本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種復(fù)制缺陷型人14型腺病毒載體及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

腺病毒(adenovirus，ad)是雙鏈dna病毒，其基因組長(zhǎng)度為34-38kb。目前報(bào)道的腺病毒有69個(gè)基因型，可分為a-g七個(gè)亞群。腺病毒不僅會(huì)引起無(wú)癥狀的感染，而且會(huì)誘發(fā)呼吸道疾病、眼部疾病和胃腸炎等。b亞群的3、7型和e亞群的4型腺病毒常誘發(fā)嚴(yán)重的呼吸道疾病。14型腺病毒自1955年從荷蘭軍隊(duì)中被首次發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)達(dá)半個(gè)世紀(jì)的時(shí)間里，并沒有引起嚴(yán)重的呼吸道疾病和大范圍的流行；然而，自2006年美國(guó)軍隊(duì)報(bào)道14型腺病毒出現(xiàn)后，14型腺病毒在美國(guó)頻繁的引起感染和死亡。隨后，在歐洲的愛爾蘭地區(qū)和北美的加拿大都出現(xiàn)的14型腺病毒引起的感染和死亡。2011年，我國(guó)甘肅一所中學(xué)中也爆發(fā)了14型腺病毒的感染。針對(duì)14型腺病毒的流行和高致病性，目前尚無(wú)用于預(yù)防、治療14型腺病毒感染的疫苗和藥物；因此，研發(fā)抗14型腺病毒的疫苗和藥物對(duì)人類健康具有重大意義。

自20世紀(jì)70年代，美軍中就開始使用腸衣包被的4型和7型腺病毒活疫苗，起到了很好的保護(hù)效果。由于4型和7型腺病毒疫苗起到了很好的預(yù)防效果，1996年停止了腺病毒疫苗的生產(chǎn)，到了1999年，庫(kù)存中的腺病毒疫苗使用殆盡，美軍中再次爆發(fā)了腺病毒感染引起的呼吸道疾病，不得不重新啟動(dòng)4型和7型腺病毒疫苗的生產(chǎn)；由于目前的腺病毒疫苗只有美軍中使用的4型和7型腺病毒活疫苗，對(duì)于最近爆發(fā)的14型腺病毒無(wú)確切的預(yù)防效果；另一方面，該疫苗主要成分為野生型腺病毒，殘余活病毒從腸道排出后極易污染水源，造成病毒的擴(kuò)散，因其安全隱患而不能應(yīng)用于普通人群。因此，研制安全有效的復(fù)制缺陷型14型腺病毒疫苗是迫在眉睫的需求。

復(fù)制缺陷型的腺病毒載體被廣泛用于疫苗研發(fā)和基因治療，不僅安全性高，而且可以在體內(nèi)誘發(fā)強(qiáng)的免疫反應(yīng)；腺病毒e1基因是其復(fù)制增殖的必需基因，e3基因則可以對(duì)抗宿主的免疫系統(tǒng)，e1和e3基因同時(shí)敲除后，腺病毒在正常人體內(nèi)喪失復(fù)制能力，具有減毒表型，而其主要的表面抗原如hexon、fibre等則不受影響。復(fù)制缺陷型的腺病毒疫苗不僅安全性高，而且可以在體內(nèi)誘發(fā)針對(duì)腺病毒的免疫反應(yīng)。復(fù)制缺陷型腺病毒可在互補(bǔ)細(xì)胞株，如表達(dá)ad5e1基因的293細(xì)胞、perc6細(xì)胞中生產(chǎn)。但是，b亞群腺病毒敲除e1和e3基因后在這些生產(chǎn)細(xì)胞株中難以獲得有效產(chǎn)量，主要原因是ad5e1b55k不能與b亞型腺病毒e4orf6相互作用，不能有效抑制宿主細(xì)胞mrna的出核并提升病毒晚期蛋白的表達(dá)。

有研究報(bào)道，ad26和ad35的e4orf6替換為ad5的e4orf6，同時(shí)敲除e1基因，仍可在293和perc6細(xì)胞中復(fù)制并獲得有效產(chǎn)量。目前尚無(wú)方法大量獲得復(fù)制缺陷型的ad14。e4基因包含了orf1、orf2、orf3、orf4、34k(orf6)、orf6/7等讀碼框，其編碼的蛋白均可能與e1基因編碼蛋白相互作用，在腺病毒復(fù)制與包裝過程中起重要作用。

利用腺病毒載體進(jìn)行的基因治療已被大規(guī)模進(jìn)行臨床試驗(yàn)，目前，全球以腺病毒載體進(jìn)行的臨床試驗(yàn)比例已達(dá)22.2％，居各類載體之首。腺病毒載體的使用主要集中在ad2和ad5，由于人自然感染腺病毒，大多數(shù)人體中存在抗ad2和ad5抗體，限制了傳統(tǒng)的腺病毒載體的使用。非洲、南美及我國(guó)等發(fā)展中國(guó)家和地區(qū)的人群中ad2和ad5中和抗體很高，陽(yáng)性率甚至高達(dá)90％，中和抗體的存在限制了腺病毒進(jìn)入機(jī)體細(xì)胞，使其無(wú)法行使免疫或者治療功能。為了逃避體內(nèi)預(yù)存抗腺病毒抗體的免疫反應(yīng)，研究者嘗試了一系列的策略：1)修飾或者改造腺病毒表面的衣殼蛋白，使其可以逃逸預(yù)存的免疫反應(yīng)；2)采用免疫抑制劑如環(huán)孢霉素、環(huán)磷酰胺、fk506等抑制抗腺病毒免疫反應(yīng)；3)開發(fā)無(wú)預(yù)存抗體反應(yīng)的黑猩猩腺病毒cv-68，63等稀有腺病毒載體4)我們此前開發(fā)的以腺病毒體外感染pbmc然后自體回輸?shù)腶vip技術(shù)；等等。ad14尚未在人群中大規(guī)模流行，人體內(nèi)缺少針對(duì)ad14的中和抗體，因此基于人14型腺病毒的載體是ad2、ad5等載體的良好的替代品。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，為了克服現(xiàn)有技術(shù)的上述問題，提供一種復(fù)制缺陷型人14型腺病毒載體。

