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技術(shù)領(lǐng)域：
】本發(fā)明涉及一種肺炎克雷伯菌三重qpcr方法，尤其涉及一種建立快速檢測呼吸道樣本中肺炎克雷伯菌三重qpcr方法。
背景技術(shù)：
：肺炎克雷伯菌(klebsiellapneumoniae)是呼吸道感染的病原菌之一，可引起較嚴重的下呼吸道感染甚至死亡，其臨床癥狀與其他細菌感染并無兩樣，臨床難以針對該菌精準(zhǔn)治療。近年來，由于無法早期精準(zhǔn)治療，其耐藥問題日益突出，嚴重影響了治療效果[1-2]。培養(yǎng)法是目前常用的檢測方法，也是金標(biāo)準(zhǔn)，一般需要2-3天，甚至更久，其時效性、簡便性、靈敏度等均無法滿足臨床快速精準(zhǔn)診斷的需求[3]。實時熒光定量pcr(realtimequantitativepcr，qpcr)通過檢測遺傳物質(zhì)(dna和/或rna)，且快速、簡便、靈敏度高，在病原微生物檢測方面迅速發(fā)展，已成為金標(biāo)準(zhǔn)方法的重要補充[4-6]。比如，李明等于2011年公布了主要由：正向引物：5’-gcgcgcacctattgtgttg-3’、反向引物：5’–tcgctgtgcttgtcatcctt-3’和探針：5’-ccgtctacacccgggcgcc-3’組成的“肺炎克雷伯菌核酸檢測試劑盒”應(yīng)用于肺炎克雷伯菌感染的輔助診斷；2015年，江蘇和創(chuàng)生物科技有限公司公布了主要由p1：5’-cctgcatcagactgtccagta-3’、p2：5’-ccatctcggtacagtttc-3’和probe：5’-cagcgtaataacgtagggcgtgtagc-3’組成的“肺炎克雷伯菌熒光pcr檢測試劑盒”用于疾病監(jiān)測、臨床診斷等領(lǐng)域。然而，由于生物進化，遺傳物質(zhì)既保守又變異，不同科屬細菌間有相同序列，同科屬間也有序列插入、缺失及點突變，所以細菌也象人種一樣，不同地區(qū)流行分布著不同種群或型別。這就要求設(shè)計pcr關(guān)鍵組份的引物、探針必須高度特異并適于當(dāng)?shù)夭拍鼙ＷC精準(zhǔn)診斷。從兩項公布資料發(fā)現(xiàn)他們只檢測單基因，且均未對我國流行分布的肺炎克雷伯菌相關(guān)基因進行測序比對，僅根據(jù)ncbi或文獻資料來設(shè)計引物和探針，由于生物進化、地區(qū)分布不同等原因，可能存在靈敏度不夠或特異性不強的致命缺點。高比例的假陰性和假陽性，將給臨床帶來誤診和/或誤治等嚴重問題。發(fā)明人用李明等的引物和探針序列在ncbi數(shù)據(jù)庫(www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast)進行blast和模擬pcr，正、反向引物共檢索出427條序列，其中，肺炎克雷伯菌261條，除此之外還包括：大腸桿菌(escherichiacoli)、產(chǎn)酸克雷伯菌(klebsiellaoxytoca)、鮑曼不動桿菌(acinetobacterbaumannii)、陰溝腸桿菌(enterobactercloacae)、產(chǎn)氣腸桿菌(enterobacteraerogenes)、泛菌屬(pantoea)、解鳥氨酸拉烏爾菌(raoultellaornithinolytica)、粘質(zhì)沙雷菌(serratiamarcescens)、銅綠假單胞菌(pseudomonasaeruginosa)、嗜水氣單胞菌(aeromonashydrophila)、奇異變形桿菌(proteusmirabilis)、弗氏檸檬酸桿菌(citrobacterfreundii)、霍爾曼腸桿菌(enterobacterhormaechei)、生癌腸桿菌(enterobactercancerogenus)、沙門氏菌(salmonellaenterica)共15屬166條序列。