本發(fā)明屬于生物技術(shù)制藥中卵黃免疫球蛋白制備
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種提取鴨坦布蘇病毒病卵黃抗體的工藝方法。
背景技術(shù)：
：雞卵黃免疫球蛋白G抗體是一種7S免疫球蛋白，與哺乳動(dòng)物IgG略有不同。該蛋白質(zhì)分子量約為180kDa，含兩個(gè)亞單位，即67～70kDa的重鏈和22～30kDa的輕鏈，又稱IgY(YolkImmunoglobulin)，存在于免疫后母雞的卵黃中。實(shí)驗(yàn)證明，受免疫刺激后，母雞產(chǎn)生免疫反應(yīng)，在輸卵管內(nèi)卵黃成熟期，血液中IgY可被選擇性地轉(zhuǎn)移到卵黃中，而且是卵黃中唯一的免疫球蛋白類。早在60年代，科學(xué)家們就發(fā)現(xiàn)雞卵黃中存在IgY抗體，其含量與雞血清相似甚至更高。卵黃作為特異抗體IgY的來源有許多優(yōu)點(diǎn)。如：母雞易于飼養(yǎng)，費(fèi)用不高；收集雞蛋方便，無需抽動(dòng)物血，無損傷，符合現(xiàn)代動(dòng)物保護(hù)規(guī)則；產(chǎn)生有效免疫反應(yīng)所需抗原量小，尤其是高度保守的哺乳動(dòng)物蛋白質(zhì)對(duì)種系發(fā)生學(xué)上距離較遠(yuǎn)的禽類通常有較強(qiáng)的免疫原性。由于如前所述卵黃作為特異抗體IgY的許多優(yōu)點(diǎn)，IgY在免疫學(xué)檢測方面正在受到越來越廣泛的應(yīng)用。在免疫治療方面，因雞抗體耐酸、耐熱且性能穩(wěn)定，可經(jīng)口服用于預(yù)防或治療年幼動(dòng)物或人類的腸道傳染病，如嬰兒防病食品等。特別是抗生素或其它藥物的使用存在問題時(shí)，IgY越來越成為一種趨勢。卵黃是由約48.7％的水、16.6％蛋白質(zhì)和32.6％的脂類及其它組分組成。由于很難將IgY抗體從豐富的卵黃脂質(zhì)中分離出來，使得雞蛋作為抗體來源的研究受到限制。直到80年代初，國外科研人員相繼建立了脫脂方法，如Polson的聚乙二醇(PEG)提取法及其改良方法(1980和1985年)，Jenseniusde硫酸葡聚糖提取法(1981)，以及氯仿法和水稀釋法等。國內(nèi)起步較晚，方法也主要是以上方法基礎(chǔ)上進(jìn)行改良。以上方法雖然能獲得一定的IgY回收率，但是應(yīng)用中存在一定缺陷。首先，這些方法中許多需要大量有毒試劑，脫脂后去除這些試劑容易增加成本；其次這些方法需要使用大型離心機(jī)等儀器，這將限制IgY的工業(yè)化生產(chǎn)；而且這些方法效率和純度都不高，影響了IgY的質(zhì)量。近年來，我國科研工作者對(duì)IgY的提取也進(jìn)行了很多研究。如山東農(nóng)業(yè)大學(xué)柴家前的發(fā)明專利一種提取卵黃中抗體的新方法(申請(qǐng)?zhí)?5l10458.6)中采用加權(quán)脫脂法。1998年山東農(nóng)業(yè)大學(xué)常韋山的發(fā)明專利精制卵黃抗體的制備工藝(ZL專利號(hào)9811025.8)中公開了苯酚脫脂法。還有山東農(nóng)科院何元龍的發(fā)明專利卵黃聚乙二醇一次沉淀脫脂技術(shù)(申請(qǐng)?zhí)?00810014515.1)。以上這些方法都有一些不足，有的試劑有毒，在IgY液中很難去除；有的IgY回收率低，純度不高，影響抗體的使用質(zhì)量。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種提取鴨坦布蘇病毒病卵黃抗體的工藝方法。