本發(fā)明所要解決的上述技術(shù)問題通過以下技術(shù)方案予以解決：

一種復(fù)制缺陷型人14型腺病毒載體，由如下方法制備得到：將ad14基因組質(zhì)?；?，敲除ad14的e1、e3基因，再將ad14基因組中的e4基因開放閱讀框2、3、4、6、6/7改換為ad5基因組的相應(yīng)閱讀框。

優(yōu)選地，所述的復(fù)制缺陷型人14型腺病毒載體，還在ad14的e1基因區(qū)域整合外源基因表達(dá)框。

一種復(fù)制缺陷型人14型腺病毒載體的制備方法，包含如下步驟：

s1.pcr擴(kuò)增獲得ad14基因組的左右兩端，連接至氨芐抗性質(zhì)粒得到pt-ad14(l+r)，線性化后與ad14基因組重組，得到基因組質(zhì)粒pad14；

s2.pcr擴(kuò)增獲得ad14e3基因的左右臂并反向連接至卡那霉素抗性質(zhì)粒，線性化后與部分酶切線性化的pad14同源重組，得到去除e3基因的基因組質(zhì)粒pad14δe3-kana；

s3.pcr擴(kuò)增ad14e3基因的左右臂并同向連接到卡那霉素抗性質(zhì)粒上，線性化后與線性化的pad14δe3-kana進(jìn)行重組，得到去除卡那抗性基因的基因組質(zhì)粒pad14δe3；

s4.pcr擴(kuò)增ad14e1基因的左右臂并反向連接至卡那霉素抗性質(zhì)粒，線性化后與部分酶切線性化的pad14δe3同源重組，得到去除e1基因的基因組質(zhì)粒pad14δe1δe3-kana；

s5.pcr擴(kuò)增ad14e1基因的左右臂并同向連接至卡那霉素抗性質(zhì)粒，線性化后與線性化的pad14δe1δe3-kana進(jìn)行重組，得到去除卡那抗性基因的基因組質(zhì)粒pad14δe1δe3；

s6.pcr擴(kuò)增ad14e4基因連接至氨芐抗性質(zhì)粒得到p14e4，pcr擴(kuò)增得到ad5基因組e4開放閱讀框2至6/7區(qū)域，取代ad14e4基因中相應(yīng)區(qū)域得到p14e4(5e4)，線性化后與線性化的pad14δe1δe3同源重組，得到敲除e1、e3并改換e4的基因組質(zhì)粒pad14δe1δe3(5e4)。

優(yōu)選地，步驟s1.的具體方法為：

以ad14基因組為模板，pcr擴(kuò)增得到ad14基因組左右兩端l-ad14和r-ad14作為重組臂連接到線性化的t載體上，得到pt-ad14(l+r)，同時(shí)在pt-ad14(l+r)的左右臂之間引入了ecori、bamhi作為酶切位點(diǎn)，ecori+bamhi雙酶切pt-ad14(l+r)線性化后與ad14基因組重組，得到pad14。

最優(yōu)選地，在其中一個(gè)實(shí)施例中，步驟s1.的具體方法為：

以ad14基因組為模板，pcr擴(kuò)增得到ad14基因組左右兩端l-ad14和r-ad14作為重組臂連接到線性化的t載體上，得到pt-ad14(l+r),同時(shí)在pt-ad14(l+r)的左右臂之間引入了ecori、bamhi作為酶切位。pt-ad14(l+r)使用ecori+bamhi雙酶切進(jìn)行線性化，然后與ad14基因組重組，得到pad14。

優(yōu)選地，步驟s2.的具體方法為：

以ad14基因組為模板，pcr擴(kuò)增得到e3基因同源重組臂l-δe3及r-δe3，反向連接至pvax載體得到pvax-δe3(l+r)，線性化后，與經(jīng)ecori部分酶切線性化的pad14同源重組，經(jīng)氨芐青霉素、卡那霉素雙抗性篩選得到敲除e3基因同時(shí)在e3基因區(qū)引入唯一的線性化酶切位點(diǎn)swai的質(zhì)粒pad14δe3-kana。

最優(yōu)選地，在其中一個(gè)實(shí)施例中，步驟s2.的具體方法為：

以ad14的基因組為模板，pcr獲得e3基因的左右臂l-δe3，r-δe3和以pvax載體為模板pcr獲得pvax的骨架使用exnase重組酶進(jìn)行三片段連接得到pvax-δe3(l+r)。pvax-δe3(l+r)使用ecori+ecorv進(jìn)行雙酶切，pad14使用ecori進(jìn)行有限酶切，將兩者回收得到的片段進(jìn)行同源重組得到pad14δe3-kana。

優(yōu)選地，步驟s3.的具體方法為：

以ad14基因組為模板，pcr擴(kuò)增得到e3基因同源重組臂l-δk(e3)及r-δk(e3)，正向連接至pvax載體得到pvax-δk(e3)，線性化后與經(jīng)swai線性化的pad14δe3-kana進(jìn)行重組，得到敲除e3和卡那抗性基因，同時(shí)引入swal單酶切位點(diǎn)的pad14δe3。