用反向引物和探針共檢索出428條序列，除261條肺炎克雷伯菌外，同樣包括前述15屬167條序列。由此可見，如用這些引物和探針檢測，理論上有多達16種細菌被檢測出來，其特異性非常有限，將出現(xiàn)大量假陽性。發(fā)明人用江蘇和創(chuàng)生物科技有限公司公布的引物和探針序列在ncbi數(shù)據(jù)庫進行blast和模擬pcr，用p1和p2、p1和探針、p2和探針均未檢索到任何序列，改用p1、p2和探針單獨blast，也未檢索到肺炎克雷伯菌的任何序列。顯然，由這些引物和探針組成的試劑盒將檢測不出肺炎克雷伯菌。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明目的在于解決現(xiàn)有的呼吸道樣本中肺炎克雷伯菌三重qpcr方法及試劑，只檢測單基因，且均未對我國流行分布的肺炎克雷伯菌相關(guān)基因進行測序比對，僅根據(jù)ncbi或文獻資料來設(shè)計引物和探針，由于生物進化、地區(qū)分布不同等原因，可能存在靈敏度不夠或特異性不強的致命缺點，高比例的假陰性和假陽性，將給臨床帶來誤診和/或誤治等嚴重問題的不足而提供的一種新型建立快速檢測呼吸道樣本中肺炎克雷伯菌三重qpcr方法。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的：一種建立快速檢測呼吸道樣本中肺炎克雷伯菌三重qpcr方法，包括如下步驟：(1)臨床呼吸道樣本采集和選?。禾狄簶颖静捎梦祷蛏羁确?，留取于無菌痰培養(yǎng)瓶內(nèi)，經(jīng)涂片革蘭氏染色鏡檢，白細胞>25個/hp，鱗狀上皮細胞<1o個/hp判為合格，否則棄用；肺泡灌洗液直接注入無菌痰培養(yǎng)瓶內(nèi)，共收集合格樣本2754例；(2)細菌培養(yǎng)與鑒定：將合格的痰液或肺泡灌洗液接種于血平板和麥康凱平板，置于35℃的co2孵化箱內(nèi)，培養(yǎng)24-48小時；挑取灰白色、大而粘稠、有拉絲的可疑菌落，進行革蘭氏染色、氧化酶和觸酶試驗，革蘭氏陰性桿菌，氧化酶陰性和觸酶陽性，再用細菌生化鑒定儀和基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜儀及配套試劑進行雙鑒定，兩種鑒定方法均報告為肺炎克雷伯菌的方法作為實驗用菌株，從2754例樣本中共分離到355株肺炎克雷伯菌；(3)核酸提取與純化：①痰液細菌基因組核酸提取與純化：在痰液收集瓶中加入1-2倍體積痰液液化殺菌劑，漩渦振蕩5分鐘，吸取液化痰液100ul用核酸提取儀及配套試劑，上機提取純化細菌基因組核酸；②肺泡灌洗液細菌基因組核酸提?。褐苯尤》闻莨嘞匆?00ul同痰液一樣上機提取純化；③培養(yǎng)細菌基因組核酸提取：挑取純培養(yǎng)菌落用生理鹽水調(diào)成0.5mcf菌懸液，吸菌懸液100ul同痰液一樣上機提取純化；④將上述①、②、③提取純化后的核酸吸入無酶ep管，凍存于-86℃冰箱備用；(4)質(zhì)控/內(nèi)標(biāo)質(zhì)粒構(gòu)建：用dnamn軟件生成一段1000bp隨機dna序列，其中a、t、c、g四種堿基各占25％，插入pbsk載體構(gòu)建質(zhì)粒并提取質(zhì)粒核酸；(5)測序引物設(shè)計與合成：從genbank數(shù)據(jù)庫下載肺炎克雷伯氏菌rcsa和23srrna基因序列各50條，用dnamn比對軟件分別進行比對，避開變異區(qū)或突變點后，用primer5設(shè)計rcsa、23srrna基因和質(zhì)控/內(nèi)標(biāo)質(zhì)粒測序引物；(6)臨床分離株高保真體系優(yōu)化、擴增及結(jié)果判斷：經(jīng)優(yōu)化，高保真pcr反應(yīng)體系為25.0μl，包括2×buffer12.5ul、dntpmix(10mmeach)0.5μl、10μm引物各0.5μl、53倍高保真熱啟動dna聚合酶(1u/ul)0.5μl、50×evagreen0.5ul、模板5.0μl，加無菌雙蒸水至終體系25.0μl；pcr擴增采用3步法，參數(shù)為：95℃2分鐘；95℃10秒，59℃10秒，72℃30秒，30個循環(huán)，選擇fam通道于延伸階段探測熒光，以含模板的擴增曲線呈“s”形，ct值≤21，擴增曲線與基線夾角≥30°，且不含模板的擴增曲線與基線平行，判為擴增良好，用該方法高保真擴增94株經(jīng)步驟(2)所述方法確定為肺炎克雷伯菌的臨床分離株rcsa和23srrna基因及質(zhì)控/內(nèi)標(biāo)質(zhì)粒；(7)高保真pcr產(chǎn)物測序與質(zhì)控：將步驟(6)擴增良好的高保真pcr產(chǎn)物進行測序，以質(zhì)控/內(nèi)標(biāo)質(zhì)粒測序結(jié)果與步驟(4)所述序列100％符合方接受臨床分離株測序結(jié)果；(8)三重qpcr引物、探針設(shè)計與合成標(biāo)記：根據(jù)步驟(7)的測序分析比對結(jié)果，避開變異區(qū)或突變點后，用primer5設(shè)計肺炎克雷伯菌rcsa和23srrna基因及質(zhì)控/內(nèi)標(biāo)質(zhì)粒引物和探針；(9)三重qpcr體系優(yōu)化、擴增及結(jié)果判斷：經(jīng)優(yōu)化后，三重qpcr反應(yīng)體系為40.0μl，包括10×buffer4.0ul、dntpmix(10mmeach)0.8μl、10μm引物各1.2μl、10μm探針各0.4μl、化學(xué)修飾熱啟動dna聚合酶(1u/ul)0.5μl、抗體熱啟動dna聚合酶(1u/ul)0.5μl、50copies/ul質(zhì)控/內(nèi)標(biāo)質(zhì)粒0.1μl，模板20.0μl，加無菌雙蒸水至終體系40.0μl；qpcr擴增采用兩步法，參數(shù)為：95℃2分鐘；95℃10秒，60℃30秒，40個循環(huán)，選擇fam、vic和rox三通道于退火延伸階段探測熒光，以三個通道擴增曲線均呈“s”形，ct值均≤36，擴增曲線與基線夾角均≥30°判為陽性，否則判為陰性。進一步地，步驟(9)之后還包括三重qpcr體系性能評價試驗，所述三重qpcr體系性能評價試驗為：(1)檢測下限試驗與判斷：挑取對數(shù)生長期純培養(yǎng)菌落用生理鹽水調(diào)成約2.0×108cfu/ml，經(jīng)平板菌落計數(shù)法確定濃度后稀釋至1.0×108cfu/ml，10倍連續(xù)稀釋成8個梯度濃度菌懸液，提取純化核酸后，按步驟(9)所述方法和標(biāo)準(zhǔn)上機擴增及結(jié)果判斷，以能判陽的最低加入模板數(shù)作為檢測下限；(2)檢測靈敏度試驗與計算：提取純化95株經(jīng)步驟(2)所述方法確定為肺炎克雷伯菌的菌懸液核酸，按步驟(9)所述方法和標(biāo)準(zhǔn)上機擴增并判斷結(jié)果；檢測靈敏度＝陽性數(shù)÷95×100％；(3)檢測特異性試驗：提取純化95株經(jīng)步驟(2)所述方法確定為非肺炎克雷伯菌的其他呼吸道常見感染菌菌懸液核酸，按步驟(9)所述方法和標(biāo)準(zhǔn)上機擴增并判斷結(jié)果；檢測特異性＝陰性數(shù)÷95×100％；(4)真陽性、真陰性判斷與驗證；真陽性：①培養(yǎng)鑒定為肺炎克雷伯菌；②培養(yǎng)法陰性，按步驟(9)所述方法陽性，經(jīng)步驟(6)和步驟(7)方法高保真擴增測序與肺炎克雷伯菌atcc700603標(biāo)株兩基因的相同片段同源性≥90％；真陰性：①培養(yǎng)及qpcr兩種檢測方法均為陰性；②qpcr檢測陽性，但經(jīng)步驟(6)和步驟(7)方法高保真擴增測序與標(biāo)株相同片段同源性<90％；(5)診斷靈敏度、特異性試驗與計算：將合格的若干份臨床呼吸道樣本按步驟(9)所述方法和標(biāo)準(zhǔn)上機擴增并判斷結(jié)果，結(jié)果與培養(yǎng)法不一致時，按檢測實驗步驟(4)方式處理和判斷；診斷靈敏度＝真陽性數(shù)÷(真陽性數(shù)+假陰性數(shù))；診斷特異性＝真陰性數(shù)÷(真陰性數(shù)+假陽性數(shù))×100％。