻后，在PCR儀中，于95℃反應(yīng)2min，之后以0.4℃/min降溫至55℃；再加入DNA引物單鏈，混合均勻后，在PCR儀中以0.4℃/min降溫至25℃；再加入T₄DNA連接酶和磁珠溶液，混合后，于25℃反應(yīng)4h。

優(yōu)選的，步驟(1)中，所述磁珠溶液為鏈霉親和素磁珠溶液。

優(yōu)選的，步驟(2)中，所述phi29DNA聚合酶的濃度為10U/μL，dNTPs溶液的濃度為10mM。

優(yōu)選的，步驟(2)中，滾環(huán)擴增反應(yīng)的溫度為25-35℃，反應(yīng)時間為8-12h；反應(yīng)的終止溫度為60-70℃，終止反應(yīng)的時間為8-12min。進一步優(yōu)選的，滾環(huán)擴增反應(yīng)的溫度為30℃，反應(yīng)時間為10h；反應(yīng)的終止溫度為65℃，終止反應(yīng)的時間為8-10min。

所述含雙硫鍵的結(jié)合磁珠的DNA納米球由如下方法制備而成：

(1)構(gòu)建反應(yīng)體系，進行DNA鏈的環(huán)化和滾環(huán)擴增反應(yīng)，得到滾環(huán)擴增產(chǎn)物；所述反應(yīng)體系包括：磷酸化的線性DNA模板單鏈、DNA引物單鏈I、T₄DNA連接酶、D-PBS溶液、phi29DNA聚合酶和dNTPs；

(2)將鏈霉親和素磁珠與DNA引物單鏈II混合反應(yīng)，然后與滾環(huán)擴增產(chǎn)物反應(yīng)形成含雙硫鍵的結(jié)合磁珠的DNA納米球。

步驟(1)中，所述磷酸化的線性DNA模板單鏈的序列如SEQ ID NO.1所示。

步驟(1)中，所述DNA引物單鏈I與磷酸化的線性DNA模板單鏈部分互補。作為優(yōu)選的方案，所述DNA引物單鏈I為多聚(T)DNA引物單鏈或修飾生物素分子的DNA引物單鏈。其中：

多聚(T)DNA引物單鏈的序列如SEQ ID NO.2所示；修飾生物素分子的DNA引物單鏈的序列如SEQ ID NO.3所示。

步驟(2)中，所述DNA引物單鏈II為修飾雙硫鍵及生物素分子的DNA引物單鏈，其序列如SEQ ID NO.4所示，具體如下：

TTT TTT TTT TTT TTT-/HS-SH/-TTT-Bio；(SEQ ID NO.4)

步驟(2)中，鏈霉親和素磁珠與DNA引物單鏈II混合反應(yīng)的溫度為25℃，反應(yīng)時間為1h。

本發(fā)明的第二方面，提供上述多功能磁性DNA納米球在制備檢測細胞內(nèi)巰基化合物的試劑中的應(yīng)用和/或制備靶向給藥系統(tǒng)中的應(yīng)用。

本發(fā)明的有益效果：

(1)本發(fā)明通過一條磷酸化的線性DNA模板單鏈和一條DNA引物單鏈(SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示)即可完成納米球的組裝；在組裝納米球的過程中，通過對另一條DNA引物單鏈(SEQ ID NO.4所示)進行不同的修飾以及對磷酸化的線性DNA模板單鏈進行結(jié)構(gòu)設(shè)計，可以在納米球結(jié)構(gòu)中組裝多種功能基團，如：在DNA引物單鏈上修飾生物素，使其可以與修飾有親和素的磁珠相結(jié)合，賦予DNA納米球以磁性，方便進行分離；通過在DNA引物單鏈上修飾雙硫鍵，可以對細胞內(nèi)的巰基化合物進行檢測；通過在磷酸化的線性DNA模板單鏈中設(shè)計sgc8序列，可以實現(xiàn)對CEM細胞的靶向識別并給藥。

(2)本發(fā)明的磁性DNA納米球具有多種功能，既能作為靶向給藥的運輸載體，還可以對胞內(nèi)的巰基化合物進行檢測，檢測特異性強，選擇性高，而且分離操作簡單，靶向輸送藥物的毒性小。