最優(yōu)選地，在其中一個(gè)實(shí)施例中，步驟s3.的具體方法為：

以ad14的基因組為模板，pcr獲得e1基因的左右臂l-δk(e3)、r-δk(e3)和以pvax載體為模板pcr獲得pvax的骨架使用exnase重組酶進(jìn)行三片段連接得到pvax-δk(e3)。pvax-δk(e3)使用bstz17i+sgrai雙酶切，pad14δe3-kana使用swai進(jìn)行酶切進(jìn)行線性化，將兩者酶切回收的片段共進(jìn)行同源重組得到pad14δe3。

優(yōu)選地，步驟s4.的具體方法為：

根據(jù)步驟s2相同的原理，pcr擴(kuò)增得到e1基因同源重組臂l-δe1及r-δe1，反向連接至pvax載體得到pvax-δe1(l+r)，線性化后與paci酶切線性化的pad14δe3同源重組，經(jīng)氨芐、卡那霉素雙抗性篩選得到敲除e1基因并在e1基因區(qū)引入唯一的線性化酶切位點(diǎn)pmei的質(zhì)粒pad14δe1δe3-kana。

最優(yōu)選地，在其中一個(gè)實(shí)施例中，步驟s4.的具體方法為：

以ad14的基因組為模板，pcr獲得e1基因的左右臂l-δe1，r-δe1和以pvax載體為模板pcr獲得pvax的骨架使用exnase重組酶進(jìn)行三片段連接得到pvax-δe1(l+r)。pvax-δe1(l+r)使用ecori+ecorv進(jìn)行雙酶切，pad14δe3使用paci進(jìn)行有限酶切，將兩者回收得到的片段進(jìn)行同源重組得到pad14δe1δe3-kana。

優(yōu)選地，步驟s5.的具體方法為：

根據(jù)步驟s3相同的原理，pcr擴(kuò)增得e1基因同源重組臂l-δk(e1)及r-δk(e1)，正向連接至pvax載體得到pvax-δk(e1)，線性化后與經(jīng)pmei線性化的pad14δe1δe3-kana進(jìn)行重組，得到敲除e1和卡那抗性基因同時(shí)引入pmei單酶切位點(diǎn)的pad14δe1δe3。

最優(yōu)選地，在其中一個(gè)實(shí)施例中，步驟s5.的具體方法為：

以ad14的基因組為模板，pcr獲得e1基因的左右臂l-δk(e1)、r-δk(e1)和以pvax載體為模板pcr獲得pvax的骨架使用exnase重組酶進(jìn)行三片段連接得到pvax-δk(e1)。pvax-δk(e1)使用bstz17i+sgrai雙酶切，pad14δe1δe3-kana使用paci進(jìn)行酶切進(jìn)行線性化，將兩者酶切回收的片段共進(jìn)行同源重組得到pad14δe1δe3。

優(yōu)選地，步驟s6.的具體方法為：

分別以ad5、ad14基因組為模板，pcr擴(kuò)增得到ad5e4orf2-6和ad14e4，將ad14e4連接至t載體得到p14e4，進(jìn)一步以p14e4為模板pcr去除ad14e4orf2-6，然后與ad5e4orf2-6連接得到p14e4(5e4)，線性化后與線性化的如權(quán)利要求8所述pad14δe1δe3同源重組，得到pad14δe1δe3(5e4)。

最優(yōu)選地，在其中一個(gè)實(shí)施例中，步驟s6.的具體方法為：

分別以ad5、ad55基因組為模板，pcr擴(kuò)增ad5e4orf2-6、ad14e4基因，ad14e4基因連接至t載體得到p14e4。以p14e4為模板pcr獲得其骨架序列，與ad5e4orf2-6使用exnase酶連接得到p14e4(ad5orf2-6)。ecori線性化p14e4(ad5orf2-6)和psii線性化的pad14δe1δe3進(jìn)行重組得到pad14δe1δe3(5e4)

一種復(fù)制缺陷型人14型腺病毒載體的制備方法，還包含如下步驟：

s7.以ad14基因組為模板pcr得到e1區(qū)同源重組臂l-se1、r-se1，酶切并連接至pvax載體得到pse1lr；以pga1-egfp為模板pcr得到外源基因表達(dá)框cmv-egfp-bgh，與pse1lr經(jīng)酶切、連接得到pgk141-egfp，線性化后與線性化的pad14δe1δe3(5e4)同源重組得到pad14δe1δe3(5e4)-egfp，進(jìn)一步線性化后轉(zhuǎn)染細(xì)胞，經(jīng)培養(yǎng)、離心純化得到ad14δe1δe3(5e4)以及ad14δe1δe3(5e4)-egfp。

優(yōu)選地，步驟s7.的具體方法為：

分別以pvax、ad14基因組、pga1-egfp為模板pcr得到pvax骨架、e1區(qū)上下游同源重組臂l-se1、r-se1以及外源基因表達(dá)框cmv-egfp-bgh，pvax骨架、se1l、se1r連接得到pse1lr；cmv-egfp-bgh與pse1lr經(jīng)酶切、連接得到攜帶外源基因表達(dá)框的目標(biāo)穿梭質(zhì)粒pgk141-egfp；

pgk141-egfp線性化后與線性化的pad14δe1δe3(5e4)同源重組得到pad14δe1δe3(5e4)-egfp；

asisi酶切pad14δe1δe3(5e4)和pad14δe1δe3(5e4)-egfp進(jìn)行線性化，然后轉(zhuǎn)染293細(xì)胞進(jìn)行病毒拯救、擴(kuò)增培養(yǎng)，純化得到ad14δe1δe3(5e4)和ad14δe1δe3(5e4)-egfp。

