本發(fā)明涉及土壤微生物的培養(yǎng)，尤其是涉及一種定時(shí)循環(huán)的AM真菌擴(kuò)繁及功能實(shí)驗(yàn)裝置和使用方法。
背景技術(shù)：
叢枝菌根(arbuscular mycorrhizae，AM)真菌是自然界分布最廣泛的土壤微生物之一，它能與地球上80％以上的陸生植物形成菌根共生體，在植物個(gè)體、種群、群落和生態(tài)系統(tǒng)等不同層次均具有重要功能，但這些潛在的巨大作用尚未得到充分開(kāi)發(fā)。由于AM真菌是專(zhuān)性活體營(yíng)養(yǎng)微生物，無(wú)性繁殖具有豐富的遺傳多樣性，迄今為止尚不能完全在離體條件下純培養(yǎng)，只能依賴(lài)活體植物對(duì)其進(jìn)行繁殖，這已成為AM真菌分類(lèi)鑒定以及廣泛應(yīng)用的主要屏障。究其原因，菌根共生體生理、共生體系中真菌和宿主的相互關(guān)系尚未揭示。AM真菌的遺傳學(xué)和生物學(xué)的研究有賴(lài)于如何獲得純凈菌體。1955年，Gerdemann發(fā)明了濕篩-傾析法，人類(lèi)才能夠從土壤中直接篩選出AM真菌的各種孢子，AM真菌的研究才取得較大的發(fā)展。1968年，Gilmore采用盆栽法獲得了以孢子、菌絲、菌根根段或侵染土壤多種形式存在的AM真菌繁殖體；1973年，Hattingh等首次建立了隔網(wǎng)分室培養(yǎng)系統(tǒng),開(kāi)展AM真菌生理、生態(tài)功能的一體化研究,為專(zhuān)性共生的AM真菌提供了新的研究思路和方法。1981年，Crush&Hay設(shè)計(jì)了靜止?fàn)I養(yǎng)液培養(yǎng)法，利用白三葉草(Trifolium repens)在滅菌的營(yíng)養(yǎng)液中培養(yǎng)珠狀巨孢囊霉(Gigaspora margarita)；1981年，Mosse&Thompson設(shè)計(jì)了汽霧培養(yǎng)AM真菌系統(tǒng)，成功獲得了AM真菌菌劑；1984年，Elmes&Mosse和Mosse&Thompson分別以玉米(Zea mays)和菜豆(Phaseolus vulgaris)等作為宿主植物，探索AM真菌菌劑的營(yíng)養(yǎng)液流動(dòng)培養(yǎng)技術(shù)；1987年，Mugnier&Mosse利用雙重?zé)o菌培養(yǎng)技術(shù)由Ri T-DNA轉(zhuǎn)基因胡蘿卜根和AM真菌建立的菌根共生體得到孢子；1994年，沈廷厚等為克服盆栽培養(yǎng)的不足，利用盆栽培養(yǎng)原理，巧妙設(shè)計(jì)了溫室苗床擴(kuò)繁AM真菌菌劑和柑桔(Citrus reticulata)砧木幼苗成功接種的簡(jiǎn)易方法；1995年，Redecker等首次提出玻璃珠分室培養(yǎng)技術(shù)，該技術(shù)可以培養(yǎng)大量無(wú)菌真菌孢子，而且真菌易于基質(zhì)分離；2001年，Chen等對(duì)該裝置的培養(yǎng)條件進(jìn)行改進(jìn)，將菌根室中的玻璃珠換成河砂；2001年，F(xiàn)racchiaa從盆栽培養(yǎng)技術(shù)獲得啟示，設(shè)計(jì)了一個(gè)獲得單孢AM真菌培養(yǎng)技術(shù)。我國(guó)在AM真菌的培養(yǎng)和擴(kuò)繁領(lǐng)域，先后有數(shù)個(gè)專(zhuān)利獲得授權(quán)，中國(guó)專(zhuān)利ZL00132468.3公開(kāi)一種以玻璃珠為培養(yǎng)基質(zhì)的AM真菌的培養(yǎng)，主要涉及一種使用特定培養(yǎng)裝置及培養(yǎng)介質(zhì)的AM真菌的分室培養(yǎng)方法，該方法表明對(duì)于產(chǎn)孢能力強(qiáng)的AM真菌地表球囊霉(Glomus versiforme)在真菌生長(zhǎng)室中可以獲得多至20mg干重的菌體，每盆獲得的孢子數(shù)以萬(wàn)計(jì)。