本發(fā)明涉及纖維素降解領域，具體地，涉及一株左氏鏈霉菌(streptomycesdrozdowiczii)及其發(fā)酵產物和在降解纖維素中用途。

背景技術：

我國是農業(yè)大國，各類農作物秸稈資源十分豐富，但當秸稈直接還田后在土壤中分解轉化的周期長，難以作為當季作物的肥源。同時，每年約有30％的剩余作物秸稈不能有效得到處理和利用，在收割季節(jié)秸稈被集中焚燒的現(xiàn)象日益突出，污染空氣并危害人們的身體健康。使用傳統(tǒng)的物化方法，如酸處理、堿處理以及蒸汽加熱等方法處理秸稈等纖維素，存在反應條件劇烈、設備昂貴、成本較高、帶來新的環(huán)境污染等問題。而利用投加纖維素高效降解菌的方法經濟、有效，正逐漸成為當前的研究熱點。

目前獲得的產纖維素酶微生物的纖維素內切酶活和濾紙酶活均較低，例如，limaa報導的左氏鏈霉菌最高內切酶活可達0.595u/ml(見limaa,nascimentor,bone,etal.streptomycesdrozdowicziicellulaseproductionusingagro-industrialby-productsanditspotentialuseinthedetergentandtextileindustries[j].enzymeandmicrobialtechnology,2005,37(2):272-277)；趙方圓等人的研究表明：纖維素降解菌aspergillussp.yn1內切酶活及總酶活可達到0.553u/ml和0.15u/ml(見趙方圓和范寧杰等,纖維素降解菌aspergillussp.yn1的產酶條件及酶學特性[j].微生物學通報,2010,37(8):1194-1199)；黃寧珍等研究的纖維素降解真菌34內切酶和總酶活能達到325.67u/l和144.14u/l(見黃寧珍和付傳明等,纖維素降解真菌分離篩選、產酶特性及高效水解菌系的初步構建[j].西南農業(yè)學報,2010,23(5):1489-1496)。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一株能夠降解纖維素的左氏鏈霉菌及其發(fā)酵產物和用途。

為了實現(xiàn)上述目的，第一方面，本發(fā)明提供了一種左氏鏈霉菌，該左氏鏈霉菌的保藏編號為cgmccno.13409。

第二方面，本發(fā)明提供了培養(yǎng)第一方面所述的左氏鏈霉菌的方法，包括：將所述左氏鏈霉菌接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵。

第三方面，本發(fā)明提供了根據第二方面所述的方法得到的發(fā)酵產物。

第四方面，本發(fā)明提供了一種降解纖維素的方法，包括：將降解劑與含纖維素的原料接觸，所述降解劑為第一方面所述的左氏鏈霉菌和/或第一方面所述的左氏鏈霉菌的發(fā)酵產物。

第五方面，本發(fā)明提供了第一方面所述的左氏鏈霉菌和/或第一方面所述的左氏鏈霉菌的發(fā)酵產物在降解纖維素中的用途。

本發(fā)明的左氏鏈霉菌能夠降解纖維素，其發(fā)酵產物同時具有纖維素內切酶、纖維素外切酶、β-葡萄糖苷酶、木質素過氧化物酶、錳過氧化物酶和漆酶酶活，且酶活性較高。

本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點將在隨后的具體實施方式部分予以詳細說明。

生物保藏

本發(fā)明的左氏鏈霉菌(streptomycesdrozdowiczii)，于2016年12月2日被保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，郵政編碼：100101)(保藏單位的縮寫為cgmcc)，保藏編號為cgmccno.13409。

附圖說明

附圖是用來提供對本發(fā)明的進一步理解，并且構成說明書的一部分，與下面的具體實施方式一起用于解釋本發(fā)明，但并不構成對本發(fā)明的限制。在附圖中：

圖1是經和不經本發(fā)明菌株處理的小麥秸稈的ftir分析結果圖。

具體實施方式

以下對本發(fā)明的具體實施方式進行詳細說明。應當理解的是，此處所描述的具體實施方式僅用于說明和解釋本發(fā)明，并不用于限制本發(fā)明。

在本文中所披露的范圍的端點和任何值都不限于該精確的范圍或值，這些范圍或值應當理解為包含接近這些范圍或值的值。對于數(shù)值范圍來說，各個范圍的端點值之間、各個范圍的端點值和單獨的點值之間，以及單獨的點值之間可以彼此組合而得到一個或多個新的數(shù)值范圍，這些數(shù)值范圍應被視為在本文中具體公開。