更為優(yōu)選地，在其中一個(gè)實(shí)施例中，步驟s7.的具體方法為：

分別以pvax、ad14基因組、pga1-egfp為模板pcr得到vax骨架、e1區(qū)上下游同源重組臂l-se1、r-se1以及外源基因表達(dá)框cmv-egfp-bgh，pvax骨架、l-se1、r-se1使用exnase酶進(jìn)行三片段連接得到pse1lr；cmv-egfp-bgh使用spei進(jìn)行酶切，pse1lr使用spei+ecorv進(jìn)行酶切，兩者連接得到穿梭質(zhì)粒pgk141-egfp。

pgk141-egfp使用bstz17i+sgrai進(jìn)行酶切進(jìn)行線性化,pad14δe1δe3(5e4)使用pmei進(jìn)行線性化，兩者進(jìn)行同源重組得到pad14δe1δe3(5e4)-egfp。

pad14δe1δe3(5e4)、pad14δe1δe3(5e4)-egfp使用asisi酶切進(jìn)行線性化，乙醇沉淀回收后轉(zhuǎn)染293細(xì)胞進(jìn)行病毒拯救、擴(kuò)增培養(yǎng)，以cscl2密度梯度離心法純化得到pad14δe1δe3(5e4)和ad14δe1δe3(5e4)-egfp。

所述的復(fù)制缺陷型人14型腺病毒載體在制備疫苗中的應(yīng)用。

所述的復(fù)制缺陷型人14型腺病毒載體在制備中和抗體中的應(yīng)用。

所述的復(fù)制缺陷型人14型腺病毒載體在生物學(xué)報(bào)告示蹤系統(tǒng)中的應(yīng)用。

所述的復(fù)制缺陷型人14型腺病毒載體在制備抗人14型腺病毒的疫苗中的應(yīng)用。

所述的復(fù)制缺陷型人14型腺病毒載體在制備抗人14型腺病毒藥物中的應(yīng)用。

有益效果：(1)本發(fā)明成功制備得到了復(fù)制缺陷型人14型腺病毒載體，所述的載體能夠在293、perc6等輔助細(xì)胞株中大量生產(chǎn)，并可以密度梯度離心濃縮純化；且在正常人體細(xì)胞不具備復(fù)制能力，因此具備減毒表型；(2)該重組載體還可在靶細(xì)胞內(nèi)高效表達(dá)外源基因；(3)本發(fā)明所述重組載體可作為疫苗或基因治療載體，還可應(yīng)用于藥物及中和抗體的研發(fā)，以及報(bào)告示蹤系統(tǒng)等；實(shí)施例試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明所述制缺陷型人14型腺病毒載體可在免疫小鼠的早期誘發(fā)更高水平的針對(duì)ad14的中和抗體。

附圖說明

附圖1是利用同源重組對(duì)ad14的基因組環(huán)化的原理，及環(huán)化的穿梭質(zhì)粒、pad14的酶切鑒定結(jié)果。

附圖2是使用氨芐、卡那霉素進(jìn)行雙抗篩選敲除ad14e3基因的原理，及敲除ad14e3的穿梭質(zhì)粒、pad14δe3-kana質(zhì)粒的pcr鑒定結(jié)果。

附圖3是敲除pad14δe3-kana質(zhì)粒中卡那霉素抗性的原理，及敲除ad14e3區(qū)那霉素抗性的穿梭質(zhì)粒、pad14δe3質(zhì)粒的酶切結(jié)果。

附圖4是使用氨芐、卡那霉素進(jìn)行雙抗篩選敲除pad14δe3中e1基因的原理，及敲除pad14δe3中e1基因的穿梭質(zhì)粒的pcr鑒定、pad14δe1δe3-kana質(zhì)粒的酶切結(jié)果。

附圖5是敲除pad14δe1δe3-kana質(zhì)粒中卡那霉素抗性的原理，及敲除pad14δe3中e1區(qū)卡那霉素抗性的穿梭質(zhì)粒、pad14δe1δe3質(zhì)粒的酶切結(jié)果。

附圖6是pad14δe1δe3中e4基因中orf2-6替換為ad5e4基因orf2-6相應(yīng)序列的原理，置換ad14e4基因中orf2-6的穿梭質(zhì)粒及pad14δe1δe3(5e4)的酶切結(jié)果。

附圖7是構(gòu)建攜帶外源基因表達(dá)框的pad14δe1δe3(5e4)-egfp的過程示意圖及酶切結(jié)果。

附圖1～7中m1代表2000bpdnamarker，m2代表15000bpdnamarker。

附圖8是復(fù)制缺陷型ad14載體的生產(chǎn)及純化結(jié)果。

附圖9是復(fù)制缺陷型ad14載體在293和a549細(xì)胞中形成病毒噬斑的結(jié)果。

附圖10是復(fù)制缺陷型ad14δe1δe3(5e4)免疫小鼠后的中和抗體效價(jià)水平。

具體實(shí)施方法

本發(fā)明公開了一種復(fù)制缺陷型人55型腺病毒載體的制備方法。本發(fā)明所述腺病毒載體的制備方法和構(gòu)建思路適用于針對(duì)腺病毒及其他病原體疫苗的研發(fā)，抗腺病毒藥物及中和抗體的篩選，以及生物學(xué)研究中的報(bào)告示蹤系統(tǒng)。

本發(fā)明術(shù)語(yǔ)“人55型腺病毒”指本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的55型腺病毒，實(shí)施例中用到的ad55基因組也來源于這些已知的人55型腺病毒。本發(fā)明所述復(fù)制缺陷型人55型腺病毒載體不局限于實(shí)施例所采用的特定臨床分離株。

本發(fā)明術(shù)語(yǔ)“外源序列”是指非55型腺病毒來源的任何dna序列。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，外源序列可以是外源基因表達(dá)框，也可以是shrna或mirna的表達(dá)框等。

在以下實(shí)施例中，根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員的理解，外源基因表達(dá)框可包含真核啟動(dòng)子、外源基因編碼序列、轉(zhuǎn)錄終止子。所述外源基因編碼序列可以是但不僅限于綠色熒光蛋白、其他病毒抗原、shrna等的編碼序列。