中國(guó)專(zhuān)利ZL200610165326.5公開(kāi)一種提高礦區(qū)復(fù)墾效果的叢枝菌根菌劑培養(yǎng)方法，將沙土栽培基質(zhì)更換為以沙土、沸石和珍珠巖(10：10：1m/m/m)混合組成的基質(zhì)，由于沸石(ρ＝1.0g/mL)和珍珠巖(ρ＝0.1g/mL)的密度比沙土(ρ＝1.5g/mL)小，在相同體積時(shí)，該混合基質(zhì)的重量要比單純沙土的重量輕很多,而且混合基質(zhì)培養(yǎng)出的菌根菌劑質(zhì)量?jī)?yōu)于沙土和礦區(qū)廢棄物粉煤灰基質(zhì)，適于野外遠(yuǎn)距離運(yùn)輸攜帶,為叢枝菌根技術(shù)在礦區(qū)大規(guī)模復(fù)墾應(yīng)用提供一種高效方法。中國(guó)專(zhuān)利ZL201420440445.7公開(kāi)一種復(fù)合式AM真菌分室培養(yǎng)裝置，主要涉及特殊微生物的培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，將AM真菌的傳統(tǒng)基質(zhì)培養(yǎng)與無(wú)土培養(yǎng)結(jié)合，提供一種可用于研究AM真菌培養(yǎng)和生理機(jī)制的復(fù)合式AM真菌分室培養(yǎng)裝置。但是該培養(yǎng)系統(tǒng)仍處于一個(gè)開(kāi)放的操作環(huán)境，操作復(fù)雜，所采用的培養(yǎng)基質(zhì)易攜帶其他外源微生物。中國(guó)專(zhuān)利ZL201420763337.3公開(kāi)一種采用人工培養(yǎng)基開(kāi)展AM真菌純培養(yǎng)的分室培養(yǎng)裝置，該專(zhuān)利基于發(fā)根農(nóng)桿菌的Ri質(zhì)粒上的T-DNA轉(zhuǎn)移到胡蘿卜肉質(zhì)根，可以促使胡蘿卜根產(chǎn)生大量毛狀根，設(shè)計(jì)了人工培養(yǎng)基開(kāi)展AM真菌純培養(yǎng)的分室培養(yǎng)裝置，可以得到大量純凈繁殖體，而且可以用于研究AM真菌與宿主根系之間關(guān)系，如C-P分配。該專(zhuān)利的最大缺點(diǎn)是宿主材料為植物根系無(wú)法進(jìn)行光合作用產(chǎn)生光合產(chǎn)物，違背了植物與宿主植物在自然環(huán)境中的共生關(guān)系。綜上所述，以上專(zhuān)利所設(shè)計(jì)的培養(yǎng)裝置基本處于改善培養(yǎng)基質(zhì)優(yōu)化AM真菌菌劑，而將菌劑擴(kuò)繁與AM真菌功能特性研究相結(jié)合的甚少。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的上述不足，提供一種定時(shí)循環(huán)的AM真菌擴(kuò)繁及功能實(shí)驗(yàn)裝置和使用方法。
所述定時(shí)循環(huán)的AM真菌擴(kuò)繁及功能實(shí)驗(yàn)裝置設(shè)有培養(yǎng)箱蓋、培養(yǎng)箱、培養(yǎng)基質(zhì)、同位素等添加空間、菌絲室、排水箱蓋、排水箱、過(guò)濾泵、植物生長(zhǎng)室、噴嘴調(diào)控鉤和尼龍網(wǎng)；所述培養(yǎng)箱蓋蓋在培養(yǎng)箱上，培養(yǎng)箱由縱向網(wǎng)分割成菌絲室和植物生長(zhǎng)室，培養(yǎng)基質(zhì)和同位素等添加空間放置在菌絲室內(nèi)，培養(yǎng)箱的底部設(shè)有排水孔；排水箱設(shè)在培養(yǎng)箱底部，排水箱蓋蓋在排水箱上，過(guò)濾泵設(shè)在排水箱內(nèi)，噴嘴調(diào)控鉤和尼龍網(wǎng)設(shè)在植物生長(zhǎng)室內(nèi)，噴嘴調(diào)控鉤上設(shè)有霧化噴嘴，所述霧化噴嘴與過(guò)濾泵之間由PVC軟管連接，植物生長(zhǎng)室的頂部設(shè)植物固定裝置。
