本發(fā)明涉及一種確定鴨hsp90α蛋白結(jié)合磷脂酰膽堿區(qū)域的方法，屬于生物工程
技術(shù)領(lǐng)域：
。
背景技術(shù)：
：熱休克蛋白hsp12不像其他熱休克蛋白一樣保護(hù)其他蛋白免于去折疊和降解，而是結(jié)合到細(xì)胞膜上穩(wěn)定細(xì)胞膜防止其發(fā)生破裂和泄漏。熱休克蛋白(heatshockprotein，hsp)是生物中廣泛存在的一類(lèi)高度保守蛋白質(zhì)，也是膜結(jié)合蛋白之一。按照分子量的大小，hsp共分為5類(lèi)，分別是hsp100、hsp90、hsp70、hsp60以及小分子蛋白。正常機(jī)體細(xì)胞內(nèi)的熱休克蛋白可作為分子伴侶，參與蛋白質(zhì)的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)和折疊等。在機(jī)體處于脅迫狀態(tài)時(shí)，熱休克蛋白能提高表達(dá)與細(xì)胞內(nèi)各組分如膜、蛋白質(zhì)、細(xì)胞骨架元件等相互作用，維持細(xì)胞的穩(wěn)定。熱休克蛋白對(duì)細(xì)胞膜的流動(dòng)性、滲透性、完整性具有調(diào)控作用。在酵母細(xì)胞中，hsp12結(jié)合到細(xì)胞膜上穩(wěn)定細(xì)胞膜防止其發(fā)生破裂和泄漏；在乳酸菌中，小分子熱休克蛋白可以與細(xì)胞膜作用維持膜脂的結(jié)構(gòu)和狀態(tài)。磷脂是細(xì)胞尤其是細(xì)胞膜磷脂雙分子層的重要組分，兩者間關(guān)系密切。小分子熱休克蛋白和hsp70與磷脂的結(jié)合已有報(bào)道。harada等用非變性page檢測(cè)了hsp70的n端atpase功能區(qū)和c端多肽結(jié)合區(qū)能夠與酸性糖脂和磷脂結(jié)合，而與中性糖脂和磷脂則不能結(jié)合；mccallister等用超速離心的方法檢測(cè)到hsp70的n端和c端都能結(jié)合磷脂，只是n端比c端結(jié)合的磷脂的量多。非變性page和超速離心的方法常得出相反的結(jié)果，并且不能實(shí)時(shí)觀(guān)測(cè)結(jié)合的動(dòng)力學(xué)和親和力。到目前為止未見(jiàn)過(guò)對(duì)hsp90α結(jié)合磷脂的區(qū)域的報(bào)道。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種確定鴨hsp90α蛋白結(jié)合磷脂酰膽堿區(qū)域的方法，通過(guò)分段表達(dá)鴨hsp90α蛋白，借助表面等離子共振技術(shù)實(shí)時(shí)觀(guān)測(cè)各鴨hsp90α蛋白片段與磷脂結(jié)合的動(dòng)力學(xué)和親和力，確定鴨hsp90α蛋白與磷脂結(jié)合的區(qū)域。本發(fā)明的技術(shù)方案，一種確定鴨hsp90α蛋白結(jié)合磷脂酰膽堿區(qū)域的方法，步驟如下：(1)鴨hsp90α基因及各片段基因序列的獲得：a、鴨hsp90α基因提取：取鴨胸肌100mg，提取總rna，總rna經(jīng)電泳檢測(cè)，采用核酸定量分析儀測(cè)定od260/280比值及濃度，以1μg總rna為模板，按照cdna合成試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄；反轉(zhuǎn)錄程序：37℃15min，85℃5min，4℃保存，長(zhǎng)期保存應(yīng)放于-20℃；b、特異性引物的設(shè)計(jì)：根據(jù)北京鴨的hsp90α基因序列設(shè)計(jì)系列基因特異性引物，包括：上游引物f，下游引物r，以及分段用特異性引物n-r、m-f、m-r、c-f和c-r；c、pcr擴(kuò)增：以cdna為模板進(jìn)行pcr擴(kuò)增，pcr產(chǎn)物用1％的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)；pcr產(chǎn)物純化回收后連接至pcold1載體，轉(zhuǎn)化至dh5α感受態(tài)細(xì)胞，將菌液涂在含100μg/ml氨芐青霉素的lb固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)過(guò)夜，然后挑取陽(yáng)性單菌落進(jìn)行培養(yǎng)，經(jīng)菌落pcr及雙酶切鑒定重組質(zhì)粒，對(duì)正確的重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序無(wú)誤的重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化進(jìn)入表達(dá)感受態(tài)細(xì)胞transetta2；(2)融合蛋白原核表達(dá)及可溶性分析：以陽(yáng)性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化步驟(1)所得大腸桿菌transetta2感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落接種至5ml含100μg/ml氨芐的lb培養(yǎng)基中，37℃，200r/min震蕩培養(yǎng)，當(dāng)菌液濃度od600值為0.6～0.8時(shí)，加入iptg至終濃度為0.25mm，22℃，200r/min搖晃誘導(dǎo)過(guò)夜；用不加iptg誘導(dǎo)的菌液做對(duì)照，離心收集沉淀，用pbs重懸沉淀，于超聲波細(xì)胞破碎儀上破碎4-6min，11000-13000r/min離心4-6min，分別取出上清、沉淀，加入sds-page電泳上樣緩沖液，95℃加熱10min，用12％sds-page電泳檢測(cè)融合蛋白是否為可溶性蛋白；(3)重組融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化：d、誘導(dǎo)表達(dá)：將步驟(2)鑒定所得能可溶性表達(dá)的菌落接種于500ml含lb培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)；4400-4600r/min離心14-16min收集菌體，用ph為7.6含有50mm的磷酸鹽，150mm的nacl，5mm的咪唑的bindingbuffer緩沖液重懸菌體，冰浴條件下超聲破碎18-22min，超聲參數(shù)為：功率20％，超聲1s，間停3s、再11000-13000r/min離心28-32min，4℃收集上清，棄菌體沉淀；e、初步純化：將步驟d所得上清加入鎳親和層析柱中，用不同濃度的咪唑洗脫液洗脫并收集，蛋白得到初步純化，取樣液加入sds-page電泳上樣緩沖液，95℃加熱10min，用12％sds-page電泳檢測(cè)重組蛋白的表達(dá)情況；f、進(jìn)一步純化：將步驟e所得樣品用10kda的超濾管離心濃縮4℃，4000r/min，10min/次，再用superdextm200進(jìn)一步純化，然后再次用sds-page檢測(cè)純化的產(chǎn)物并離心濃縮；用考馬斯亮藍(lán)染色的方法測(cè)定蛋白濃度，并至于-80℃保存；(4)磷脂酰膽堿脂質(zhì)體的制備：稱(chēng)取10mg磷脂酰膽堿，用2ml甲醇溶解，加0.5ml含有25mmhepes，100mmnacl，ph7.4的hbs緩沖液，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中去除甲醇后加入2mlhbs，在超聲波浴中乳化10min，并用hbs定溶到10ml，再-80℃反復(fù)凍融3次得到1mg/ml的脂質(zhì)體；(5)表面等離子共振技術(shù)檢測(cè)鴨hsp90α及各片段與磷脂酰膽堿的相互作用：g、生物傳感芯片l1的準(zhǔn)備：將l1芯片安裝到biacorex100plus系統(tǒng)中，所有用到的溶液都經(jīng)過(guò)0.22μm濾膜過(guò)濾；用50mmnaoh：異丙醇體積比2:3,的混合溶液清洗3次，每次1min，流速設(shè)定為10μl·min-1；再用ph7.4的hbs緩沖液清洗系統(tǒng)及芯片，流速設(shè)定為10μl·min-1；h、待基