本發(fā)明涉及分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種番茄頸腐根腐病菌PCR檢測專用引物及其檢測試劑盒。

背景技術(shù)：

番茄(Solanum esculentum L.)是我國重要的蔬菜作物之一，營養(yǎng)豐富，可以周年種植，并且產(chǎn)量越來越高，品種花色越來越多，用途廣泛，深受種植者和消費(fèi)者喜愛。據(jù)2014年聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織(FAO)統(tǒng)計，我國番茄種植面積和產(chǎn)量均居世界首位，種植面積約1500多萬畝，產(chǎn)量約5260萬噸。但是在番茄長期、大面積的生產(chǎn)過程中，其病害也隨之發(fā)展，危害加重，尤其是近年來番茄頸腐根腐病(Fusarium crown and root rot,FCRR)的大面積暴發(fā)，并有進(jìn)一步發(fā)展的趨勢。番茄頸腐根腐病是由尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum f.sp.radicis-lycopersici，F(xiàn)ORL)引起的最具破壞性的番茄土傳病害之一(Roberts et al.,2000)。該病害在世界各地普遍發(fā)生，首先于1974年在日本發(fā)現(xiàn)，之后在美國、加拿大、墨西哥、以色列、韓國、中國等許多國家陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)(Scott and Jones,2000；Scott,2005)，該病對多數(shù)國家的番茄生產(chǎn)造成極大威脅。近些年，番茄頸腐根腐病在我國山東、東北、河北、北京、江蘇、浙江等番茄主產(chǎn)區(qū)大范圍發(fā)生，誤診或防治不及時，番茄發(fā)病率達(dá)80％以上，致死率達(dá)30％以上，造成嚴(yán)重減產(chǎn)，給種植戶造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失(程琳等，2016)，因此，加強(qiáng)番茄頸腐根腐病菌的防治對于保證番茄穩(wěn)產(chǎn)、高產(chǎn)有著重要的作用。目前生產(chǎn)上沒有較理想的防治方法，因此，生產(chǎn)上急需對其開展監(jiān)測預(yù)警研究，全面深入地了解番茄頸腐根腐病菌致病性情況，建立高效、快速、準(zhǔn)確的病菌檢測技術(shù)，這些可對制定正確的抗病育種策略和合理布局品種都具有極其重要的參考價值。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種番茄頸腐根腐病菌PCR檢測專用引物，特異性強(qiáng)，檢測準(zhǔn)確性高。

本發(fā)明還提供了包含上述引物的試劑盒，適用于植物組織和土壤樣品中番茄頸腐根腐病菌的快速、準(zhǔn)確鑒定，對于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中番茄頸腐根腐病菌引起的病害防治具有重要的實用價值。

本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是：

一種番茄頸腐根腐病菌PCR檢測專用引物，包括上游引物和下游引物，上游引物和下游引物的序列如下：

上游引物：5’-CCTTACTCGACATTTTTCAGA-3’(SEQ ID NO:1所示)；

下游引物：5’-TGCCTGATGTCATTAGTA-3’(SEQ ID NO:2所示)。

一種番茄頸腐根腐病菌PCR檢測試劑盒，該試劑盒包括盒體和7支PCR管，在5支PCR管中分別裝有dNTP，MgCl₂，PCR緩沖液，Taq DNA聚合酶和ddH₂O；在另外2支PCR管中分別裝有檢測番茄頸腐根腐病菌的上游引物、檢測番茄頸腐根腐病菌的下游引物。

本發(fā)明提供了用于對番茄頸腐根腐病菌的檢測引物和試劑盒，通過提取待測樣品的DNA，并結(jié)合PCR檢測技術(shù)，可達(dá)到鑒定待測樣品中番茄頸腐根腐病菌的目的。

作為優(yōu)選，檢測番茄頸腐根腐病菌的上游引物序列為：5’-CCTTACTCGACATTTTTCAGA-3’。

作為優(yōu)選，檢測番茄頸腐根腐病菌的下游引物序列為：5’-TGCCTGATGTCATTAGTA-3’。

作為優(yōu)選，采用所述試劑盒配置10μL PCR擴(kuò)增體系的組成如下：

DNA模板20ng，檢測番茄頸腐根腐病菌的上游引物0.2μM，檢測番茄頸腐根腐病菌的下游引物0.2μM，dNTP 0.25mM，MgCl₂ 2.0mM，1×PCR緩沖液，Taq DNA聚合酶1U，加ddH₂O補(bǔ)足至10μL。

本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明能夠快速、準(zhǔn)確地鑒定番茄頸腐根腐病菌，對于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中番茄頸腐根腐病菌引起的病害防治具有重要的實用價值。

附圖說明

圖1為本發(fā)明引物特異性檢測樣品DNA擴(kuò)增后的凝膠電泳圖。

圖2為本發(fā)明田間病株上分離菌株DNA擴(kuò)增后的凝膠電泳圖。

具體實施方式

下面通過具體實施例，對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的具體說明。

本發(fā)明中，若非特指，所采用的原料和設(shè)備等均可從市場購得或是本領(lǐng)域常用的。下述實施例中的方法，如無特別說明，均為本領(lǐng)域的常規(guī)方法。

本發(fā)明所用引物由大連寶生物技術(shù)公司合成，所有序列測定工作均由上海生物技術(shù)有限公司完成。

實施例

1、用于對番茄頸腐根腐病菌檢測的引物的設(shè)計

根據(jù)GenBank中多聚半乳糖醛酸外切酶(pgx4)的保守序列(GenBank編號AB256798.1、AB256796.1、AB256797.1、AB256795.1、GU169176.1、AB256825.1)。