所述培養(yǎng)基質(zhì)可采用陶粒或玻璃珠等，所述陶粒的直徑可為5mm，玻璃珠的直徑可為2mm；所述植物固定裝置可采用固定管，所述固定管可采用針管或PVC管，所述過(guò)濾泵上可設(shè)定時(shí)器，所述過(guò)濾泵可采用小型微過(guò)濾泵，所述小型微過(guò)濾泵可采用HJ-1500型小型微過(guò)濾泵，25W，1500L/h，流量可調(diào)節(jié)。
所述尼龍網(wǎng)可采用不同孔徑的尼龍網(wǎng)，所述尼龍網(wǎng)可設(shè)上層尼龍網(wǎng)和下層尼龍網(wǎng)，上層尼龍網(wǎng)的孔徑為1mm，下層尼龍網(wǎng)的孔徑為30μm，上層尼龍網(wǎng)設(shè)在植物生長(zhǎng)室高度12cm處，下層尼龍網(wǎng)設(shè)在植物生長(zhǎng)室高度6cm處。所述排水孔上可覆蓋尼龍網(wǎng)。
所述植物生長(zhǎng)室的尺寸可為20cm×20cm×20cm。
所述定時(shí)循環(huán)的AM真菌擴(kuò)繁及功能實(shí)驗(yàn)裝置的使用方法如下：
1)基本材料準(zhǔn)備
A植物材料：所述植物材料可選自宿主植物、白三葉(Trifolium repens)、長(zhǎng)夜車(chē)前草(Plantago lanceolata)、紅樹(shù)秋茄(Kandelia candel)等。所述宿主植物可采用玉米(Zea mays)等。
其中，玉米(Zea mays)，一年生禾本科草本植物，單子葉C4植物，須根系。選擇玉米作為宿主植物，是基于其根系發(fā)達(dá)、生物量大，可與多種AM真菌共生，進(jìn)而獲取大量的侵染根段、孢子等繁殖體，是良好的宿主植物；
B培養(yǎng)基質(zhì)：陶?；虿Ａе?；
植物種子使用10％(v/v)H2O2滅菌5min，然后用無(wú)菌蒸餾水沖洗干凈，培養(yǎng)在28℃的恒溫箱中預(yù)發(fā)芽；兩格組合塑料箱、苗缽采用84消毒液和70％酒精滅菌，其它均需在121℃下高壓蒸汽滅菌30min。
所述陶?？刹捎弥睆綖?mm陶?；蛑睆綖?mm玻璃珠。
2)培養(yǎng)系統(tǒng)的建立
5天后，預(yù)發(fā)芽的種子移栽至已滅菌的苗缽，苗缽中先添加600g沙土和沸石，按質(zhì)量比，沙土︰沸石為3︰1，滅菌混合物(121℃，30min)，然后鋪一層菌根接種劑(按質(zhì)量比，接種劑量一般為生長(zhǎng)基質(zhì)總量的5％～10％)，接著添加200g滅菌基質(zhì)，每天澆灌無(wú)菌水(含水量達(dá)20％左右)，每3天澆一次1/4改良Hoagland營(yíng)養(yǎng)液，植物在能夠控制光照和溫度的溫室中進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)4周后，取出植物幼苗，用無(wú)菌水沖洗干凈，隨機(jī)選取植物根系采用曲利苯藍(lán)染色-方格交叉法測(cè)定根系侵染率，之后移栽大小均一的幼苗到植物生長(zhǎng)室頂部針管裝置中，用無(wú)菌棉固定植物。分室底部排水箱添加4L 1/4改良Hoagland營(yíng)養(yǎng)液，開(kāi)啟定時(shí)的過(guò)濾泵，調(diào)節(jié)霧化噴嘴為植物提供生長(zhǎng)必需營(yíng)養(yǎng)，整個(gè)系統(tǒng)形成定時(shí)循環(huán)設(shè)計(jì)。