附圖說明

構(gòu)成本申請的一部分的說明書附圖用來提供對本申請的進一步理解，本申請的示意性實施例及其說明用于解釋本申請，并不構(gòu)成對本申請的不當限定。

圖1：DNA納米球電泳圖；圖中，泳道1為DNA引物單鏈與線性DNA模板單鏈雜交；泳道2為線性DNA模板單鏈；泳道3為DNA納米球。

圖2：DNA納米球(DNA-SP)的透射電鏡圖。

圖3：紫外吸收圖；圖中，a為DNA，b為磁珠，c為MNP/DNA-SP。

圖4：A為磁珠透射電鏡圖及能量色散X射線光譜圖；B為磁性DNA納米球(MNP/DNA-SP)的透射電鏡圖及能量色散X射線光譜圖。

圖5：磁珠與磁性DNA納米球(MNP/DNA-SP)的zeta電位圖。

圖6：磁珠與磁性DNA納米球(MNP/DNA-SP)的磁滯曲線，圖中，a為磁珠，b為磁性DNA納米球(MNP/DNA-SP)。

圖7：激光共聚焦圖；圖中，(A)紅色為與磁珠結(jié)合的納米球搭載了DOX后所發(fā)熒光，綠色為不含磁珠的納米球與syber green染料結(jié)合后所發(fā)熒光；(B)在磁性分離之后，只剩下綠色的未含磁珠的納米球，由此說明磁性分離可很好的實現(xiàn)對所需樣品的分離；由于將激光共聚焦圖調(diào)整成黑白圖后，紅色和綠色熒光無法再通過顏色進行區(qū)分，本發(fā)明將其中幾個與磁珠結(jié)合的納米球搭載DOX后所發(fā)的紅色熒光點用白色圓圈做了示意性的標注，用于區(qū)分。

圖8：MNP/DS-SP與DOX進行結(jié)合，并進行磁性分離的示意圖。

圖9：NEM實驗結(jié)果。

圖10：熒光強度圖及標準曲線。

圖11：細胞毒性實驗圖。

圖12：靶向藥物輸送流式細胞圖。

具體實施方式

應(yīng)該指出，以下詳細說明都是例示性的，旨在對本申請?zhí)峁┻M一步的說明。除非另有指明，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本申請所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的相同含義。

需要注意的是，這里所使用的術(shù)語僅是為了描述具體實施方式，而非意圖限制根據(jù)本申請的示例性實施方式。如在這里所使用的，除非上下文另外明確指出，否則單數(shù)形式也意圖包括復(fù)數(shù)形式，此外，還應(yīng)當理解的是，當在本說明書中使用術(shù)語“包含”和/或“包括”時，其指明存在特征、步驟、操作、器件、組件和/或它們的組合。

術(shù)語說明：

DNA-SP：DNA納米球。

MNP/DNA-SP：指結(jié)合了磁珠的DNA納米球。

MNP/DS-SP：指含雙硫鍵的結(jié)合磁珠的DNA納米球。

MNP/sgc8-SP：指含適配體的結(jié)合磁珠的DNA納米球。

DOX：指抗癌藥物阿霉素。

MNPs：指鏈霉親和素磁珠。

GSH：指谷胱甘肽。

正如背景技術(shù)中所介紹的，目前對于DNA納米球的研究較少，特別是能夠特異性識別靶細胞，作為靶向藥物輸送的載體，同時還能檢測細胞內(nèi)的谷胱甘肽的多功能DNA納米球目前尚未見報道?；诖?，本申請?zhí)岢隽艘环N多功能磁性DNA納米球及其制備方法。

在本申請的一種實施方案中，提供了一種結(jié)合有磁珠的DNA納米球(MNP/DNA-SP)，該結(jié)合有磁珠的DNA納米球由如下方法制備而成：

(1)構(gòu)建反應(yīng)體系，進行DNA鏈的環(huán)化和連接，得到結(jié)合了磁珠的環(huán)狀DNA；所述反應(yīng)體系包括：磷酸化的線性DNA模板單鏈、DNA引物單鏈I、T₄DNA連接酶、D-PBS溶液和磁珠(MNPs)溶液；

(2)將結(jié)合了磁珠的環(huán)狀DNA與phi29DNA聚合酶和dNTP溶液混合，進行滾環(huán)復(fù)制反應(yīng)，即得結(jié)合有磁珠的DNA納米球(MNP/DNA-SP)。