設(shè)計簡并引物FL-F(5’-GATGGTGGAACGGTATGACYC-3’，SEQ ID NO:3所示)與FL-R(5’-GATATCCTTRACACCATCACA-3’，SEQ ID NO:4所示)，擴(kuò)增長度為960bp，對其片段進(jìn)行克隆、測序和分析，并在960bp序列內(nèi)部設(shè)計特異性的引物。番茄頸腐根腐病菌特異性的引物序列如下：

上游引物：5’-CCTTACTCGACATTTTTCAGA-3’(SEQ ID NO：1)；

下游引物：5’-TGCCTGATGTCATTAGTA-3’(SEQ ID NO：2)；

EQ ID NO：1由21個堿基組成，SEQ ID NO：2由18個堿基組成，擴(kuò)增片段長度為486bp。

2、用本發(fā)明的引物對番茄頸腐根腐病菌進(jìn)行常規(guī)PCR檢測

本例所述菌株：

浙江省農(nóng)科院植微所提供的番茄頸腐根腐病菌；

檢測方法按以下步驟進(jìn)行：

(1)菌絲DNA的提?。河脺缇篮瀼钠桨迳瞎稳【z約0.1克，置于2.0mL離心管中，按常規(guī)CTAB法提取DNA后，分別保存，備用；

(2)PCR擴(kuò)增：在各PCR管中分別加入步驟(1)提取的各樣品DNA 20ng后，再依次加入檢測番茄頸腐根腐病菌的上下游引物各0.2μM，dNTP 0.25mM，MgCl₂ 2.0mM，1×PCR緩沖液(大連寶生物技術(shù)公司)，Taq DNA聚合酶1單位，加ddH₂O至10μL后，按PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性3min，94℃50seconds，55℃退火50seconds，72℃60seconds，35個循環(huán)進(jìn)行擴(kuò)增，72℃延伸10min，產(chǎn)物4℃保存；所述檢測番茄頸腐根腐病菌的上游引物序列為SEQ ID NO：1，下游引物序列為SEQ ID NO：2。

(3)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳分析：各樣品分別取擴(kuò)增產(chǎn)物10μL和由0.25％溴酚蘭加40％蔗糖配制而成的上樣緩沖液2μL，混勻，將混合物在1.2％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳分離，至溴酚蘭到達(dá)凝膠的2/3位置處停止電泳，凝膠經(jīng)EB染色后用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行觀察、照相；

(4)番茄頸腐根腐病菌的檢測：根據(jù)凝膠電泳結(jié)果，分析判斷被檢測樣品(見圖1)：番茄頸腐根腐病菌擴(kuò)增出486bp條帶，與預(yù)期結(jié)果相符，表明本發(fā)明的引物可用于番茄頸腐根腐病菌的常規(guī)PCR檢測。

3、用本發(fā)明的引物對從番茄頸腐根腐病病株上分離的菌株進(jìn)行常規(guī)PCR檢測

本例所述菌株：

浙江番茄主栽區(qū)番茄頸腐根腐病病株上分離獲得的菌株。

檢測方法按以下步驟進(jìn)行：

(1)菌絲DNA的提?。河脺缇篮瀼钠桨迳瞎稳【z約0.1克，置于2.0mL離心管中，按常規(guī)CTAB法提取DNA后，分別保存，備用；

(2)PCR擴(kuò)增：在各PCR管中分別加入步驟(1)提取的各樣品DNA 20ng后，再依次加入檢測番茄頸腐根腐病菌的上下游引物各0.2μM，dNTP 0.25mM，MgCl₂ 2.0mM，1×PCR緩沖液，Taq DNA聚合酶1單位，加ddH₂O至10μL后，按PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性3min，94℃50seconds，55℃退火50seconds，72℃60seconds，35個循環(huán)進(jìn)行擴(kuò)增，72℃延伸10min，產(chǎn)物4℃保存；所述檢測番茄頸腐根腐病菌的上游引物序列為SEQ ID NO：1，下游引物序列為SEQ ID NO：2；

(3)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳分析：各樣品分別取擴(kuò)增產(chǎn)物10μL和由0.25％溴酚蘭加40％蔗糖配制而成的上樣緩沖液2μL，混勻，將混合物在1.2％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳分離，至溴酚蘭到達(dá)凝膠的2/3位置處停止電泳，凝膠經(jīng)EB染色后用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行觀察、照相；

(4)番茄頸腐根腐病菌的檢測：根據(jù)凝膠電泳結(jié)果，分析判斷被檢測樣品(見圖2)：番茄頸腐根腐病菌擴(kuò)增出486bp條帶，表明本發(fā)明的引物可用于番茄頸腐根腐病菌的常規(guī)PCR檢測。

一種番茄頸腐根腐病菌PCR檢測試劑盒，該試劑盒包括盒體和7支PCR管，在5支PCR管中分別裝有dNTP，MgCl₂，PCR緩沖液，Taq DNA聚合酶和ddH₂O；在另外2支PCR管中分別裝有檢測番茄頸腐根腐病菌的上游引物(SEQ ID NO：1)、檢測番茄頸腐根腐病菌的下游引物(SEQ ID NO：2)。

以上所述的實施例只是本發(fā)明的一種較佳的方案，并非對本發(fā)明作任何形式上的限制，在不超出權(quán)利要求所記載的技術(shù)方案的前提下還有其它的變體及改型。

SEQUENCE LISTING

<110> 浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院

<120> 番茄頸腐根腐病菌PCR檢測專用引物及其檢測試劑盒

<130> 2017.02

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ccttactcga catttttcag a 21

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tgcctgatgt cattagta 18

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gatggtggaa cggtatgacy c 21

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gatatccttr acaccatcac a 21