所述改良Hoagland營(yíng)養(yǎng)液的配方為：
磷酸二氫鉀136g/L，硝酸鉀101g/L，硝酸鈣236g/L，硫酸鎂246.5g/L，硼酸2.86g/L，氯化錳1.81g/L，硫酸鋅0.22g/L，硫酸銅0.08g/L，錳酸0.02g/L，硫酸亞鐵5.57g/L，乙二胺四乙酸7.45g/L；其中P元素含量要低于20μg/g。
3)培養(yǎng)過(guò)程：
培養(yǎng)過(guò)程在溫室中進(jìn)行，育苗前期在培養(yǎng)基質(zhì)表面覆蓋一層黑色塑料薄膜，植物地上部保持在外部，這樣可以防止水分過(guò)度蒸發(fā)和藻類(lèi)植物生長(zhǎng)，避免外源污染。植物幼苗移栽到分室裝置后，可以根據(jù)植物需要調(diào)節(jié)澆灌時(shí)間和營(yíng)養(yǎng)水平。培養(yǎng)過(guò)程中可透過(guò)視窗隨時(shí)觀察較細(xì)菌根穿過(guò)上層尼龍網(wǎng)(1mm尼龍網(wǎng))伸展到根系微生長(zhǎng)空間(或區(qū)隔室)，也可以觀察菌絲穿過(guò)下層尼龍網(wǎng)(30μm尼龍網(wǎng))進(jìn)入菌絲體生長(zhǎng)室，開(kāi)展根外菌絲功能研究。
本發(fā)明彌補(bǔ)了現(xiàn)有AM真菌培養(yǎng)技術(shù)和應(yīng)用技術(shù)的不足，提供一種高效的AM真菌純培養(yǎng)和功能研究裝置，即以玻璃珠/陶粒培養(yǎng)基質(zhì)與汽霧培養(yǎng)系統(tǒng)相結(jié)合的定時(shí)循環(huán)AM真菌分室培養(yǎng)裝置，該裝置采用特殊的培養(yǎng)介質(zhì)和裝置設(shè)計(jì)，區(qū)隔宿主植物和AM真菌的生長(zhǎng)空間，并且植物根系處于在無(wú)菌密閉的容器中栽培，可以有效免除植物生長(zhǎng)基質(zhì)以及外源物質(zhì)對(duì)真菌的潛在污染，且在菌根共生體建立之后，可以用于研究AM真菌根外菌絲的特征及其功能，也可以用于收集易于基質(zhì)分離的純凈AM真菌菌絲和孢子繁殖體。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：
1)本發(fā)明所述定時(shí)循環(huán)的AM真菌擴(kuò)繁及功能實(shí)驗(yàn)裝置將特殊基質(zhì)(玻璃珠/陶粒)與定時(shí)循環(huán)的汽霧水培系統(tǒng)結(jié)合，使設(shè)計(jì)操作簡(jiǎn)單、培養(yǎng)周期短、培養(yǎng)過(guò)程可控、資源循環(huán)利用，不僅大大提高純凈AM真菌繁殖體的培養(yǎng)效率，而且可進(jìn)一步探討AM真菌的生理機(jī)制和生態(tài)功能。
2)整個(gè)植物根系生長(zhǎng)在無(wú)菌密閉的暗箱中，符合根系生境，根系生長(zhǎng)所需氧氣由水循環(huán)和菌絲室保氣性良好的基質(zhì)提供；
3)本發(fā)明將右邊的植物生長(zhǎng)室垂直方向添加上下間隔的上層尼龍網(wǎng)和下層尼龍網(wǎng)，可以區(qū)分研究粗根和較細(xì)根系的繁殖體產(chǎn)出率和侵染率，同時(shí)上層尼龍網(wǎng)和下層尼龍網(wǎng)均為菌絲提供“附著枝”，利于菌絲橫向生長(zhǎng)，延伸至菌絲室。
