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一種靶向大鼠磷脂酶Cγ2干擾重組腺病毒、構(gòu)建方法及應(yīng)用與流程

文檔序號:12697343閱讀:來源:國知局

技術(shù)特征:

1.一種靶向大鼠磷脂酶Cγ2干擾重組腺病毒,其特征在于,靶向大鼠磷脂酶Cγ2干擾重組腺病毒是將靶向大鼠磷脂酶Cγ2的寡核苷酸shRNA插入含有腺病毒基因組的骨架質(zhì)粒pHBAd-BHG中得到的,所述寡核苷酸shRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的靶向大鼠磷脂酶Cγ2干擾重組腺病毒構(gòu)建方法,其特征在于,具體包括以下步驟:

步驟1,單鏈shRNA寡核苷酸的合成

步驟1.1,分別合成單鏈shRNA寡核苷酸的F序列和R序列;

其中,F(xiàn)序列為:

AATTCGCCAGCTTCGTGAGAAGATCATTCAAGAGATGATCTTCTCACGAAGCTGGCTTTTTTG;

R序列為:

GATCCAAAAAAGCCAGCTTCGTGAGAAGATCATCTCTTGAATGATCTTCTCACGAAGCTGGCG;

步驟2,重組穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定

步驟2.1,用EcoR I和BamH I雙酶切穿梭載體pHBAd-U6-GFP,凝膠回收線性化的、長序列片段的空載體;

步驟2.2,將合成的F序列、R序列分別用1×TE稀釋成濃度為1μg/1μL,得到F溶液和R溶液,然后將F溶液和R溶液退火,形成退火產(chǎn)物雙鏈F/R;

步驟2.3,將步驟2.2中的雙鏈F/R與步驟2.1中長序列片段的空載體連接,得到重組質(zhì)粒pHBAd-PLCγ2shRNA;

步驟3,靶向大鼠磷脂酶Cγ2干擾重組腺病毒的構(gòu)建

步驟3.1,將HEK293細胞接種于含10%FBS的DMEM完全培養(yǎng)液中,于5%CO2、37℃環(huán)境中培養(yǎng),當細胞密度達到70-80%時,重組質(zhì)粒pHBAd-PLCγ2shRNA和骨架質(zhì)粒pHBAd-BHG經(jīng)轉(zhuǎn)染試劑LipofiterTM介導(dǎo),共轉(zhuǎn)染HEK293細胞,得到細胞混合物;

步驟2.2,將所述細胞混合物接種于含10%FBS的DMEM完全培養(yǎng)液中,按“8”字形晃動,5%CO2、37℃條件下培養(yǎng),6h后更換新鮮的DMEM完全培養(yǎng)液,觀察細胞出毒情況,當細胞漸成葡萄狀并出現(xiàn)噬斑時,將從培養(yǎng)皿底部脫落的細胞收集至離心管中,離心管交替置于液氮和37℃水浴條件下凍融,然后離心,收集上清毒液,即得到Ad-PLCγ2shRNA第1代毒種P1;

步驟2.3,用第一代毒種P1感染密度為90%的HEK293細胞,收集第二代毒種P2;

步驟2.4,用第二代毒種P2感染密度為90%的HEK293細胞,收集第三代毒種P3,所述第三代毒種P3即為靶向大鼠磷脂酶Cγ2干擾重組腺病毒。

3.一種如權(quán)利要求1所述的靶向大鼠磷脂酶Cγ2干擾重組腺病毒在抑制肝細胞增殖中的應(yīng)用。

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