在本發(fā)明中，在未作相反說明的情況下，使用的術語“酶活力”的大小即酶含量的多少，用酶活力單位表示，即酶單位(u)，本發(fā)明中酶單位的定義是：對于纖維素內切酶活和濾紙酶活，采用dns法測定，以每分鐘催化纖維素水解產生1μg的葡萄糖所需要的酶量為1個酶活力單位，即1u＝1μg/min，對于木質素過氧化物酶、錳過氧化物酶和漆酶，采用紫外分光光度法測定，用每分鐘吸光度值增加0.1的酶量來表示1個酶活力單位?！懊傅谋然盍Α贝砻繂挝惑w積樣品的催化能力，能夠反應酶活大小，其值越大，表明酶活越高，比活力的計算公式為：比活力(u/ml)＝總酶活力單位數(shù)/ml樣品，本發(fā)明中，“酶活”與“酶活力”可互換使用。“濾紙酶活”亦稱總酶活，指纖維素內切酶、纖維素外切酶和β-葡萄糖苷酶的總酶活。

本發(fā)明提供的左氏鏈霉菌的保藏編號為cgmccno.13409。該菌株在pda培養(yǎng)基上生長呈白色扁平狀(肉眼觀察)，在掃描式電子顯微鏡(sem)下觀察為長桿狀、圓柱形；其生長快速，產纖維素酶能力強，降解秸稈效果明顯，可應用于大田秸稈助腐，對大田耕種啟到很好的促進作用，有助于提高土壤肥力(增加土壤中n、p、k含量)，增強農作物所需營養(yǎng)物質，促進植物生長，具有廣闊的應用前景。

本發(fā)明提供的培養(yǎng)上述左氏鏈霉菌的方法包括：將所述左氏鏈霉菌接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵。

通常地，相對于每升的發(fā)酵培養(yǎng)基，所述左氏鏈霉菌的接種量為20-30mg(以干重計)。

本發(fā)明中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基可以為各種常規(guī)的能夠為左氏鏈霉菌提供營養(yǎng)物質的培養(yǎng)基，可以為pda培養(yǎng)基，也可以為含羧甲基纖維素鈉的培養(yǎng)基，例如，每升的發(fā)酵培養(yǎng)基可以含有羧甲基纖維素鈉(cmc-na，或淀粉)12-15g，nacl4-5g，kh2po40.5-1g，mgso40.2-0.5g，蛋白胨(或牛肉膏)12-15g，酵母粉4-5g。一般地，如果進行固體培養(yǎng)，每升的發(fā)酵培養(yǎng)基還可以含有瓊脂18-20g。

對發(fā)酵的條件沒有特別的要求，為了獲得酶活力更優(yōu)的發(fā)酵清液，優(yōu)選地，所述發(fā)酵的條件包括：溫度為28-35℃，時間為2-4天，ph值為6-8。

本發(fā)明中，所述方法還可以包括在發(fā)酵前對左氏鏈霉菌依次進行活化和種子培養(yǎng)，活化是為了將保藏狀態(tài)的菌種放入適宜的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使其恢復發(fā)酵性能；種子培養(yǎng)是為了得到較多的純而壯的培養(yǎng)物，即獲得活力旺盛、接種數(shù)量足夠的左氏鏈霉菌。可以采用本領域常規(guī)的方法進行活化和種子培養(yǎng)，例如，所述活化可以包括將左氏鏈霉菌的菌絲體接種至pda平板上，28-35℃下培養(yǎng)3-5天。所述種子培養(yǎng)可以包括將活化后的左氏鏈霉菌接種至種子培養(yǎng)基(液體)中，28-35℃培養(yǎng)3-4天。pda平板和種子培養(yǎng)基均為本領域技術人員所熟知，在此不再贅述。