4)不同孔徑的上層尼龍網(wǎng)和下層尼龍網(wǎng)分隔形成菌絲室和植物生長(zhǎng)室，這樣可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)的不同、生理生化等指標(biāo)而對(duì)根外菌絲和植物設(shè)置不同處理來(lái)開(kāi)展相關(guān)研究。
5)本發(fā)明使用的定時(shí)循環(huán)的AM真菌擴(kuò)繁及功能實(shí)驗(yàn)裝置，材料價(jià)格便宜，可以多次使用，秉承節(jié)約環(huán)保方針。
6)該定時(shí)循環(huán)的AM真菌擴(kuò)繁及功能實(shí)驗(yàn)裝置安裝了定時(shí)器，可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求和植物生長(zhǎng)，設(shè)置營(yíng)養(yǎng)液供給時(shí)間，減少試驗(yàn)成本。
7)該定時(shí)循環(huán)的AM真菌擴(kuò)繁及功能實(shí)驗(yàn)裝置具備了玻璃珠分室培養(yǎng)系統(tǒng)最顯著的優(yōu)點(diǎn)，即真菌易于和培養(yǎng)基質(zhì)分離。
8)利用定時(shí)循環(huán)汽霧培養(yǎng)系統(tǒng)代替水培，同時(shí)設(shè)計(jì)噴嘴方位調(diào)控裝置，營(yíng)養(yǎng)液循環(huán)可以為無(wú)菌密閉裝置內(nèi)植物根系和AM真菌提供源源不斷的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)避免水質(zhì)惡化影響植物生長(zhǎng)和帶來(lái)其它污染。
9)本發(fā)明的定時(shí)循環(huán)的AM真菌擴(kuò)繁及功能實(shí)驗(yàn)裝置系統(tǒng)無(wú)需為菌絲室添加額外水源，汽霧顆粒漂浮可以緩慢穿過(guò)尼龍網(wǎng)，保證菌絲室保持一定的濕度。
10)本發(fā)明為獲得純凈AM真菌繁殖體和研究其生態(tài)功能和生理機(jī)制提供機(jī)會(huì)，也為未來(lái)發(fā)展培養(yǎng)基培養(yǎng)AM真菌提供可能。
附圖說(shuō)明
圖1為本發(fā)明所述定時(shí)循環(huán)的AM真菌擴(kuò)繁及功能實(shí)驗(yàn)裝置實(shí)施例及使用方法示意圖。
具體實(shí)施方式
以下實(shí)施例將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明。
參見(jiàn)圖1，所述定時(shí)循環(huán)的AM真菌擴(kuò)繁及功能實(shí)驗(yàn)裝置實(shí)施例設(shè)有培養(yǎng)箱蓋1、培養(yǎng)箱2、培養(yǎng)基質(zhì)3、同位素等添加空間4、菌絲室5、排水箱蓋7、排水箱8、過(guò)濾泵9、植物生長(zhǎng)室10、噴嘴調(diào)控鉤11和尼龍網(wǎng)13；所述培養(yǎng)箱蓋1蓋在培養(yǎng)箱2上，培養(yǎng)箱2由縱向網(wǎng)分割成菌絲室5和植物生長(zhǎng)室10，培養(yǎng)基質(zhì)3和同位素等添加空間4放置在菌絲室5內(nèi)，培養(yǎng)箱2的底部設(shè)有排水孔6；排水箱8設(shè)在培養(yǎng)箱2底部，排水箱蓋7蓋在排水箱8上，過(guò)濾泵9設(shè)在排水箱8內(nèi)，噴嘴調(diào)控鉤11和尼龍網(wǎng)13設(shè)在植物生長(zhǎng)室10內(nèi)，噴嘴調(diào)控鉤11上設(shè)有霧化噴嘴16，所述霧化噴嘴16與過(guò)濾泵9之間由PVC軟管12連接，植物生長(zhǎng)室10的頂部設(shè)植物固定裝置14。