在保證IgY抗體效價(jià)的同時(shí)，采用劑量少、安全、低毒的脫脂試劑，操作過程中方便，降低生產(chǎn)成本，且IgY純度較高。本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：一種提取鴨坦布蘇病毒病卵黃抗體的工藝方法，包括下列步驟：1)分離卵黃得到卵黃原液，然后加入pH為4.0-5.0的酸化水稀釋，充分?jǐn)嚢杈鶆颍?-8℃下靜置3-6小時(shí)，分離上清液得到卵黃水溶性組分；2)添加適量助濾劑攪拌均勻，然后進(jìn)行微濾；3)將經(jīng)微濾獲得的卵黃水溶性組分與辛酸溶液混合，攪拌均勻后靜置，辛酸和蛋白發(fā)生不可逆反應(yīng)，形成沉淀，所獲得的水溶液即為卵黃抗體IgY的水溶液。本發(fā)明卵黃免疫球蛋白的分離提取工藝，第一步，將酸化水與卵黃原液直接混合充分?jǐn)嚢?，然后靜置，卵黃油脂相互凝集而自然沉淀，沉淀后的上清液為卵黃水溶性組分，即卵黃免疫球蛋白IgY與其它可溶性蛋白的混合物；第二步，在第一步獲得的卵黃水溶性組分中添加適量助濾劑(硅藻土)微濾；第三步，將第二步中濾液與辛酸或辛酸溶液混合，攪拌均勻后靜置，辛酸和蛋白發(fā)生不可逆反應(yīng)，形成沉淀，IgY不與辛酸反應(yīng)，其水溶液即為IgY的水溶液。優(yōu)選的，步驟1)中，酸化水為純化水利用鹽酸調(diào)節(jié)pH為4.0-5.0得到的。優(yōu)選的，步驟1)中，酸化水的pH值為4.5。優(yōu)選的，步驟1)中，在室溫、無菌環(huán)境中分離卵黃得到卵黃原液，然后加入酸化水稀釋n倍體積，其中0<n≤10。優(yōu)選的，步驟1)中，5≤n≤8。優(yōu)選的，步驟1)中，6≤n≤7。優(yōu)選的，步驟1)得到的上清液即卵黃水溶性組分進(jìn)行凍融，-18℃下冷凍后4℃解凍。這樣處理有利于步驟2)的微濾。優(yōu)選的，步驟2)中，助濾劑選自硅藻土，添加量為1％-5％。優(yōu)選的，步驟2)中，助濾劑選自硅藻土，添加量為2％-4％。優(yōu)選的，步驟2)中，微孔過濾時(shí)采用0.45um的微膜。優(yōu)選的，所添加的辛酸終濃度為體積百分比m，其中0<m≤2％。優(yōu)選的，所添加的辛酸終濃度為體積百分比m，其中0<m≤1％。本發(fā)明中以第一步酸化水稀釋脫脂為基礎(chǔ)，這個(gè)方法優(yōu)點(diǎn)是IgY的回收率高，操作方便，成本低廉；但相對(duì)來說非IgY物質(zhì)比較多，容易引起過敏和應(yīng)激，影響IgY作為抗體治療劑的使用效果。第二步中以硅藻土作為助濾幾進(jìn)行微濾，去除一些大分子物質(zhì)、脂蛋白、細(xì)菌等。第三步中辛酸主要用于制染料、藥物、香料、增塑劑、潤滑劑等，也用作防腐劑、殺菌劑的原料。它低毒，微溶于水，與蛋白反應(yīng)形成沉淀；它的防腐、殺菌作用可以減少溶液細(xì)菌的污染，只是很少殘留在水溶液中，對(duì)動(dòng)物影響極小。本發(fā)明的有益效果是：l、低毒：本發(fā)明試劑主要是辛酸，辛酸可用于制染料、藥物、香料、增塑劑、潤滑劑等，也用作防腐劑、殺菌劑的原料。低毒對(duì)機(jī)體刺激較小，與常規(guī)的甲醛、苯酚、氯仿等比起來，更加安全。硅藻土也是無毒安全的，經(jīng)常用來做助濾劑，過濾水中的雜質(zhì)、病毒細(xì)菌等。2、殺菌：辛酸具有殺菌防腐的作用，減少生產(chǎn)中IgY受細(xì)菌的污染，延長保存時(shí)間。3、回收效率高、活性好：本發(fā)明使用的水和辛酸都不會(huì)對(duì)IgY產(chǎn)生影響，絕大部分IgY得到回收。