本發(fā)明還提供了根據上述方法得到的發(fā)酵產物。所述發(fā)酵產物可以指分離菌體(5000-8000rpm條件下離心10-15min)后獲得的發(fā)酵清液(上清液)。本發(fā)明獲得的發(fā)酵產物具有較強的纖維素降解活性，可以應用于降解植物性廢料(如大豆桿、玉米秸稈、麩皮、棉籽殼、花生殼、玉米芯等)。

本發(fā)明提供的降解纖維素的方法包括：將降解劑與含纖維素的原料接觸，所述降解劑為如上所述的左氏鏈霉菌和/或其發(fā)酵產物。所述發(fā)酵產物優(yōu)選為如上所述的發(fā)酵產物，在此不再詳述。

根據本發(fā)明，所述降解劑為左氏鏈霉菌時，相對于每克的以纖維素計的含纖維素的原料，所述降解劑的用量優(yōu)選為2-3mg。優(yōu)選地，所述接觸的條件包括：溫度為28-35℃，時間為10-20天。

根據本發(fā)明，所述發(fā)酵產物為發(fā)酵清液與菌體的混合物或者發(fā)酵清液。

所述降解劑為發(fā)酵清液時，相對于每克的以纖維素計的含纖維素的原料，所述降解劑以蛋白計的用量可以為0.4-0.5mg。優(yōu)選地，所述接觸的條件包括：溫度為28-30℃，時間為3-4天。

所述降解劑為發(fā)酵清液與菌體的混合物時，相對于每克的以纖維素計的含纖維素的原料，所述降解劑以左氏鏈霉菌計的用量可以為2-3mg。優(yōu)選地，所述接觸的條件包括：溫度為28-35℃，時間為10-20天。

根據本發(fā)明的降解纖維素的方法，所述發(fā)酵產物優(yōu)選為如上所述的發(fā)酵產物。

根據本發(fā)明，所述含纖維素的原料可以為各種常見的植物性廢料(如秸稈、種子殼、木質廢料、紙屑、棉屑、玉米芯和甘蔗渣等)。

根據本發(fā)明，為了促進纖維素的降解，所述接觸還可以在無機鹽的存在下進行，例如磷酸二氫鉀、硫酸鎂、硫酸銨和酵母粉等中的至少一種。相對于每克的含纖維素的原料(以干重計)，磷酸氫二鉀的用量可以為4-6mg，磷酸二氫鉀的用量可以為4-6mg，七水硫酸鎂的用量可以為0.5-1.5mg，硫酸銨的用量可以為5-10mg，酵母粉的用量可以為3-40mg。

本發(fā)明還提供了如上所述的左氏鏈霉菌和/或其發(fā)酵產物在降解纖維素中的用途。

以下將通過實施例對本發(fā)明進行詳細描述。

實施例1

(1)將菌株gc(即保藏編號為cgmccno.13409的左氏鏈霉菌)接種至羧甲基纖維素鈉平板(cmc-na15g/l，nacl4.5g/l，kh2po40.8g/l，mgso40.2g/l，蛋白胨12g/l，酵母粉5.5g/l，瓊脂20g/l)，于30℃在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4d，用1g/l的剛果紅染液染色15min，棄去染液，加入1mol/l的nacl溶液，洗滌15min后分別測得菌落直徑(d)為7mm和透明圈的直徑(h)為18mm，比值(h/d)為2.57，說明本發(fā)明的菌株具有較好的產纖維素酶能力(菌株產生的酶能將平板上的纖維素水解成小分子物質，如寡聚糖、纖維二糖和葡萄糖等，這些小分子物質會和剛果紅染料結合形成紅色沉淀，而被nacl溶液洗去，在菌落周圍形成透明水解圈)。