線(xiàn)平穩(wěn)后，進(jìn)行以下步驟：注入30μl配好的脂質(zhì)體，使脂質(zhì)體偶聯(lián)的l1芯片上，流速1μl·min-1；注入50mmnaoh洗掉未偶聯(lián)的脂質(zhì)體1min，流速10μl·min-1；用0.1mg/mlbsa檢查芯片的親脂基團(tuán)是否飽和，如果沒(méi)有bsa結(jié)合，證明l1芯片已經(jīng)被脂質(zhì)體飽和，用hbs緩沖液平衡芯片到基線(xiàn)平穩(wěn)；稀釋至少5個(gè)濃度的蛋白，注入到芯片上，流速30μl·min-1；每次上完樣，用合適濃度的naoh再生芯片。步驟(1)b所述特異性引物如下：上游引物f：5'-ctcggatccatgcctgaggctgt-3'，下劃線(xiàn)是bamh1酶切位點(diǎn)；下游引物r：5'-tacgtcgacatccacctcctccat-3'，下劃線(xiàn)是sal1酶切位點(diǎn)；n-f：5'-ttgggatccatgcctgaggctgt-3'；n-r：5'-gacgtcgacgagcctgataggat-3'；m-f：5'-cagggatccatggagaagtacatcg-3'；m-r：5'-gacgtcgacagaaaccagggtct-3'；c-f：5'-ccgggatccatggaagaagagaaaaag-3'；c-r：5'-tacgtcgacatccacctcctccat-3'。本發(fā)明的有益效果：通過(guò)本發(fā)明方法，顯示鴨hsp90α蛋白能與磷脂酰膽堿發(fā)生強(qiáng)結(jié)合，鴨hsp90α蛋白的三個(gè)結(jié)構(gòu)域片段在結(jié)合磷脂酰膽堿時(shí)顯示不同的親和力：(1)引起強(qiáng)結(jié)合的c-端結(jié)構(gòu)域；(2)引起中等強(qiáng)度結(jié)合的n-端結(jié)構(gòu)域；(3)引起弱結(jié)合的中間結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明將對(duì)鴨hsp90α蛋白與磷脂雙分子層及膜的相互作用機(jī)制具有指導(dǎo)作用。附圖說(shuō)明圖1是鴨hsp90α蛋白結(jié)構(gòu)域片段示意圖。圖2是鴨hsp90α全長(zhǎng)基因及片段n，m，c的pcr擴(kuò)增結(jié)果示意圖。圖3是鴨hsp90α在大腸桿菌中的表達(dá)分析融合蛋白的可溶性檢測(cè)結(jié)果。圖4是經(jīng)過(guò)ni親和層析和凝膠過(guò)濾層析得到的鴨hsp90α及hsp90α-n，hsp90α-m和hsp90α-c；m：蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1：hsp90α-m；2：hsp90α-c；3:hsp90α-c；4：hsp90α。圖5是鴨hsp90α及hsp90α-n，hsp90α-m和hsp90α-c與磷脂酰膽堿的實(shí)時(shí)spr圖譜。具體實(shí)施方式實(shí)施例1(1)鴨hsp90α基因及各片段基因序列的獲得：麻鴨總rna的提取按照takara公司的trizol說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。取胸肌100mg，提取總rna，總rna經(jīng)電泳檢測(cè)，eppendorf公司核酸定量分析儀測(cè)定od260/280比值及濃度，以1μg總rna為模板，按照cdna合成試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄程序：37℃15min，85℃5min，4℃保存，長(zhǎng)期保存應(yīng)放于-20℃。根據(jù)ncbi公布的北京鴨的hsp90α基因序列(序列號(hào)：xm_013100687.1)，運(yùn)用primer5.0設(shè)計(jì)基因的hsp90α基因特異性引物，上游引物f：5'-ctcggatccatgcctgaggctgt-3'(下劃線(xiàn)是bamh1酶切位點(diǎn))；下游引物r：5'-tacgtcgacatccacctcctccat-3'(下劃線(xiàn)是sal1酶切位點(diǎn))。根據(jù)人的hsp90α蛋白的晶體結(jié)構(gòu)(pdb號(hào)：5fwk)，將鴨hsp90α蛋白的氨基酸序列劃分為三個(gè)結(jié)構(gòu)域，(如圖1所示)：n(氨基酸序列1-219)，m(278-539)和c(551-728)，并設(shè)計(jì)如下的特異性引物進(jìn)行分段擴(kuò)增。n-f：5'-ttgggatccatgcctgaggctgt-3'；n-r：5'-gacgtcgacgagcctgataggat-3'；m-f：5'-cagggatccatggagaagtacatcg-3'；m-r：5'-gacgtcgacagaaaccagggtct-3'；c-f：5'-ccgggatccatggaagaagagaaaaag-3'；c-r：5'-tacgtcgacatccacctcctccat-3'。以cdna為模板進(jìn)行pcr擴(kuò)增，擴(kuò)增hsp90α基因全長(zhǎng)及片段n，m，c，具體結(jié)果如圖2所示。pcr產(chǎn)物用1％的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)(具體如圖2所示)。pcr產(chǎn)物純化回收后連接至pcold1載體，轉(zhuǎn)化至dh5α感受態(tài)細(xì)胞，將菌液涂在含氨芐青霉素的固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)過(guò)夜，然后挑取陽(yáng)性單菌落進(jìn)行培養(yǎng)，經(jīng)菌落pcr及雙酶切鑒定重組質(zhì)粒，正確的重組質(zhì)粒送至上海生工生物工程股份有限公司測(cè)序。將測(cè)序無(wú)誤的重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化進(jìn)入表達(dá)感受態(tài)細(xì)胞transetta2。將得到的各基因片段及大腸桿菌表達(dá)載體pcold1用bamh1和sal1分別進(jìn)行雙酶切后，進(jìn)行連接，得到的陽(yáng)性重組質(zhì)粒pcold1-hsp90α，pcold1-hsp90α-n，pcold1-hsp90α-m和pcold1-hsp90α-c轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌transetta2。(2)融合蛋白原核表達(dá)及可溶性分析：以陽(yáng)性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌transetta2感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落接種至5ml含100μg/ml氨芐的lb培養(yǎng)基中，37℃，200r/min震蕩培養(yǎng)，當(dāng)菌液濃度od600值為0.6～0.8時(shí)，加入iptg至終濃度為0.25mm，22℃，200r/min搖晃誘導(dǎo)過(guò)夜。用不加iptg誘導(dǎo)的菌液做對(duì)照，離心收集沉淀，用pbs重懸沉淀，于超聲波細(xì)胞破碎儀上破碎5min，12000r/min離心5min，分別取出上清、沉淀，加入sds-page電泳上樣緩沖液，95℃加熱10min，用12％sds-page電泳檢測(cè)融合蛋白是否為可溶性蛋白。(3)重組融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化：將上述鑒定能可溶性表達(dá)的菌落接種于500ml含lb培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。離心(4500r/min，15min)收集菌體，用bindingbuffer(50mm的磷酸鹽，ph7.6，150mm的nacl，5mm的咪唑)重懸菌體，冰浴條件下超聲破碎20min(功率20％，超聲1s，間停3s)、再離心(12000r/min，30min，4℃)收集上清，棄菌體沉淀。