進一步地，所述步驟(4)質(zhì)控/內(nèi)標(biāo)質(zhì)粒構(gòu)建：用dnamn軟件生成一段1000bp隨機dna序列，其中a、t、c、g四種堿基各占25％，插入pbsk載體構(gòu)建質(zhì)粒并提取質(zhì)粒核酸；其序列如下：ttccgcccacgggtagagacaaaccgacttaattgtcatagatgctaatgttcctgcctaacctggacaattattccttccacggttggtggatgcaagttcatgaacgttggtactccccagagcagacgaatagagcctgtagtcgttgatgaaccaatagctggaggacgatagtgggcgcctggacgtcgattatcacccgctatgagctgacggtgagctggttacagcctatgcatcgcgccctaggacgattaacgttattacacgcggtttggttgagctgtcccgcagcgggtagtgccagcagacgacagactagatatttgctagtctcaagagtctggaaggatccgtcagcatcctcgcatcaagcaagcagcattagacagcccagtacgacaccaagacgaaggcgtccgagcgtatagcattctctagagcccgctaaggcacttttctggtctatttgaaactacgaccggggcgtttggctgggcatcacctaagtgacaaacagaatggctcaccagtcctcctccctggtaaaagtgctaacgaatttcgcttagaagtgacggtcatgcggaaacctaaacgagccaatggtcttacgatcccttttggagcctatgttcgcctaatggtggactcgatggctgtaccgatcaaagcttaggaattagaccacacggtaaacaagatcgagaacaggccaactatggactggcaattggcgtgggtaacaattggagcttctagagttagaagcgcatggtgtttctcgaggaccggtctcacaatttgaagacgacgtcgcgccaaggtcccacttcaacctttccgggactgtattacatataataacaccctattcatgctcgaaagacctgagactcgtctatcggtttcggcaccccttcccggggcaaatatcccagctgtgctggtactccacccgagcaactacatcatattgtcttgactcggctgcact；進一步地，所述步驟(5)測序引物設(shè)計與合成：從genbank數(shù)據(jù)庫下載肺炎克雷伯氏菌rcsa和23srrna基因序列各50條，用dnamn比對軟件分別進行比對，避開變異區(qū)或突變點后，用primer5設(shè)計rcsa、23srrna基因和質(zhì)控/內(nèi)標(biāo)質(zhì)粒測序引物；rcsa和23srrna基因及質(zhì)控/內(nèi)標(biāo)質(zhì)粒測序引物表；進一步地，所述步驟(8)三重qpcr引物、探針設(shè)計與合成標(biāo)記：根據(jù)步驟(7)的測序分析比對結(jié)果，避開變異區(qū)或突變點后，用primer5設(shè)計肺炎克雷伯菌rcsa和23srrna基因及質(zhì)控/內(nèi)標(biāo)質(zhì)粒引物和探針；rcsa和23srrna基因及質(zhì)控/內(nèi)標(biāo)三重qpcr引物、探針表；名稱序列(5'to3')5'修飾3'修飾rcsa上游引物ggcaacacgacgtacagt無無rcsa下游引物ggttgggattgacgggatat無無rcsa探針agatccgcagcactgttgacctcafamhbq123srrna上游引物cacaggtggtcaggtagagaatac無無23srrna下游引物ctggtctcagctccatccg無無23srrna探針accagcgtgccttctcccgavichbq1質(zhì)控/內(nèi)標(biāo)質(zhì)粒上游引物gctagtctcaagagtctggaag無無質(zhì)控/內(nèi)標(biāo)質(zhì)粒下游引物ctgggctgtctaatgctgc無無質(zhì)控/內(nèi)標(biāo)質(zhì)粒探針ccgtcagcatcctcgcatcaagcaroxhbq2進一步地，所述步驟(3)中的①痰液細菌基因組核酸提取與純化：在痰液收集瓶中加入1-2倍體積痰液液化殺菌劑內(nèi)含n-乙酰-l-半胱氨酸1.0％、二硫蘇糖醇0.25％、naoh1.0％、苯扎溴銨0.20％、edta10mmol/l。本發(fā)明的有益效果在于：(1)簡便、快速、靈敏度高、特異性好、成本低，三重qpcr同時檢測肺炎克雷伯菌rcsa和23srrna基因兩個持家基因，并含質(zhì)控/內(nèi)標(biāo)用于監(jiān)測試劑質(zhì)量，所用引物和探針是根據(jù)我國流行分布株基因測序結(jié)果有效避開變異區(qū)或突變點設(shè)計而成，其性能已達到：檢測下限低至2cfu/pcr，檢測靈敏度100％(95/95),檢測特異性98.9％(94/95)；診斷靈敏度98.6％(430/436)，診斷特異性96.2％(2229/2318)，有效提高了診斷靈敏度和特異性，比既往單基因檢測產(chǎn)品大幅提高了診斷準(zhǔn)確性；比既往產(chǎn)品縮短時間近一半；特別是其引物、探針依據(jù)我國臨床分離株測序結(jié)果而設(shè)計，有效消除了地區(qū)分區(qū)差異的影響，特別適用于我國人群呼吸道肺炎克雷伯氏菌感染精準(zhǔn)診斷，為早期精準(zhǔn)治療贏得時間；同時，能利用質(zhì)控/內(nèi)標(biāo)質(zhì)粒擴增曲線監(jiān)測pcr體系是否失效變質(zhì)；(2)痰液快速液化及去生物危害：痰液中加入1-2倍體積痰液液化殺菌劑，漩渦振蕩2-5分鐘即可完全液化，比既往痰液液化劑縮短時間近6倍，且能殺死痰液中致病微生物，保護操作者不被感染；(3)質(zhì)控/內(nèi)標(biāo)質(zhì)粒構(gòu)建方法：序列中堿基隨機分布，與已公布的人、動物、微生物基因和/基因組序列同源性＜0.5％，4種堿基比例各點25％，長度為1000bp，其載體含t7rna多聚酶啟動子，可體外轉(zhuǎn)錄成rna；(4)肺炎克雷伯菌rcsa和23srrna基因片段高保真擴增及質(zhì)控方法與試劑：不用開蓋跑電泳即可判斷擴增是否良好，比既往的高保真擴增產(chǎn)物需跑電泳才能判斷擴增是否成功的方法相比，縮短時間近一個小時，且能有效防止實驗室的pcr產(chǎn)物污染；保真度達到taqdna聚合酶的53倍，且可利用質(zhì)控質(zhì)粒監(jiān)測pcr擴增的保真性?！靖綀D說明】圖1為本發(fā)明建立快速檢測呼吸道樣本中肺炎克雷伯菌三重qpcr方法的路線圖；圖2為本發(fā)明高保真體系擴增肺炎克雷伯菌rcsa和23srrna基因熒光曲線圖；圖3為本發(fā)明三重qpcr擴增肺炎克雷伯菌梯度模板熒光曲線圖；圖4為本發(fā)明三重qpcr擴增肺炎克雷伯菌培養(yǎng)陽性的呼吸道樣本熒光曲線圖；【具體實施方式】下面結(jié)合附圖及具體實施方式對本發(fā)明做進一步描述：如圖1、圖2、圖3、圖4所示：一種建立快速檢測呼吸道樣本中肺炎克雷伯菌三重qpcr方法，包括如下步驟：(1)臨床呼吸道樣本采集和選?。