所述培養(yǎng)基質(zhì)3采用陶?；虿Ａе榈?，所述陶粒的直徑為5mm，玻璃珠的直徑為2mm；所述植物固定裝置14采用固定管，所述固定管采用針管或PVC管，所述過(guò)濾泵9上設(shè)定時(shí)器15，所述過(guò)濾泵9采用小型微過(guò)濾泵，所述小型微過(guò)濾泵采用HJ-1500型小型微過(guò)濾泵，25W，1500L/h，流量可調(diào)節(jié)。
所述排水孔6上可覆蓋尼龍網(wǎng)13。
所述植物生長(zhǎng)室10的尺寸可為20cm×20cm×20cm，所述尼龍網(wǎng)13可設(shè)上層尼龍網(wǎng)和下層尼龍網(wǎng)，上層尼龍網(wǎng)的孔徑為1mm，下層尼龍網(wǎng)的孔徑為30μm，上層尼龍網(wǎng)設(shè)在植物生長(zhǎng)室10高度12cm處，下層尼龍網(wǎng)設(shè)在植物生長(zhǎng)室10高度6cm處。
本發(fā)明所述定時(shí)循環(huán)的AM真菌擴(kuò)繁及功能實(shí)驗(yàn)裝置采用長(zhǎng)方體兩格塑料箱與特定孔徑的尼龍網(wǎng)，加工成兩分室，外加兩格排水箱和配備定時(shí)器的過(guò)濾泵(可采用小型微過(guò)濾泵)，使得整個(gè)系統(tǒng)處于密閉環(huán)流狀態(tài)(參見(jiàn)圖1)。2個(gè)分室中，左邊分室為菌絲生長(zhǎng)或植物生長(zhǎng)室(20cm×20cm×20cm)，右邊分室為植物生長(zhǎng)室(20cm×20cm×20cm)，植物生長(zhǎng)室的12cm高度處粘貼一層孔徑為1mm的上層尼龍網(wǎng)，6cm處粘貼一層孔徑為30μm的下層尼龍網(wǎng)，中間6cm為植物較細(xì)根系生長(zhǎng)空間。上層尼龍網(wǎng)可以固定植物根系，防止培養(yǎng)前期植物幼苗掉落于培養(yǎng)箱底部以及避免植物老根和死根影響菌絲和孢子繁殖，也可以區(qū)分研究粗根和較細(xì)根侵染率；下層尼龍網(wǎng)可以固定和收集新鮮的菌絲和孢子，同時(shí)兩層尼龍網(wǎng)均為菌絲提供“附著枝”，利于菌絲橫向生長(zhǎng)，延伸至菌絲生長(zhǎng)室。兩格塑料箱的中間5mm厚隔板打孔，以底部3cm為基準(zhǔn)，頂部留2cm，中間15cm部分均勻地打孔(直徑為5mm)，然后隔板兩邊分別粘貼尼龍網(wǎng)，形成5mm寬間隙，減少兩側(cè)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)自由擴(kuò)散，尼龍網(wǎng)只允許根外菌絲穿過(guò)而阻止植物根系的伸展，所以只有AM真菌能夠在菌絲體生長(zhǎng)室中生長(zhǎng)。每個(gè)分室的底部打6個(gè)排水孔(直徑為5mm)并配套2cm長(zhǎng)水管，孔口覆蓋尼龍網(wǎng)，防止菌絲、孢子等流失和降低污染。另外，在分室底部放置一個(gè)塑料箱(40cm×40cm×20cm)，底部塑料箱的蓋子上打6個(gè)孔(直徑為5mm)，與上部排水管對(duì)接用于回收營(yíng)養(yǎng)液。然后在營(yíng)養(yǎng)液回收箱中用防水膠帶將小型微循環(huán)過(guò)濾泵(HJ-1500，25W，1500L/h，流量可調(diào)節(jié))粘附在箱子邊緣，泵出水口接1m耐高溫抗壓強(qiáng)的PVC軟管(直徑為20mm)，另一端從植物生長(zhǎng)室外壁14cm高度處穿過(guò)，接霧化噴嘴，然后用鐵絲溝固定，采用定時(shí)器控時(shí)，每隔2min汽霧化15min。為防止移栽植物攜帶外源污染，在植物生長(zhǎng)室蓋子中間打1個(gè)孔(直徑為3cm)，將60mL針管末端3cm切割并粘貼在孔口或PVC管(直徑為3cm)，固定移栽植物。植物生長(zhǎng)室不添加任何基質(zhì)，采用營(yíng)養(yǎng)液霧化供應(yīng)植物必需營(yíng)養(yǎng)。菌絲生長(zhǎng)室中填充陶粒，具有質(zhì)輕、隔水保氣特性；若填充玻璃珠，具有表面光滑、比重相對(duì)較重的特性，二者均易和AM真菌根外菌絲分離。最后采用防水密封膠將上下塑料箱的邊緣以及培養(yǎng)箱蓋子邊緣密封防止外源污染，構(gòu)建成無(wú)菌密閉循環(huán)系統(tǒng)。