所述磷酸化的線性DNA模板單鏈的序列如SEQ ID NO.1所示，具體如下：

Phosphate-TTC CCG GCG GCG CAG CAG TTA GAT GCT GCT GCA GCG ATA CGC GTA TCG CTA TGG CAT ATC GTA CGA TAT GCC GCAGCAGCA TCT AAC CGT ACA GTA TT；(SEQ ID NO.1)其中，斜體標注的區(qū)域為sgc8序列，即CEM細胞的核酸適配體序列。本申請的磷酸化的線性DNA模板單鏈具有sgc8核酸適配體互補序列，能夠靶向識別CEM細胞，因而多功能磁性DNA納米球作為藥物運輸系統(tǒng)還具有靶向識別作用；

所述DNA引物單鏈I與磷酸化的線性DNA模板單鏈部分互補。作為優(yōu)選的方案，所述DNA引物單鏈I為多聚(T)DNA引物單鏈或修飾生物素分子的DNA引物單鏈。其中：

多聚(T)DNA引物單鏈的序列如SEQ ID NO.2所示，具體如下：

AAA AAA AAA AAA AAA TCT AAC TGC TGC GCC GCC GGG AAA ATA CTG TAC GGT TAG ATG CTG CTG C；(SEQ ID NO.2)。為避免在形成納米球的過程中出現(xiàn)空間位阻，本申請在設(shè)計DNA引物單鏈時進行了特殊的考慮，在末端修飾有多個A堿基。

修飾生物素分子的DNA引物單鏈的序列如SEQ ID NO.3所示，具體如下：

Bio-TCT AAC TGC TGC GCC GCC GGG AAA ATA CTG TAC GGT TAG ATG CTG CTG C；(SEQ ID NO.3)。修飾有生物素分子的DNA引物單鏈能夠修飾有鏈霉親和素的磁珠相結(jié)合，通過使用磁力架進行磁性分離即可實現(xiàn)生物分離。

在本申請的另一種實施方案中，提供了一種含雙硫鍵的結(jié)合磁珠的DNA納米球(MNP/DS-SP)，該MNP/DS-SP由如下方法制備而成：

(1)構(gòu)建反應(yīng)體系，進行DNA鏈的環(huán)化和滾環(huán)擴增反應(yīng)，得到滾環(huán)擴增產(chǎn)物；所述反應(yīng)體系包括：磷酸化的線性DNA模板單鏈、DNA引物單鏈I、T₄DNA連接酶、D-PBS溶液、phi29DNA聚合酶和dNTPs；

(2)將鏈霉親和素磁珠與DNA引物單鏈II混合反應(yīng)，然后與滾環(huán)擴增產(chǎn)物反應(yīng)形成含雙硫鍵的結(jié)合磁珠的DNA納米球。

步驟(1)中，所述磷酸化的線性DNA模板單鏈的序列如SEQ ID NO.1所示。

步驟(1)中，所述DNA引物單鏈I與磷酸化的線性DNA模板單鏈部分互補。作為優(yōu)選的方案，所述DNA引物單鏈I為多聚(T)DNA引物單鏈或修飾生物素分子的DNA引物單鏈。其中：

多聚(T)DNA引物單鏈的序列如SEQ ID NO.2所示；修飾生物素分子的DNA引物單鏈的序列如SEQ ID NO.3所示。

步驟(2)中，所述DNA引物單鏈II為修飾雙硫鍵及生物素分子的DNA引物單鏈，其序列如SEQ ID NO.4所示，具體如下：

TTT TTT TTT TTT TTT-/HS-SH/-TTT-Bio；(SEQ ID NO.4)。

本申請上述方案構(gòu)建的MNP/DNA-SP，包含了預(yù)設(shè)定的一條DNA線性長鏈，阿霉素(DOX)作為一種抗癌常用藥，可嵌入該DNA線性長鏈的GC互補的堿基對之間，從而DNA納米球可作為生物相容性的運輸系統(tǒng)，通過細胞的胞吞作用，攜帶DOX進入癌細胞中，并在癌細胞中緩慢釋放出DOX；另外，磷酸化的線性DNA模板單鏈具有sgc8核酸適配體互補序列，能夠靶向識別CEM細胞，因而多功能磁性DNA納米球作為藥物運輸系統(tǒng)還具有靶向識別作用；此外，該多功能磁性DNA納米球作為藥物運輸系統(tǒng)，通過DNA引物單鏈上修飾的生物素和修飾有鏈霉親和素的磁珠相結(jié)合，通過使用磁力架進行磁性分離即可實現(xiàn)生物分離。