將上清加入鎳親和層析柱中，用不同濃度的咪唑洗脫液洗脫并收集，蛋白得到初步純化，取樣液加入sds-page電泳上樣緩沖液，加熱(95℃，10min)用12％sds-page電泳檢測(cè)重組蛋白的表達(dá)情況。將較純的樣品用10kda的超濾管離心濃縮(4℃，4000r/min，10min/次)，再用superdextm200進(jìn)一步純化，然后再次用sds-page檢測(cè)純化的產(chǎn)物并離心濃縮。用考馬斯亮藍(lán)染色的方法測(cè)定蛋白濃度，并至于-80℃保存。經(jīng)過(guò)0.25mmiptg誘導(dǎo)含有pcold1-hsp90α，-hsp90α-n，-hsp90α-m和-hsp90α-c工程菌，并進(jìn)行可溶性表達(dá)鑒定(具體如圖3所示)，發(fā)現(xiàn)鴨hsp90α及hsp90α-n，hsp90α-m和hsp90α-c都能在大腸桿菌中進(jìn)行大量可溶性表達(dá)。經(jīng)過(guò)鎳柱親和層析和凝膠過(guò)濾層析得到高純度的各蛋白(具體如圖4所示)。(4)磷脂酰膽堿脂質(zhì)體的制備：稱(chēng)取10mg磷脂酰膽堿，用2ml甲醇溶解，加0.5mlhbs緩沖液(25mmhepes，ph7.4，100mmnacl)，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中去除甲醇后加入2mlhbs，在超聲波浴中乳化10min，并用hbs定溶到10ml，再-80℃反復(fù)凍融3次得到1mg/ml的脂質(zhì)體。(5)表面等離子共振技術(shù)檢測(cè)鴨hsp90α及各片段與磷脂酰膽堿的相互作用：生物傳感芯片l1的準(zhǔn)備：將l1芯片安裝到biacorex100plus系統(tǒng)中，所有用到的溶液都經(jīng)過(guò)0.22μm濾膜過(guò)濾。用50mmnaoh：異丙醇(2:3,v:v)清洗3次，每次1min，流速設(shè)定為10μl·min-1；再用hbs緩沖液(ph7.4)清洗系統(tǒng)及芯片，流速設(shè)定為10μl·min-1，待基線(xiàn)平穩(wěn)后，進(jìn)行以下步驟：注入30μl配好的脂質(zhì)體，使脂質(zhì)體偶聯(lián)的l1芯片上，流速1μl·min-1；注入50mmnaoh洗掉未偶聯(lián)的脂質(zhì)體1min，流速10μl·min-1；用0.1mg/mlbsa檢查芯片的親脂基團(tuán)是否飽和，如果沒(méi)有bsa結(jié)合，證明l1芯片已經(jīng)被脂質(zhì)體飽和。用hbs緩沖液平衡芯片到基線(xiàn)平穩(wěn)；稀釋不同濃度的蛋白(至少5個(gè)濃度，中間濃度進(jìn)行重復(fù))，注入到芯片上，流速30μl·min-1；每次上完樣，用合適濃度的naoh再生芯片。經(jīng)過(guò)表面等離子共振技術(shù)，對(duì)鴨hsp90α的各蛋白片段與磷脂酰膽堿的結(jié)合動(dòng)力學(xué)進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)，實(shí)時(shí)圖譜如圖5所示。蛋白的平衡解離常數(shù)kd越小說(shuō)明結(jié)合力越強(qiáng)，具體如表1所示。鴨hsp90α蛋白能與磷脂酰膽堿發(fā)生強(qiáng)結(jié)合，鴨hsp90α蛋白的三個(gè)結(jié)構(gòu)域片段在結(jié)合磷脂酰膽堿時(shí)顯示不同的親和力：(1)引起強(qiáng)結(jié)合的c-端結(jié)構(gòu)域；(2)引起中等強(qiáng)度結(jié)合的n-端結(jié)構(gòu)域；(3)引起弱結(jié)合的中間結(jié)構(gòu)域。表1ka(1/ms)kd(1/s)kd(m)rmax(ru)hsp90α1.93e+41.73e-30.9e-9480.3hsp90α-n0.25+e42.54e-31.0e-647.39hsp90α-m0.57+e46.63e-31.2e-629.34hsp90α-c0.74+e42.49e-30.03e-9439.4當(dāng)前第1頁(yè)12