為了能夠更清楚地理解本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容，特舉以下實(shí)施例結(jié)合附圖詳細(xì)說明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如sambrook等人，分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊(cè)(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例中所用到的各種常用化學(xué)試劑，均為市售產(chǎn)品。

除非另有定義，本發(fā)明所使用的所有的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)與屬于本發(fā)明的技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員通常理解的含義相同。本發(fā)明的說明書中所使用的術(shù)語(yǔ)只是為了描述具體的實(shí)施例的目的，不用于限制本發(fā)明。

實(shí)施例1：ad14基因組的環(huán)化。

1.構(gòu)建環(huán)化ad14基因組的穿梭質(zhì)粒pt-ad14(l+r)。

以ad14的基因組為模板，pcr獲得ad14基因組的左臂(l-ad14)和右臂(r-ad14)。

l-ad14引物：

l-ad14-f,cctgccgttcgacgatgcgatcgcatcatcaataatataccttatagatgg

l-ad14-r,gatccacatacgaattccggtaatcgaaacctccacg

pcr條件：95℃，3min；95℃，30s；57℃30s；72℃，30s；cycles30；72℃，5min；12℃保存。

r-ad14引物：

r-ad14-f,gaattcgtatgtggatcctgggaaccaccagtaatgtca

r-ad14-r,cgcggatcttccagagatgcgatcgcatcatcaataatataccttatagatgg

pcr條件：95℃，3min；95℃，30s；57℃30s；72℃，1min；cycles30；72℃，5min；12℃保存。

2.構(gòu)建pad14。

pt-ad14(l+r)使用ecori+bamhi進(jìn)行酶切線性化，然后和ad14的基因組共轉(zhuǎn)化bj5183感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行重組，氨芐抗性平板進(jìn)行抗性篩選，將篩選得到單克隆擴(kuò)增后提取其質(zhì)粒轉(zhuǎn)化xl感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒得到pad14，使用不同的酶切方式進(jìn)行鑒定，pad14在基因組的兩側(cè)引入了兩個(gè)asisi酶切位點(diǎn)，方便后續(xù)對(duì)改造后的ad14的基因組進(jìn)行線性化進(jìn)行病毒拯救。

實(shí)施例2：e3基因的敲除及pad14δe3-kana質(zhì)粒的構(gòu)建。

1.構(gòu)建e3基因敲除的穿梭質(zhì)粒pvax-δe3(l+r)。

以ad14的基因組為模板，pcr獲得e3基因的左臂(l-δe3)和右臂(r-δe3)。

l-δe3引物：

l-δe3-f,gatatctagagtgaattcgtccaaatgactaatgcaggtgc

l-δe3-r,ccagtagaagcgccggatttaaataggaaaagtttcgttcttctggttg

pcr條件：95℃，3min；95℃，30s；61℃30s；72℃，50s；cycles30；72℃，5min；12℃保存。

r-δe3引物：

r-δe3-f,attattgactagagtaatttaaatggactaagagacctgctacccatg

r-δe3-r,gaattcactctagatatcccacttttagctgtagagacccg

pcr條件：95℃，3min；95℃，30s；60℃30s；72℃，30s；cycles30；72℃，5min；12℃保存。

l-δe3、r-δe3和bstz17i+sgrai雙酶切pvax載體獲得的質(zhì)粒骨架使用exnase酶進(jìn)行三片段連接得到pvax-δe3(l+r)。

2.構(gòu)建pad14δe3-kana

pvax-δe3(l+r)使用ecori+ecorv進(jìn)行雙酶切，pad14使用ecori進(jìn)行酶切，將兩者酶切回收的片段共轉(zhuǎn)化bj5183感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行重組，將氨芐、卡那雙抗平板進(jìn)行抗性篩選，將篩選得到單克隆擴(kuò)增后提取其質(zhì)粒轉(zhuǎn)化xl感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒得到pad14δe3-kana，使用不同的酶切方式進(jìn)行鑒定，pad14δe3-kana在e3基因區(qū)引入的卡那基因的兩側(cè)引入了兩個(gè)swai酶切位點(diǎn)，方便后續(xù)克隆操作。

實(shí)施例3：構(gòu)建pad14δe3-kana質(zhì)粒中卡那抗性基因敲除的質(zhì)粒pad14δe3。

1.構(gòu)建敲除e3區(qū)卡那抗性基因的穿梭質(zhì)粒pvax-δk(e3)。

以ad14基因組為模板，pcr獲得e3基因的左臂l-δk(e3)和右臂r-δk(e3)。

l-δk(e3)引物：

l-δk(e3)-f,tgattattgactagagtatacgtccaaatgactaatgcaggtgc

l-δk(e3)-r:gatatcatttaaatactagtaggaaaagtttcgttcttctggttg

pcr條件：95℃，3min；95℃，30s；60℃30s；72℃，50s；cycles30；72℃，5min；12℃保存。

r-δk(e3)引物：

r-δk(e3)-f,actagtatttaaatgatatcggactaagagacctgctacccatg

r-δk(e3)-r,accgcccagtagaagcgccggtgccacttttagctgtagagacccg

pcr條件：95℃，3min；95℃，30s；60℃30s；72℃，30s；cycles30；72℃，5min；12℃保存。

l-δk(e3)、r-δk(e3)和經(jīng)bstz17i+sgrai雙酶切pvax載體獲得的質(zhì)粒骨架使用exnase酶進(jìn)行三片段連接得到pvax-δk(e3)。

2.構(gòu)建pad14δe3

pvax-δk(e3)使用bstz17i+sgrai雙酶切，pad14δe3-kana使用swai進(jìn)行酶切進(jìn)行線性化，將兩者酶切回收的片段共轉(zhuǎn)化bj5183感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行重組，將氨芐平板進(jìn)行抗性篩選，將篩選得到單克隆擴(kuò)增后提取其質(zhì)粒轉(zhuǎn)化xl感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒得到pad14δe3，提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定。利用pvax-δk(e3)重組敲除卡那抗性基因的同時(shí)在e3區(qū)引入了單一的酶切位點(diǎn)swai，穿梭質(zhì)粒及pad14δe3的構(gòu)建流程見附圖3。