4、獲得IgY純度達(dá)90％以上，辛酸含量低于0.1％，抗體效價(jià)損失小于15％。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說明，但不限于此。實(shí)施例1一種提取鴨坦布蘇病毒病卵黃抗體的工藝方法，包括下列步驟：(1)采集鴨坦布蘇滅活疫苗免疫后高免蛋，經(jīng)檢驗(yàn)消毒后，采取手工或機(jī)械方式分離蛋清和卵黃。按卵黃液體與酸化水1：6體積比加入酸化水(酸化水為純化水利用鹽酸調(diào)節(jié)pH為4.5得到)，并降溫至2-8℃，然后加入卵黃液體，攪拌均勻，2-8℃靜置5小時(shí)，分離上清液。將上清液進(jìn)行-18℃下冷凍后4℃解凍。(2)加入2％硅藻土進(jìn)行微濾，過濾時(shí)采用0.45um的微膜。(3)在濾液加入辛酸溶液，使辛酸的終濃度(v/v)為0.4％，充分?jǐn)嚢?，靜置沉淀，水相部分即為提取的IgY溶液。實(shí)施例2一種提取鴨坦布蘇病毒病卵黃抗體的工藝方法，包括下列步驟：(1)采集鴨坦布蘇滅活疫苗免疫后高免蛋，經(jīng)檢驗(yàn)消毒后，采取手工或機(jī)械方式分離蛋清和卵黃。按卵黃液體與酸化水1：7體積比加入酸化水(酸化水為純化水利用鹽酸調(diào)節(jié)pH為4.3得到)，并降溫至2-8℃，然后加入卵黃液體，攪拌均勻，2-8℃靜置5小時(shí)，分離上清液。將上清液進(jìn)行-18℃下冷凍后4℃解凍。(2)加入3％硅藻土進(jìn)行微濾，過濾時(shí)采用0.45um的微膜。(3)在濾液加入辛酸溶液，使辛酸的終濃度(v/v)為0.3％，充分?jǐn)嚢?，靜置沉淀，水相部分即為提取的IgY溶液。實(shí)施例3一種提取鴨坦布蘇病毒病卵黃抗體的工藝方法，包括下列步驟：(1)采集鴨坦布蘇滅活疫苗免疫后高免蛋，經(jīng)檢驗(yàn)消毒后，采取手工或機(jī)械方式分離蛋清和卵黃。按卵黃液體與酸化水1：5體積比加入酸化水(酸化水為純化水利用鹽酸調(diào)節(jié)pH為4.7得到)，并降溫至2-8℃，然后加入卵黃液體，攪拌均勻，2-8℃靜置5小時(shí)，分離上清液。將上清液進(jìn)行-18℃下冷凍后4℃解凍。(2)加入2％硅藻土進(jìn)行微濾，過濾時(shí)采用0.45um的微膜。(3)在濾液加入辛酸溶液，使辛酸的終濃度(v/v)為0.8％，充分?jǐn)嚢?，靜置沉淀，水相部分即為提取的IgY溶液。實(shí)施例4其他同實(shí)施例1，不同之處在于，酸化水的添加量不同。步驟2)中上清液中加入酸化水稀釋n倍體積，其中0<n≤10，根據(jù)不同的稀釋倍數(shù)，結(jié)果見表1。表l酸化水稀釋法脫脂的效果卵黃濃度原液1∶31∶41∶51∶61∶71∶8分層_不分層不分層分層分層分層分層上清液顏色___黃色淡黃色淡黃色淡黃色上清液/沉淀___5/16/17/18/1AGP(log2)1:64__1：81：81：81：4沉淀AGP___1∶81：81：81：4注：此結(jié)果是靜止24小時(shí)后的結(jié)果。表1中，在卵黃濃度稀釋為l：3和1：4時(shí)，卵黃液不發(fā)生分層；稀釋為1：5倍時(shí)，卵黃液已經(jīng)開始出現(xiàn)水脂分離現(xiàn)象，但上清液中雜蛋白含量較多顏色為黃色不透明，上清液和沉淀的瓊擴(kuò)效價(jià)AGP均為1：8；當(dāng)卵黃為l：6-l：8的濃度下水脂分離現(xiàn)象十分明顯，隨著稀釋度的增加，顏色越接近透明，其中卵黃濃度稀釋為l：6和l：7倍時(shí)，上清液和沉淀的瓊擴(kuò)效價(jià)AGP同為l：8；當(dāng)卵黃濃度為l：8時(shí)，上清液和沉淀的瓊擴(kuò)效價(jià)AGP同為l：4，此時(shí)效價(jià)相對(duì)低于卵黃濃度為1：5、1：6和1：7。