進一步的，為同時實現(xiàn)作為藥物靶向運輸?shù)妮d體和檢測細胞內(nèi)巰基化合物檢測的功能，本申請的另一實施方案中構(gòu)建的MNP/DS-SP，將DNA引物單鏈優(yōu)化為修飾雙硫鍵及生物素分子的DNA引物單鏈，進而制備得到多功能磁性DNA納米球。

當環(huán)境中存在巰基化合物時，多功能磁性DNA納米球中的雙硫鍵即被打斷，經(jīng)磁性分離后，DOX將被釋放出，從而進行熒光檢測，根據(jù)測定的熒光強度，可以對環(huán)境中的巰基化合物進行定性和定量。

為了使得本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠更加清楚地了解本申請的技術(shù)方案，以下將結(jié)合具體的實施例詳細說明本申請的技術(shù)方案。

本發(fā)明實施例中所用的試驗材料均為本領(lǐng)域常規(guī)的試驗材料，均可通過商業(yè)渠道購買得到。

實施例1：DNA-SP的合成

將0.6μL磷酸化的線性模板鏈(濃度為100μM)溶于97.7μL D-PBS溶液(pH為7.4)，混合液置于PCR儀中，95攝氏度下反應(yīng)2min，之后以每分鐘降溫0.4攝氏度的速度緩慢降溫至55攝氏度，然后加入1.2μL多聚(T)DNA引物單鏈(濃度為100μM；序列如SEQ ID NO.2所示)，繼續(xù)以每分鐘降溫0.4攝氏度的速度緩慢降溫至25攝氏度，完成退火過程，之后加入0.5μL T₄DNA連接酶，混合均勻后于25攝氏度下反應(yīng)4h。

接下來進行滾環(huán)擴增過程，向上述反應(yīng)溶液中加入40μL phi29DNA聚合酶(濃度為10U/μL)，40μL dNTPs(濃度為10mM)，及10μL D-PBS溶液(pH為7.4)，混合均勻后置于30攝氏度下反應(yīng)10h，最后反應(yīng)體系置于65攝氏度下加熱10min停止反應(yīng)，即得到DNA-SP。

將本實施例制備的DNA-SP分別進行電泳和透射電鏡掃描，電泳結(jié)果如圖1所示，圖中，泳道1為DNA引物單鏈與線性DNA模板單鏈雜交；泳道2為線性DNA模板單鏈；泳道3為DNA納米球。分子量越大，亮帶越滯后，由此可見我們成功合成了DNA納米球。

透射電鏡掃描結(jié)果如圖2所示，由圖可以看出，DNA-SP的粒徑大約為40nm。

實施例2：MNP/DNA-SP的合成

將0.6μL磷酸化的線性模板鏈(濃度為100μM，序列如SEQ ID NO.1所示)溶于97.7μL D-PBS溶液(pH為7.4)，混合液置于PCR儀中，95攝氏度下反應(yīng)2min，之后以每分鐘降溫0.4攝氏度的速度緩慢降溫至55攝氏度；然后加入1.2μL DNA引物單鏈(濃度為100μM；該引物單鏈是指修飾生物素分子的DNA引物單鏈，序列如SEQ ID NO.3所示)，繼續(xù)以每分鐘降溫0.4攝氏度的速度緩慢降溫至25攝氏度，完成退火過程；之后加入0.5μL T₄DNA連接酶(2000U/μL)和10μL鏈霉親和素磁珠(10mg/ml)，混合均勻后于25攝氏度下反應(yīng)4h。

接下來進行滾環(huán)擴增過程，向上述反應(yīng)溶液中加入40μL phi29DNA聚合酶(濃度為10U/μL)，40μL dNTPs(濃度為10mM)，及10μL D-PBS溶液，混合均勻后置于30攝氏度下反應(yīng)10h，最后反應(yīng)體系置于65攝氏度下加熱10min停止反應(yīng)。最終所得產(chǎn)物用去離子水洗滌置于4攝氏度下儲存?zhèn)溆茫吹玫組NP/DNA-SP。