實(shí)施例4：e1基因的敲除及pad14δe1δe3-kana質(zhì)粒的構(gòu)建

1.構(gòu)建e1基因敲除的穿梭質(zhì)粒pvax-δe1(l+r)。

以ad14的基因組為模板，pcr獲得e1基因的左臂(l-δe1)和右臂(r-δe1)。

l-δe1引物：

l-δe1-f,gatatctagagtgaattcggggtggagtgtttttgcaag

l-δe1-r,cgcccagtagaagcgccgggtttaaacgtaatcgaaacctccacgtaatgg

pcr條件：95℃，3min；95℃，30s；62℃30s；72℃，30s；cycles30；72℃，5min；12℃保存。

r-δe1引物:

r-δe1-f,ccagatatacgcgtgtatagtttaaacgagaccggatcatttggttattg

r-δe1-r,gaattcactctagatatcgggaaatgcaaatctgtgaggg

pcr條件：95℃，3min；95℃，30s；61℃30s；72℃，1min30s；cycles30；72℃，5min；12℃保存。

l-δe1、r-δe1和bstz17i+sgrai雙酶切pvax載體獲得的質(zhì)粒骨架使用exnase酶進(jìn)行三片段連接得到pvax-δe1(l+r)。

2.構(gòu)建pad14δe1δe3-kana

pvax-δe1(l+r)使用ecori+ecorv進(jìn)行雙酶切，pad14δe3使用paci進(jìn)行酶切線性化，將兩者酶切回收的片段共轉(zhuǎn)化bj5183感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行重組，將氨芐、卡那雙抗平板進(jìn)行抗性篩選，將篩選得到單克隆擴(kuò)增后提取其質(zhì)粒轉(zhuǎn)化xl感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒得到pad14δe1δe3-kana，使用不同的酶切方式進(jìn)行鑒定，pad14δe1δe3-kana在e1基因區(qū)引入的卡那基因的兩側(cè)引入了兩個(gè)pmei酶切位點(diǎn)，方便后續(xù)克隆操作。

實(shí)施例5：構(gòu)建pad14δe1δe3-kana中卡那抗性基因敲除的質(zhì)粒pad14δe1δe3。

1.構(gòu)建敲除e1區(qū)卡那抗性基因的穿梭質(zhì)粒pvax-δk(e1)。

以ad14的基因組為模板，pcr獲得e1基因的左臂l-δk(e1)和右臂r-δk(e1)。

l-δk(e1)引物：

l-δk(e1)-f,accgcccagtagaagcgccggtgggggtggagtgtttttgcaag

l-δk(e1)-r,actagtgtttaaacgatatcgtaatcgaaacctccacgtaatgg

pcr條件：95℃，3min；95℃，30s；61℃30s；72℃，30s；cycles30；72℃，5min；12℃保存。

r-δk(e1)的引物序列：

r-δk(e1)-f,gatatcgtttaaacactagtgagaccggatcatttggttattg

r-δk(e1)-r,ccagatatacgcgtgtatacgggaaatgcaaatctgtgaggg

pcr條件：95℃，3min；95℃，30s；61℃30s；72℃，1min30s；cycles30；72℃，5min；12℃保存。

l-δk(e1)、r-δk(e1)和經(jīng)bstz17i+sgrai雙酶切pvax載體獲得的質(zhì)粒骨架使用exnase酶進(jìn)行三片段連接得到pvax-δk(e1)。

2.構(gòu)建pad14δe1δe3

pvax-δk(e1)使用bstz17i+sgrai雙酶切，pad14δe1δe3-kana使用pmei進(jìn)行酶切進(jìn)行線性化，將兩者酶切回收的片段共轉(zhuǎn)化bj5183感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行重組，將氨芐平板進(jìn)行抗性篩選，將篩選得到單克隆擴(kuò)增后提取其質(zhì)粒轉(zhuǎn)化xl感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒得到pad14δe1δe3，提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定。利用pvax-δk(e1)重組敲除卡那抗性基因的同時(shí)在e1區(qū)引入了單一的酶切位點(diǎn)pmei，穿梭質(zhì)粒及pad14δe1δe3的構(gòu)建流程見附圖5。

實(shí)施例6:改造ad14e4基因構(gòu)建并構(gòu)建pad14δe1δe3(5e4)

1.構(gòu)建整合ad5e4orf2-6的穿梭質(zhì)粒p14e4(5orf2-6)。

1)以ad14的基因組為模板pcr獲得ad14的e4基因。

ad14e4引物:

e4-f,agagtgcaccatatggaattcggactaagagacctgctacccatg

e4-r,gctgtgtggtaattggctgtggg

pcr條件：95℃，3min；95℃，30s；62℃30s；72℃，4min30s；cycles30；72℃，5min；12℃保存。

對(duì)pcr獲得e4基因片段的末端進(jìn)行加磷，然后和平末端的t載體連接得到p14e4。

2)以ad5基因組為模板，利用下列引物pcr擴(kuò)增ad5e4orf2-6。

5(orf2-6)-f,cattcaaaactaacaatgcagaaacccgcagacatg

5(orf2-6)-r,gagtctggatcacggctacatgggggtagagtcataatcg

pcr條件：95℃，3min；95℃，30s；62℃30s；72℃，2min；cycles30；72℃，5min；12℃保存。

3)以p14e4為模板利用下列引物pcr獲得p14e4的骨架。

p14e4-f,ccgtgatccagactccggag

p14e4-r,tgttagttttgaatgagtctgcaaa

pcr條件：95℃，3min；95℃，30s；60℃30s；72℃，5min；cycles30；72℃，5min；12℃保存。

5(orf2-6)和p14e4的質(zhì)粒骨架使用exnase進(jìn)行兩片段連接得到p14e4(5orf2-6)。

2.構(gòu)建質(zhì)粒pad14δe1δe3(5e4)