以下給出具體實(shí)施例。
所述定時(shí)循環(huán)的AM真菌擴(kuò)繁及功能實(shí)驗(yàn)裝置的使用方法如下：
1)基本材料準(zhǔn)備
A植物材料：所述植物材料可選自宿主植物、白三葉(Trifolium repens)、長(zhǎng)夜車(chē)前草(Plantago lanceolata)、紅樹(shù)秋茄(Kandelia candel)等。所述宿主植物可采用玉米(Zea mays)等。
其中，玉米(Zea mays)，一年生禾本科草本植物，單子葉C4植物，須根系。選擇玉米作為宿主植物，是基于其根系發(fā)達(dá)、生物量大，可與多種AM真菌共生，進(jìn)而獲取大量的侵染根段、孢子等繁殖體，是良好的宿主植物；
B培養(yǎng)基質(zhì)：陶粒(直徑為5mm)或玻璃珠(直徑為2mm)；
植物種子使用10％(v/v)H2O2滅菌5min，然后用無(wú)菌蒸餾水沖洗干凈，培養(yǎng)在28℃的恒溫箱中預(yù)發(fā)芽；兩格組合塑料箱、苗缽采用84消毒液和70％酒精滅菌，其它均需在121℃下高壓蒸汽滅菌30min。
2)培養(yǎng)系統(tǒng)的建立
5天后，預(yù)發(fā)芽的種子移栽至已滅菌的苗缽，苗缽中先添加600g沙土和沸石，按質(zhì)量比，沙土︰沸石為3︰1，滅菌混合物(121℃，30min)，然后鋪一層菌根接種劑(按質(zhì)量比，接種劑量一般為生長(zhǎng)基質(zhì)總量的5％～10％)，接著添加200g滅菌基質(zhì)，每天澆灌無(wú)菌水(含水量達(dá)20％左右)，每3天澆一次1/4改良Hoagland營(yíng)養(yǎng)液，植物在能夠控制光照和溫度的溫室中進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)4周后，取出植物幼苗，用無(wú)菌水沖洗干凈，隨機(jī)選取植物根系采用曲利苯藍(lán)染色-方格交叉法測(cè)定根系侵染率，之后移栽大小均一的幼苗到植物生長(zhǎng)室頂部針管裝置中，用無(wú)菌棉固定植物。分室底部排水箱添加4L 1/4改良Hoagland營(yíng)養(yǎng)液，開(kāi)啟定時(shí)的過(guò)濾泵，調(diào)節(jié)霧化噴嘴為植物提供生長(zhǎng)必需營(yíng)養(yǎng)，整個(gè)系統(tǒng)形成定時(shí)循環(huán)設(shè)計(jì)。
所述改良Hoagland營(yíng)養(yǎng)液的配方為：
磷酸二氫鉀136g/L，硝酸鉀101g/L，硝酸鈣236g/L，硫酸鎂246.5g/L，硼酸2.86g/L，氯化錳1.81g/L，硫酸鋅0.22g/L，硫酸銅0.08g/L，錳酸0.02g/L，硫酸亞鐵5.57g/L，乙二胺四乙酸7.45g/L；其中P元素含量要低于20μg/g。
3)培養(yǎng)過(guò)程：