禾狄簶颖静捎梦祷蛏羁确ǎ羧∮跓o菌痰培養(yǎng)瓶內(nèi)，經(jīng)涂片革蘭氏染色鏡檢，白細胞>25個/hp，鱗狀上皮細胞<1o個/hp判為合格，否則棄用；肺泡灌洗液直接注入無菌痰培養(yǎng)瓶內(nèi)，共收集合格樣本2754例；(2)細菌培養(yǎng)與鑒定：將合格的痰液或肺泡灌洗液接種于血平板和麥康凱平板，置于35℃的co2孵化箱內(nèi)，培養(yǎng)24-48小時；挑取灰白色、大而粘稠、有拉絲的可疑菌落，進行革蘭氏染色、氧化酶和觸酶試驗，革蘭氏陰性桿菌，氧化酶陰性和觸酶陽性，再用細菌生化鑒定儀和基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜儀及配套試劑進行雙鑒定，兩種鑒定方法均報告為肺炎克雷伯菌的方法作為實驗用菌株，從2754例樣本中共分離到355株肺炎克雷伯菌；(3)核酸提取與純化：①痰液細菌基因組核酸提取與純化：在痰液收集瓶中加入1-2倍體積痰液液化殺菌劑，漩渦振蕩5分鐘，吸取液化痰液100ul用核酸提取儀及配套試劑，上機提取純化細菌基因組核酸；②肺泡灌洗液細菌基因組核酸提?。褐苯尤》闻莨嘞匆?00ul同痰液一樣上機提取純化；③培養(yǎng)細菌基因組核酸提?。禾羧〖兣囵B(yǎng)菌落用生理鹽水調(diào)成0.5mcf菌懸液，吸菌懸液100ul同痰液一樣上機提取純化；④將上述①、②、③提取純化后的核酸吸入無酶ep管，凍存于-86℃冰箱備用；(4)質(zhì)控/內(nèi)標(biāo)質(zhì)粒構(gòu)建：用dnamn軟件生成一段1000bp隨機dna序列，其中a、t、c、g四種堿基各占25％，插入pbsk載體構(gòu)建質(zhì)粒并提取質(zhì)粒核酸；(5)測序引物設(shè)計與合成：從genbank數(shù)據(jù)庫下載肺炎克雷伯氏菌rcsa和23srrna基因序列各50條，用dnamn比對軟件分別進行比對，避開變異區(qū)或突變點后，用primer5設(shè)計rcsa、23srrna基因和質(zhì)控/內(nèi)標(biāo)質(zhì)粒測序引物；(6)臨床分離株高保真體系優(yōu)化、擴增及結(jié)果判斷：經(jīng)優(yōu)化，高保真pcr反應(yīng)體系為25.0μl，包括2×buffer12.5ul、dntpmix(10mmeach)0.5μl、10μm引物各0.5μl、53倍高保真熱啟動dna聚合酶(1u/ul)0.5μl、50×evagreen0.5ul、模板5.0μl，加無菌雙蒸水至終體系25.0μl；pcr擴增采用3步法，參數(shù)為：95℃2分鐘；95℃10秒，59℃10秒，72℃30秒，30個循環(huán)，選擇fam通道于延伸階段探測熒光，以含模板的擴增曲線呈“s”形，ct值≤21，擴增曲線與基線夾角≥30°，且不含模板的擴增曲線與基線平行，判為擴增良好，用該方法高保真擴增94株經(jīng)步驟(2)所述方法確定為肺炎克雷伯菌的臨床分離株rcsa和23srrna基因及質(zhì)控/內(nèi)標(biāo)質(zhì)粒；(7)高保真pcr產(chǎn)物測序與質(zhì)控：將步驟(6)擴增良好的高保真pcr產(chǎn)物進行測序，以質(zhì)控/內(nèi)標(biāo)質(zhì)粒測序結(jié)果與步驟(4)所述序列100％符合方接受臨床分離株測序結(jié)果；(8)三重qpcr引物、探針設(shè)計與合成標(biāo)記：根據(jù)步驟(7)的測序分析比對結(jié)果，避開變異區(qū)或突變點后，用primer5設(shè)計肺炎克雷伯菌rcsa和23srrna基因及質(zhì)控/內(nèi)標(biāo)質(zhì)粒引物和探針；(9)三重qpcr體系優(yōu)化、擴增及結(jié)果判斷：經(jīng)優(yōu)化后，三重qpcr反應(yīng)體系為40.0μl，包括10×buffer4.0ul、dntpmix(10mmeach)0.8μl、10μm引物各1.2μl、10μm探針各0.4μl、化學(xué)修飾熱啟動dna聚合酶(1u/ul)0.5μl、抗體熱啟動dna聚合酶(1u/ul)0.5μl、50copies/ul質(zhì)控/內(nèi)標(biāo)質(zhì)粒0.1μl，模板20.0μl，加無菌雙蒸水至終體系40.0μl；qpcr擴增采用兩步法，參數(shù)為：95℃2分鐘；95℃10秒，60℃30秒，40個循環(huán)，選擇fam、vic和rox三通道于退火延伸階段探測熒光，以三個通道擴增曲線均呈“s”形，ct值均≤36，擴增曲線與基線夾角均≥30°判為陽性，否則判為陰性。