p14e4(5orf2-6)使用ecori進(jìn)行線性化，pad14δe1δe3使用psii進(jìn)行線性化，將兩者酶切回收的片段共轉(zhuǎn)化bj5183感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行重組，將氨芐平板進(jìn)行抗性篩選，將篩選得到單克隆擴(kuò)增后提取其質(zhì)粒轉(zhuǎn)化xl感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒得到pad14δe1δe3(5e4)，提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，pad14δe1δe3(5e4)的具體構(gòu)建過程見附圖6。

實(shí)施例7:構(gòu)建攜帶egfp等外源基因的穿梭質(zhì)粒及復(fù)制缺陷型ad14基因組質(zhì)粒pad14δe1δe3(5e4)-egfp

1.構(gòu)建攜帶e1基因兩側(cè)重組臂的穿梭質(zhì)粒pse1lr。

以ad14的基因組為模板pcr獲得e1基因的左臂(l-se1)和右臂(r-se1)

l-se1引物：

l-se1-f,accgcccagtagaagcgccggtgggggtggagtgtttttgcaag

l-se1-r,actagtgtttaaacgatatcgtaatcgaaacctccacgtaatgg

pcr條件：95℃，3min；95℃，30s；61℃30s；72℃，30s；cycles30；72℃，5min；12℃保存。

r-se1引物：

r-se1-f,gatatcgtttaaacactagtgagaccggatcatttggttattg

r-se1-r,ccagatatacgcgtgtatacgggaaatgcaaatctgtgaggg

pcr條件：95℃，3min；95℃，30s；61℃30s；72℃，1min30s；cycles30；72℃，5min；12℃保存。

l-se1、r-se1和經(jīng)bstz17i+sgrai雙酶切pvax載體獲得的質(zhì)粒骨架使用exnase酶進(jìn)行三片段連接得到pse1(l+r)。

2.構(gòu)建攜帶egfp等外源基因的穿梭質(zhì)粒pgk141-egfp。

以pga1-egfp為模板，pcr擴(kuò)增獲得cmv-egfp-bgh

引物序列：

cmv-egfp-bgh-f,agatatacgcgttgacattgattattgactag

cmv-egfp-bgh-r,gctggttctttccgcctcagaag

pcr條件：95℃，3min；95℃，30s；65℃30s；72℃，1min50s；cycles30；72℃，5min；12℃保存。

cmv-egfp-bgh表達(dá)框使用spei進(jìn)行酶切，pse1(l+r)使用hindiii+xbai進(jìn)行雙酶切，兩者連接得到pgk141-egfp。

3.構(gòu)建pad14δe1δe3(5e4)-egfp

pgk141-egfp使用bstz17i+sgrai進(jìn)行線性化，pad14δe1δe3(5e4)使用pmei進(jìn)行線性化，將兩者酶切回收的片段共轉(zhuǎn)化bj5183感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行重組，將氨芐抗性平板進(jìn)行抗性篩選，將篩選得到單克隆擴(kuò)增后提取其質(zhì)粒轉(zhuǎn)化xl感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒得到pad14δe1δe3(5e4)-egfp，提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，pad14δe1δe3(5e4)-egfp質(zhì)粒的具體構(gòu)建過程見附圖7。

實(shí)施例8:復(fù)制缺陷型ad14載體的拯救和生產(chǎn)

pad14δe1δe3(5e4)、pad14δe1δe3(5e4)-egfp分別使用asisi進(jìn)行酶切線性化，使用乙醇沉淀法回收，使用lipofectamine2000轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，轉(zhuǎn)染8h后，將培養(yǎng)基更換為含5％fbs的dmem培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)第7天開始每天注意觀察細(xì)胞是否發(fā)生了病變；當(dāng)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞明顯病變后，收集細(xì)胞及培養(yǎng)上清，在液氮罐和37℃水浴鍋中進(jìn)行反復(fù)凍融3次，離心去除細(xì)胞碎片，取適量上清感染10cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中的293細(xì)胞；感染2-3天觀察到出毒現(xiàn)象后，收集細(xì)胞和上清，反復(fù)凍融3次后，離心去除細(xì)胞碎片收集上清。取上清去感染8-10個(gè)15cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中的293細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，感染2-3天觀察到出毒現(xiàn)象后，收集細(xì)胞和上清，反復(fù)凍融3次后，離心去除細(xì)胞碎片收集上清。將上清加入到氯化銫梯度離心管中，配平后，4℃，30000rpm離心4h；離心后小心吸出病毒條帶，脫鹽，分裝；取適量病毒進(jìn)行病毒定量，測(cè)定od260濃度,病毒濃度＝od260×稀釋倍數(shù)×36/基因組長(zhǎng)度(kb)；純化獲得的病毒于-80℃儲(chǔ)存。復(fù)制缺陷型ad14載體的生產(chǎn)及純化結(jié)果見附圖8。