(2)將菌株gc(以干重計，接種量為25mg/l)于恒溫(30℃)振蕩器(170rpm)中培養(yǎng)4d，使用的培養(yǎng)基(1l)組成為：cmc-na10g，(nh4)2so42g，kh2po44g，mgso4·7h2o0.3g，cacl2·2h2o0.3g，蛋白胨3g，酵母粉0.5g，吐溫-800.2g；將得到的培養(yǎng)物在6000rpm條件下離心15min，取上清液(即發(fā)酵清液)為粗酶液。通過dns法(參照文獻纖維素降解菌aspergillussp.yn1的產酶條件及酶學特性,微生物學通報,2010,37(8):1194-1199)對粗酶液進行纖維素內切酶活和濾紙酶活測定。通過紫外分光光度計(參照文獻高效木質素降解菌株的分離篩選,浙江大學學報(農業(yè)與生命科學版),2011,37(3):259-262)測量粗酶液的木質素過氧化物酶、錳過氧化物酶和漆酶的酶活。結果顯示，纖維素內切酶活力和濾紙酶活力分別達到56.81u/ml，10.57u/ml；木質素過氧化物酶、錳過氧化物酶和漆酶的酶活力分別為0.042u/ml、0.095u/ml和0.02u/ml。

實施例2

(1)將50ml錐形瓶和研磨好的小麥秸稈(2mm左右，取自河北保定)高溫烘干后稱重，精確到0.1mg，記為w1(錐形瓶)和w2(小麥秸稈)。小麥秸稈稱取1g，含0.5重量％酵母粉的無機鹽溶液(含5mg磷酸氫二鉀、5mg磷酸二氫鉀、1mg七水硫酸鎂和5mg硫酸銨)7.5g，放入50ml錐形瓶中在121℃下滅菌15min。加入菌株gc接種液1ml(以左氏鏈霉菌計的用量為2.5mg)，放入恒溫培養(yǎng)箱，在30℃下培養(yǎng)20d。菌株作一個平行對照組，結果取平均值。在121℃下滅菌15min，烘干稱重，記為w3(錐形瓶和培養(yǎng)物的總重)。按照“降解率＝(w1+w2-w3)/w2×100％”計算菌株降解秸稈的降解率，結果為11.52％。

(2)將步驟(1)中培養(yǎng)20d后的物料與不接菌的空白對照組進行傅里葉變換紅外光譜儀(ftir)照射分析，以比對秸稈降解前后官能團的變化，結果如圖1所示，其中，上部是未加菌的空白對照組的ftir分析結果(ck)，下部是經菌gc處理后物料的ftir分析結果(gc)。大部分波數(shù)區(qū)基本一致，除了1732波數(shù)和667波數(shù)處。1732處為c＝o鍵的伸縮振動，推測可能c＝o鍵參與了秸稈的降解過程。667處為c-h鍵的彎曲振動，推測有-ch2參與降解過程。

對發(fā)酵后的空白對照組秸稈和經菌處理的秸稈用正丁醇和氯仿進行回流提取(空白對照組秸稈直接用正丁醇)，提取液用無水硫酸鈉干燥，旋轉蒸發(fā)儀濃縮后，經氣質聯(lián)用色譜進行分析。對產物進行分析，經菌處理組多為烷烴，如二十一烷(heneicosane)、十六烷(hexadecane)。還有一些醇類，如菜油甾醇(campesterol)、豆甾醇(stigmasterol)。分析木質素的多環(huán)結構單元在處理后被打開，形成烷烴，醇類的一些物質，均可能是木質素的降解產物。

從以上結果可以看出，本發(fā)明的左氏鏈霉菌的發(fā)酵產物同時具有纖維素內切酶、纖維素外切酶、β-葡萄糖苷酶、木質素過氧化物酶、錳過氧化物酶和漆酶酶活，且活性較高，將其用于降解秸稈時能夠獲得較高的降解率。

以上詳細描述了本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，但是，本發(fā)明并不限于上述實施方式中的具體細節(jié)，在本發(fā)明的技術構思范圍內，可以對本發(fā)明的技術方案進行多種簡單變型，這些簡單變型均屬于本發(fā)明的保護范圍。

另外需要說明的是，在上述具體實施方式中所描述的各個具體技術特征，在不矛盾的情況下，可以通過任何合適的方式進行組合，為了避免不必要的重復，本發(fā)明對各種可能的組合方式不再另行說明。

此外，本發(fā)明的各種不同的實施方式之間也可以進行任意組合，只要其不違背本發(fā)明的思想，其同樣應當視為本發(fā)明所公開的內容。