本實施例制備的MNP/DNA-SP的紫外吸收圖如圖3所示，由圖可以看出，與磁珠(b)相比較，DNA(a)在260nm處表現(xiàn)出明顯的吸收峰，而MNP/S-SP(c)在260nm處也有明顯的吸收峰，說明了磁珠與納米球的良好結(jié)合力。

本實施例制備的MNP/DNA-SP的透射電鏡圖及能量色散X射線光譜圖如圖4所示，圖中(B)顯示磁珠與納米球結(jié)合之后的粒徑大約為150nm，能量色散X射線光譜圖可對所含元素進行分析，如圖顯示，磁珠與DNA納米球結(jié)合之后，分析元素中明顯多了P元素，由此進一步說明了DNA納米球成功結(jié)合到了磁珠表面。

本實施例制備的MNP/DNA-SP的zeta電位圖如圖5所示，顯示與DNA納米球結(jié)合之后，磁珠表面的電位由-13mV降到-24mV，表明了兩者良好的結(jié)合性。

本實施例制備的MNP/DNA-SP的磁滯曲線如圖6所示，由圖可以看出，磁珠(a)的磁化強度大約為11.2emu/g，MNP/S-SP(b)的磁化強度約為9.3emu/g，數(shù)值降低的原因可能為磁珠表面包裹了一層DNA納米球。

實施例3：MNP/DS-SP的制備

將0.6μL磷酸化的線性模板鏈(濃度為100μM)溶于97.7μL D-PBS溶液(pH為7.4)，混合液置于PCR儀中，95攝氏度下反應(yīng)2min，之后以每分鐘降溫0.4攝氏度的速度緩慢降溫至55攝氏度，然后加入1.2μL多聚(T)DNA引物單鏈(濃度為100μM；序列如SEQ ID NO.2所示)，繼續(xù)以每分鐘降溫0.4攝氏度的速度緩慢降溫至25攝氏度，完成退火過程，之后加入0.5μL T₄DNA連接酶，混合均勻后于25攝氏度下反應(yīng)4h。

接下來進行滾環(huán)擴增過程，向上述反應(yīng)溶液中加入40μL phi29DNA聚合酶(濃度為10U/μL)，40μL dNTPs(濃度為10mM)，及10μL D-PBS溶液(pH為7.4)，混合均勻后置于30攝氏度下反應(yīng)10h，最后反應(yīng)體系置于65攝氏度下加熱10min停止反應(yīng)。

10μL的鏈霉親和素磁珠與修飾雙硫鍵及生物素分子的DNA引物單鏈(濃度為100μM；該引物單鏈是指修飾雙硫鍵及生物素分子的DNA引物單鏈，序列如SEQ ID NO.4所示)混合后在25攝氏度下反應(yīng)1h，然后磁性分離下進行洗滌，滾環(huán)擴增產(chǎn)物用PBS溶液洗滌三次，然后與MNP/S-SD反應(yīng)形成MNP/DS-SP。洗滌后置于4攝氏度下備用。

應(yīng)用例1：抗癌藥物DOX的搭載

將1mM的DOX溶液分別與實施例2和實施例3制備的不同功能的DNA納米球混合，于25攝氏度下反應(yīng)24h，磁性分離去掉未結(jié)合的DOX。

實施例2磁珠結(jié)合的納米球與抗癌藥物DOX搭載后的激光共聚焦圖如圖7所示；圖中，(A)紅色為與磁珠結(jié)合的納米球搭載了DOX后所發(fā)熒光，綠色為不含磁珠的納米球與syber green染料結(jié)合后所發(fā)熒光；(B)在磁性分離之后，只剩下綠色的未含磁珠的納米球，由此說明磁性分離可很好的實現(xiàn)對所需樣品的分離。

實施例3所制備的MNP/DS-SP與DOX進行結(jié)合，并進行磁性分離的示意圖如圖8所示。

應(yīng)用例2：NEM實驗

為了驗證還原性硫醇與MNP/DS-SP之間的反應(yīng)，濃度為1.0mM的NEM(N-ethylmaleimide)與其反應(yīng)60min，然后加入MNP/DS-SP，檢測最終熒光強度。結(jié)果如圖9所示。