進一步地，步驟(9)之后還包括三重qpcr體系性能評價試驗，所述三重qpcr體系性能評價試驗為：(1)檢測下限試驗與判斷：挑取對數(shù)生長期純培養(yǎng)菌落用生理鹽水調(diào)成約2.0×108cfu/ml，經(jīng)平板菌落計數(shù)法確定濃度后稀釋至1.0×108cfu/ml，10倍連續(xù)稀釋成8個梯度濃度菌懸液，提取純化核酸后，按步驟(9)所述方法和標(biāo)準(zhǔn)上機擴增及結(jié)果判斷，以能判陽的最低加入模板數(shù)作為檢測下限；(2)檢測靈敏度試驗與計算：提取純化95株經(jīng)步驟(2)所述方法確定為肺炎克雷伯菌的菌懸液核酸，按步驟(9)所述方法和標(biāo)準(zhǔn)上機擴增并判斷結(jié)果；檢測靈敏度＝陽性數(shù)÷95×100％；(3)檢測特異性試驗：提取純化95株經(jīng)步驟(2)所述方法確定為非肺炎克雷伯菌的其他呼吸道常見感染菌菌懸液核酸，按步驟(9)所述方法和標(biāo)準(zhǔn)上機擴增并判斷結(jié)果；檢測特異性＝陰性數(shù)÷95×100％；(4)真陽性、真陰性判斷與驗證；真陽性：①培養(yǎng)鑒定為肺炎克雷伯菌；②培養(yǎng)法陰性，按步驟(9)所述方法陽性，經(jīng)步驟(6)和步驟(7)方法高保真擴增測序與肺炎克雷伯菌atcc700603標(biāo)株兩基因的相同片段同源性≥90％；真陰性：①培養(yǎng)及qpcr兩種檢測方法均為陰性；②qpcr檢測陽性，但經(jīng)步驟(6)和步驟(7)方法高保真擴增測序與標(biāo)株相同片段同源性<90％；(5)診斷靈敏度、特異性試驗與計算：將合格的若干份臨床呼吸道樣本按步驟(9)所述方法和標(biāo)準(zhǔn)上機擴增并判斷結(jié)果，結(jié)果與培養(yǎng)法不一致時，按檢測實驗步驟(4)方式處理和判斷；診斷靈敏度＝真陽性數(shù)÷(真陽性數(shù)+假陰性數(shù))；診斷特異性＝真陰性數(shù)÷(真陰性數(shù)+假陽性數(shù))×100％。優(yōu)選地，所述步驟(4)質(zhì)控/內(nèi)標(biāo)質(zhì)粒構(gòu)建：用dnamn軟件生成一段1000bp隨機dna序列，其中a、t、c、g四種堿基各占25％，插入pbsk載體構(gòu)建質(zhì)粒并提取質(zhì)粒核酸；其序列如下：ttccgcccacgggtagagacaaaccgacttaattgtcatagatgctaatgttcctgcctaacctggacaattattccttccacggttggtggatgcaagttcatgaacgttggtactccccagagcagacgaatagagcctgtagtcgttgatgaaccaatagctggaggacgatagtgggcgcctggacgtcgattatcacccgctatgagctgacggtgagctggttacagcctatgcatcgcgccctaggacgattaacgttattacacgcggtttggttgagctgtcccgcagcgggtagtgccagcagacgacagactagatatttgctagtctcaagagtctggaaggatccgtcagcatcctcgcatcaagcaagcagcattagacagcccagtacgacaccaagacgaaggcgtccgagcgtatagcattctctagagcccgctaaggcacttttctggtctatttgaaactacgaccggggcgtttggctgggcatcacctaagtgacaaacagaatggctcaccagtcctcctccctggtaaaagtgctaacgaatttcgcttagaagtgacggtcatgcggaaacctaaacgagccaatggtcttacgatcccttttggagcctatgttcgcctaatggtggactcgatggctgtaccgatcaaagcttaggaattagaccacacggtaaacaagatcgagaacaggccaactatggactggcaattggcgtgggtaacaattggagcttctagagttagaagcgcatggtgtttctcgaggaccggtctcacaatttgaagacgacgtcgcgccaaggtcccacttcaacctttccgggactgtattacatataataacaccctattcatgctcgaaagacctgagactcgtctatcggtttcggcaccccttcccggggcaaatatcccagctgtgctggtactccacccgagcaactacatcatattgtcttgactcggctgcact；優(yōu)選地，所述步驟(5)測序引物設(shè)計與合成：從genbank數(shù)據(jù)庫下載肺炎克雷伯氏菌rcsa和23srrna基因序列各50條，用dnamn比對軟件分別進行比對，避開變異區(qū)或突變點后，用primer5設(shè)計rcsa、23srrna基因和質(zhì)控/內(nèi)標(biāo)質(zhì)粒測序引物；rcsa和23srrna基因及質(zhì)控/內(nèi)標(biāo)質(zhì)粒測序引物表；基因名稱上游引物序列(5'to3')下游引物序列(5'to3')rcsagccatccacatttgcagcatagcgttaagccttccacccc23srrnacaaggctgaggtgtgatgacgttacgctttgggaggagac質(zhì)控/內(nèi)標(biāo)質(zhì)粒acacgcggtttggttgaggcagccgagtcaagacaatatg進一步地，所述步驟(8)三重qpcr引物、探針設(shè)計與合成標(biāo)記：根據(jù)步驟(7)的測序分析比對結(jié)果，避開變異區(qū)或突變點后，用primer5設(shè)計肺炎克雷伯菌rcsa和23srrna基因及質(zhì)控/內(nèi)標(biāo)質(zhì)粒引物和探針；rcsa和23srrna基因及質(zhì)控/內(nèi)標(biāo)三重qpcr引物、探針表；名稱序列(5'to3')5'修飾3'修飾rcsa上游引物ggcaacacgacgtacagt無無rcsa下游引物ggttgggattgacgggatat無無rcsa探針agatccgcagcactgttgacctcafamhbq123srrna上游引物cacaggtggtcaggtagagaatac無無23srrna下游引物ctggtctcagctccatccg無無23srrna探針accagcgtgccttctcccgavichbq1質(zhì)控/內(nèi)標(biāo)質(zhì)粒上游引物gctagtctcaagagtctggaag無無質(zhì)控/內(nèi)標(biāo)質(zhì)粒下游引物ctgggctgtctaatgctgc無無質(zhì)控/內(nèi)標(biāo)質(zhì)粒探針ccgtcagcatcctcgcatcaagcaroxhbq2優(yōu)選地，所述步驟(3)中的①痰液細菌基因組核酸提取與純化：在痰液收集瓶中加入1-2倍體積痰液液化殺菌劑內(nèi)含n-乙酰-l-半胱氨酸1.0％、二硫蘇糖醇0.25％、naoh1.0％、苯扎溴銨0.20％、edta10mmol/l。根據(jù)上述說明書的揭示和教導(dǎo)，本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員還可以對上述實施方式進行適當(dāng)?shù)淖兏托薷摹Ｒ虼?，本發(fā)明并不局限于上面揭示和描述的具體實施方式，對本發(fā)明的一些修改和變更也應(yīng)當(dāng)落入本發(fā)明的權(quán)利要求的保護范圍內(nèi)。此外，盡管本說明書中使用了一些特定的術(shù)語，但這些術(shù)語只是為了方便說明，并不對本發(fā)明構(gòu)成任何限制。當(dāng)前第1頁12