實(shí)施例9：復(fù)制缺陷型ad14在293和a549細(xì)胞中復(fù)制能力測(cè)定

采用噬斑實(shí)驗(yàn)測(cè)定復(fù)制缺陷型ad14載體在輔助細(xì)胞293和非輔助細(xì)胞a549中的復(fù)制能力。在12孔細(xì)胞板中接種293或者a549細(xì)胞，待到細(xì)胞密度接近100％時(shí)，將收獲的的p1代ad14δe1δe3(5e4)-egfp病毒原液梯度稀釋后分別感染293或者a549細(xì)胞，每個(gè)病毒濃度做兩個(gè)重復(fù)。病毒感染細(xì)胞2h后，吸去培養(yǎng)基，每孔鋪上1ml左右的1.2％的瓊脂糖凝膠(含1.2％瓊脂糖，5％胎牛血清，1×mem培養(yǎng)基，1×青鏈霉素抗生素)。培養(yǎng)9-12天左右，利用熒光顯微鏡觀察病毒攜帶的綠色熒光表達(dá)，并尋找病毒克隆的形成，拍照記錄。結(jié)果如附圖9所示，ad14δe3-egfp只刪除了e3基因，在293和a549細(xì)胞中都能形成明顯的病毒噬斑，具有復(fù)制能力；ad14δe1δe3(5e4)-egfp同時(shí)刪除了e1和e3基因，只能在輔助細(xì)胞293中形成病毒噬斑，卻無(wú)法在人正常的a549細(xì)胞形成病毒噬斑。以上結(jié)果表復(fù)制缺陷型ad14載體可在輔助細(xì)胞293中復(fù)制，卻無(wú)法在人的正常細(xì)胞如a549細(xì)胞中復(fù)制，具有減毒表型。此外，復(fù)制缺陷型ad14載體可在感染的細(xì)胞中表達(dá)攜帶的報(bào)告基因，運(yùn)用于生物示蹤系統(tǒng)中。

實(shí)施例10：復(fù)制缺陷型ad14載體在小鼠中免疫原性評(píng)價(jià)

設(shè)計(jì)復(fù)制缺陷型ad14在小鼠體內(nèi)的免疫原性評(píng)價(jià)方案，如附圖，按照設(shè)計(jì)的免疫方案對(duì)復(fù)制缺陷型ad14的免疫原性進(jìn)行評(píng)價(jià)。

選取6-8周齡的balb/c小鼠分為3組，每組6只。采取肌注免疫的方式，第1組免疫ad5δe1δe3，第2組免疫熱滅活的ad14δe3-egfp，第3組免疫ad14δe1δe3(5e4)-egfp。免疫后第14天，眼眶采血分離血清，測(cè)定抗ad14的中和抗體。與免疫滅活的ad14δe3-egfp相比，免疫ad14δe1δe3(5e4)-egfp可誘導(dǎo)更高水平的抗ad14中和抗體。免疫后第42天后，再次進(jìn)行眼眶采血，測(cè)定血清中抗ad14的中和抗體效價(jià)。結(jié)果如圖10所示，此時(shí)，免疫ad14δe1δe3(5e4)-egfp和滅活的ad14δe3-egfp可誘導(dǎo)針對(duì)ad14的中和抗體相同水平的中和抗體效價(jià)。這些結(jié)果說明，與滅活的ad14δe3-egfp相比，ad14δe1δe3(5e4)-egfp可在免疫小鼠的早期誘發(fā)更高水平的針對(duì)ad14的中和抗體。

實(shí)施例僅表達(dá)了本項(xiàng)發(fā)明的幾種實(shí)施方式，這些實(shí)施例的描述清晰、具體，這些實(shí)施例的表述不可理解為對(duì)本項(xiàng)發(fā)明專利的限制。需要強(qiáng)調(diào)的是，對(duì)于本研究領(lǐng)域的科研技術(shù)人員，在根據(jù)本項(xiàng)發(fā)明構(gòu)思的前提下，還能夠做出若干變化和改進(jìn)，這些屬于本項(xiàng)發(fā)明的保護(hù)范圍。因此，本項(xiàng)專利的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。

sequencelisting

<110>廣州恩寶生物醫(yī)藥科技有限公司

<120>一種復(fù)制缺陷型人14型腺病毒載體及其制備方法和應(yīng)用

<130>

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<170>patentinversion3.5

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<213>人工序列

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cctgccgttcgacgatgcgatcgcatcatcaataatataccttatagatgg51

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gatccacatacgaattccggtaatcgaaacctccacg37

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gaattcgtatgtggatcctgggaaccaccagtaatgtca39

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cgcggatcttccagagatgcgatcgcatcatcaataatataccttatagatgg53

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<213>l-δe3-r

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gatatctagagtgaattcgtccaaatgactaatgcaggtgc41

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ccagtagaagcgccggatttaaataggaaaagtttcgttcttctggttg49

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attattgactagagtaatttaaatggactaagagacctgctacccatg48

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gaattcactctagatatcccacttttagctgtagagacccg41

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tgattattgactagagtatacgtccaaatgactaatgcaggtgc44

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actagtatttaaatgatatcggactaagagacctgctacccatg44

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accgcccagtagaagcgccggtgccacttttagctgtagagacccg46

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gatatctagagtgaattcggggtggagtgtttttgcaag39

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cgcccagtagaagcgccgggtttaaacgtaatcgaaacctccacgtaatgg51

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<212>dna

<213>人工序列

<400>17

accgcccagtagaagcgccggtgggggtggagtgtttttgcaag44

<210>18

<211>44

<212>dna

<213>人工序列

<400>18

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<210>19

<211>43

<212>dna

<213>人工序列

<400>19

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<210>20

<211>42

<212>dna

<213>人工序列

<400>20

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<210>21

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<212>dna

<213>人工序列

<400>21

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<210>22

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<213>人工序列

<400>22

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<210>23

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<212>dna

<213>人工序列

<400>23

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<212>dna

<213>人工序列

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<210>25

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<213>人工序列

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<210>26

<211>25

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<213>人工序列

<400>26

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<210>27

<211>44

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<213>人工序列

<400>27

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<210>28

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<210>29

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<212>dna

<213>人工序列

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<210>30

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<213>人工序列

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<210>31

<211>32

<212>dna

<213>人工序列

<400>31

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<210>32

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<400>32

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