綜上所述，卵黃濃度為1：6-1：7時(shí)提取效果較好，抗體效價(jià)高，進(jìn)入沉淀的抗體少。實(shí)施例5其他同實(shí)施例1，不同之處在于，硅藻土的添加量不同。本發(fā)明步驟2)中以硅藻土作為助濾劑進(jìn)行微濾，去除一些大分子物質(zhì)、脂蛋白、細(xì)菌等，硅藻土添加量直接影響微濾速度。根據(jù)硅藻土不同的添加量，結(jié)果見表2。表2硅藻土添加量對(duì)微濾速度的影響硅藻土添加量％012345平均微濾速度ml/min5.907.107.418.638.558.74由表2可知，隨著硅藻土用量加大，微濾速度也增加，在達(dá)到3％后，微濾速度變化不大，為了避免蛋白質(zhì)被硅藻土吸附，選擇3％的添加量為最佳。實(shí)施例6其他同實(shí)施例1，不同之處在于，辛酸的用量。將步驟2)中濾液與辛酸溶液混合，攪拌均勻后靜置，辛酸和蛋白發(fā)生不可逆反應(yīng)，形成沉淀，IgY不與辛酸反應(yīng)，其水溶液即為IgY的水溶液。本發(fā)明中辛酸的用量直接決定IgY溶液中雜蛋白的含量，去除雜蛋白效果的好壞，主要體現(xiàn)在水溶液的澄清度及效價(jià)。根據(jù)步驟3)中辛酸終濃度的不同以及酸化水的稀釋倍數(shù)，結(jié)果見表3。表3辛酸脫脂法效果注：此結(jié)果是靜止24小時(shí)后的結(jié)果。由表3可知，經(jīng)酸化水水稀釋法脫脂后微濾后，卵黃濃度稀釋為l：5倍時(shí)，上清液加入辛酸，終濃度0.8％時(shí)，分層明顯，測定上層液體瓊擴(kuò)效價(jià)AGP為l：8，沉淀效價(jià)為0；沉淀效價(jià)為0，說明沉淀中無抗體，能夠很好的分離提純卵黃抗體。卵黃濃度為1:6時(shí)，加入終濃度為0.2％辛酸，分層但上層液不透明，當(dāng)終濃度提高到0.4％時(shí)，分層明顯且水溶液澄清，且上層卵黃液瓊擴(kuò)效價(jià)為1：8，沉淀AGP為0。卵黃濃度為1:7和1:8的上清液加入辛酸，終濃度為0.2％時(shí)，分層明顯且水溶液澄清，上層卵黃液瓊擴(kuò)效價(jià)為1：8，沉淀AGP為0。因?yàn)槌恋硇r(jià)為0，說明沉淀中無抗體，能夠很好的分離提純卵黃抗體。上述條件組合下都可以很好地分離提純卵黃抗體。實(shí)施例7收集經(jīng)鴨坦布蘇抗原免疫的高免蛋，用清水拭洗掉蛋殼表面的污物和糞便，并用自來水沖干凈，再放入0.5％新潔爾滅溶液中浸泡20min，然后取出晾干。用75％酒精棉擦拭蛋殼，無菌操作打開蛋殼，將蛋清和蛋黃分開，把蛋黃放于滅菌燒杯中，然后充分?jǐn)嚢璐騽?，制成勻漿后分裝備用，即為卵黃原液。取卵黃原液lL與酸化水6L，兩者之比為l：6，直接混合后，攪拌20分鐘充分混勻，2-8℃環(huán)境下靜置5小時(shí)，沉淀后分為2層，底部為卵黃油脂，上清液為卵黃水溶性組分，收集上清液，然后加入3％硅藻土進(jìn)行微濾，在濾液中緩慢加入28m1辛酸，使辛酸終濃度為0.4％，邊加邊搖勻，攪拌均勻后，室溫靜置3-5小時(shí)，上層液即為IgY溶液。平行試驗(yàn)3次，獲得的IgY溶液脫脂率達(dá)到95％以上，辛酸含量低于0.1％，抗體效價(jià)損失小于15％。上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁1 2 3