培養(yǎng)過(guò)程在溫室中進(jìn)行，育苗前期在培養(yǎng)基質(zhì)表面覆蓋一層黑色塑料薄膜，植物地上部保持在外部，這樣可以防止水分過(guò)度蒸發(fā)和藻類(lèi)植物生長(zhǎng)，避免外源污染。植物幼苗移栽到分室裝置后，可以根據(jù)植物需要調(diào)節(jié)澆灌時(shí)間和營(yíng)養(yǎng)水平。培養(yǎng)過(guò)程中可透過(guò)視窗隨時(shí)觀察較細(xì)菌根穿過(guò)上層尼龍網(wǎng)(1mm尼龍網(wǎng))伸展到根系微生長(zhǎng)空間(或區(qū)隔室)，也可以觀察菌絲穿過(guò)下層尼龍網(wǎng)(30μm尼龍網(wǎng))進(jìn)入菌絲體生長(zhǎng)室，開(kāi)展根外菌絲功能研究。
一般培養(yǎng)周期為10周左右。在培養(yǎng)2周后，玉米新生根系開(kāi)始穿過(guò)1000μm尼龍網(wǎng)，產(chǎn)生根外菌絲，生成的菌絲具有較強(qiáng)的分枝能力和侵染潛力。培養(yǎng)4周后，一些菌絲穿過(guò)30μm尼龍網(wǎng)進(jìn)入菌絲室，從而研究AM真菌功能，其方法如下：1)提供大量純凈的AM真菌孢子、菌絲等繁殖體，為遺傳學(xué)和生物學(xué)的研究提供可能；2)33P、15N等同位素標(biāo)記的植物凋落物、秸稈碎樣用30μm尼龍網(wǎng)包裹，放置在菌絲室，研究根外菌絲對(duì)N、P等元素的吸收能力；3)采用密閉透明的玻璃罩/塑料袋將植物地上部罩住，進(jìn)行13CO2標(biāo)記，研究C—P或C—N分配模式，也可以研究CO2濃度升高對(duì)AM真菌繁殖體產(chǎn)生，以及AM真菌與宿主植物之間關(guān)系的影響；4)調(diào)節(jié)定時(shí)器控制泵水間隔時(shí)間，研究AM真菌對(duì)干旱/水淹脅迫的響應(yīng)機(jī)制；5)模擬紅樹(shù)植物潮間帶生境(潮汐)，探究AM真菌侵染對(duì)紅樹(shù)植物的影響；6)實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，在排水箱中配制不同重金屬(Cd、Pb等)濃度的營(yíng)養(yǎng)液，水泵將溶液以汽霧的形式噴灑于植物根系，研究重金屬對(duì)AM真菌繁殖體、宿主植物以及二者之間的關(guān)系的影響；7)本專(zhuān)利可以將菌絲室更換，使其與右邊植物生長(zhǎng)室相同，進(jìn)而開(kāi)展AM真菌對(duì)植物種內(nèi)/種間競(jìng)爭(zhēng)的調(diào)控；8)裝置更換后，采用13CO2示蹤法研究AM真菌吸收植物20％的光合產(chǎn)物的轉(zhuǎn)換和傳輸過(guò)程。本發(fā)明設(shè)計(jì)了定時(shí)循環(huán)系統(tǒng)為宿主植物提供均一的營(yíng)養(yǎng)液(如pH、營(yíng)養(yǎng)組分等相同)，可以單一探究AM真菌的功能。
試驗(yàn)結(jié)束后，即可拆卸裝置，取出菌絲室中的培養(yǎng)基質(zhì)(陶粒/玻璃珠)，將菌絲體內(nèi)的真菌繁殖材料連同玻璃珠一起轉(zhuǎn)移到150μm網(wǎng)篩上，用蒸餾水小心沖洗，底部配制38μm網(wǎng)篩回收AM真菌繁殖體。若菌絲室中以玻璃珠為培養(yǎng)基質(zhì)，可以直接將真菌繁殖材料連同玻璃珠慢慢傾倒在盛有蒸餾水的塑料杯中，因?yàn)椴Ａе檩^重所以會(huì)快速沉入杯底，而孢子和菌絲體都懸浮于水面，然后用38μm的網(wǎng)篩回收純凈的真菌材料，連續(xù)重復(fù)3次即可把所有的菌絲體和孢子回收。本發(fā)明也將植物生長(zhǎng)室分隔為三個(gè)區(qū)間，上層為宿主植物粗根系產(chǎn)生的AM真菌繁殖體，中層為植物較細(xì)根系產(chǎn)生的AM真菌繁殖體，下層為單一的菌絲和孢子。若研究需要也可以對(duì)比粗根系與細(xì)根系的侵染水平和繁殖體的質(zhì)量。