由圖9可以看出，NEM的加入，打斷了雙硫鍵，樣本中雙硫鍵的失去致使本方法信號較低，未加入NEM的樣本，信號依舊很強，說明本發(fā)法確實打斷了雙硫鍵，從而產(chǎn)生了熒光信號。

應(yīng)用例3：體外谷胱甘肽含量的測定

使用熒光儀測定熒光強度，圖10顯示了檢測不同濃度GSH標準樣品的熒光強度疊加圖，取595nm出熒光數(shù)值制成標準曲線，線性回歸方程為Y＝49.1X+77.3，Y表示相對熒光強度，X表示GSH濃度。對濃度為5.0×10^-9M的GSH進行11次平行試驗，測得相對標準偏差為3.5％。表現(xiàn)出較好的重復(fù)率。

應(yīng)用例4：Ramos細胞中谷胱甘肽含量的測定

1.0ml的數(shù)量為2.1×10⁵的細胞懸浮液于3500轉(zhuǎn)下離心5min，用冰PBS溶液洗滌兩次，然后重新懸于100μL PBS溶液中，用超聲波細胞粉碎機粉粹細胞30min得到細胞溶解產(chǎn)物，100μL GSH實際樣品及細胞溶解物與MNP/DS-SP(實施例3制備)溶液混合，然后在37攝氏度下孵育，磁力架磁性分離之后，上清液在25攝氏度下避光放置24h。

最終計算Ramos細胞中谷胱甘肽類物質(zhì)含量為～3.705fmol/cell，與報道相符合。為檢驗該方法的可行性，向細胞溶解物中加入不同濃度的谷胱甘肽標準溶液，進行重復(fù)率實驗。結(jié)果如表1所示。

表1：重復(fù)率試驗結(jié)果：

此結(jié)果表現(xiàn)出良好的可靠性。

應(yīng)用例5：細胞毒性實驗

如圖11A所示，不同體積倍數(shù)的不含DOX的DNA納米球與CEM細胞混合培養(yǎng)4h后，使用臺盼藍溶液對細胞進行染色3min，使用細胞計數(shù)板進行計數(shù)，估算細胞存活率。倍數(shù)增加磁性DNA納米球的量，細胞存活率均在90％左右，并未出現(xiàn)較大波動。說明在不含DOX的情況下，磁性DNA納米球?qū)毎亩拘苑浅Ｐ　?/p>

如圖11B所示，MNP/sgc8-SP與DOX結(jié)合之后，分別使用不同體積的樣品與CEM及Ramos混合孵育，使用臺盼藍進行染色，用細胞計數(shù)板進行計數(shù)并計算存活率。其中，CEM細胞表現(xiàn)出明顯的存活率降低，而Ramos細胞存活率雖然也呈現(xiàn)出下降趨勢，但明顯沒有CEM下降速度大，由此反應(yīng)出sgc8適配體對CEM的識別和靶向給藥作用。

如圖11C所示，游離態(tài)DOX對兩種細胞的損傷率呈現(xiàn)一致的水平，即純DOX藥物并不能靶向給藥，沒有選擇性。

綜上圖可知，本發(fā)明的磁性DNA納米球具有良好的生物相容性及選擇性。

應(yīng)用例6：靶向選擇性實驗

靶向藥物輸送流式細胞圖如圖12所示。圖中A表示搭載了藥物DOX的MNP/sgc8-SP可對CEM細胞進行特異性識別和藥物的靶向運輸，從而使得細胞顯示熒光，與純細胞(紅色)的峰相比，明顯向熒光強度變大的方向移動；圖中B為對比試驗，與(A)圖同樣操作的情況下，樣品與Ramos細胞進行孵育反應(yīng)，檢測峰并沒有出現(xiàn)如(A)圖所示較大的移動，微小的偏移可能是因為DOX微量釋放的誤差所致。由峰的位移對比可以看出其靶向選擇性。

以上所述僅為本申請的優(yōu)選實施例而已，并不用于限制本申請，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，本申請可以有各種更改和變化。凡在本申請的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應(yīng)包含在本申請的保護范圍之內(nèi)。

SEQUENCE LISTING

<110> 臨沂大學(xué)

<120> 一種多功能磁性DNA納米球及其制備方法與應(yīng)用

<130> 2017

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

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<211> 98

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

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<212> DNA

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<400> 4

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