一種高效價(jià)的抗眼鏡蛇神經(jīng)毒素血清的制備方法，屬于免疫技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
眼鏡蛇(Naja naja atra Cantor) 屬于眼鏡蛇科、眼鏡蛇屬，在我國(guó)分布廣泛，是神經(jīng)型毒蛇, 其主要毒素為神經(jīng)毒素。神經(jīng)毒素分為二類：突觸前神經(jīng)毒素和突觸后神經(jīng)毒素，前者抑制神經(jīng)傳導(dǎo)中乙酰膽堿的釋放，后者能夠與運(yùn)動(dòng)終板乙酰膽堿受體結(jié)合，二者都導(dǎo)致神經(jīng)傳導(dǎo)阻斷。二類神經(jīng)毒素都為堿性蛋白，不含非蛋白成分，分子量小，含4-5個(gè)二硫健，耐熱性很強(qiáng)。
由于眼鏡蛇毒神經(jīng)毒素的穩(wěn)定性很強(qiáng)，一般的減毒方法很難改變其毒性，在制備神經(jīng)毒素抗血清過程中，注射的抗原量很少動(dòng)物才能存活，抗原量小導(dǎo)致抗血清效價(jià)低，治療效果不佳。制備高效價(jià)抗血清對(duì)于有效治療眼鏡蛇咬傷、降低死亡率有重要意義。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明提供了一種高效價(jià)的抗眼鏡蛇神經(jīng)毒素血清及其制備方法，本發(fā)明利用眼鏡蛇毒神經(jīng)毒素耐高溫的特點(diǎn),加熱后離心獲得神經(jīng)毒素,將神經(jīng)毒素用SDS和β-巰基乙醇處理降低神經(jīng)毒性，并包埋在聚丙烯酰胺凝膠中減少釋放速度，將含神經(jīng)毒素的凝膠磨細(xì)后免疫注射家兔，獲得高效價(jià)的抗眼鏡蛇神經(jīng)毒素血清。
本發(fā)明的具體技術(shù)方案如下：
一種高效價(jià)的抗眼鏡蛇神經(jīng)毒素血清的制備方法，其特征在于,包括以下步驟：
a、按照0.08-0.12g眼鏡蛇毒用0.8-1.2 mL 生理鹽水溶解，沸水浴中加熱8-12分鐘，離心去除非神經(jīng)毒素沉淀，然后加48-52 mg SDS和1.8-2.2 uL β-巰基乙醇充分混合減弱其神經(jīng)毒性；
b、神經(jīng)毒素的包埋： 將經(jīng)過減毒處理的神經(jīng)毒素包埋于聚丙烯酰胺凝膠中；
c、將含神經(jīng)毒素的凝膠磨細(xì)后免疫注射家兔，經(jīng)幾次免疫注射后，以切斷頸動(dòng)脈方式殺死家兔取血， 離心獲得抗血清。
所述的高效價(jià)的抗眼鏡蛇神經(jīng)毒素血清的制備方法，其特征在于,步驟c所述的免疫注射家兔的具體操作方：將含神經(jīng)毒素的凝膠磨細(xì)后免疫注射家兔，進(jìn)行4次免疫注射，每次注射間隔7天，第一次注射皮下注射1.25 mL,腹腔注射2.25 mL，第二、第三和第四次注射均腹腔注射3.5 mL，第四次注射后，第3天以切斷頸動(dòng)脈方式殺死家兔取血，6小時(shí)后離心獲得抗血清。
所述的高效價(jià)的抗眼鏡蛇神經(jīng)毒素血清的制備方法制得的抗血清。
所述的抗血清在治療眼鏡蛇咬傷患者上的應(yīng)用。
本發(fā)明技術(shù)效果體現(xiàn)在二個(gè)方面：
1、保證制備抗血清的高效價(jià)
由于神經(jīng)毒素活性大部分被抑制，注射量增加，被注射動(dòng)物不會(huì)因?yàn)樯窠?jīng)毒素的作用而死亡，保證了制備的抗血清效價(jià)高。通過比較，本發(fā)明比傳統(tǒng)方法制備的抗血清效價(jià)高出約7倍，治療效果大大提高；
2、不使用昂貴的福氏佐劑，降低抗血清的生產(chǎn)成本。
本發(fā)明將神經(jīng)毒素包埋在網(wǎng)狀的聚丙烯酰胺凝膠中，神經(jīng)毒素從網(wǎng)狀的聚丙烯酰胺凝膠中緩慢釋放到動(dòng)物體內(nèi)，抗原在動(dòng)物體內(nèi)停留時(shí)間長(zhǎng)，能充分刺激免疫系統(tǒng)，而且用聚丙烯酰胺凝膠替代了昂貴的福氏佐劑。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例一：
第一步：眼鏡蛇神經(jīng)毒素的獲得
將0.1g 眼鏡蛇毒溶解于1.0 mL 生理鹽水，沸水浴中加熱10分鐘，離心（13000轉(zhuǎn)/分）去除非神經(jīng)毒素沉淀，然后加50 mg SDS和2 uL β-巰基乙醇充分混合減弱其神經(jīng)毒性；
第二步：神經(jīng)毒素的包埋
將上述神經(jīng)毒素溶液加入1.4mL 30%丙烯酰胺、50uL 10 %過硫酸銨、2uL 四甲基乙二胺(TEMED)，充分混勻，沿試管壁緩慢加入0.5mL 異丙醇，1 小時(shí)后凝固，去除異丙醇，取出膠體用手術(shù)刀平均分成4份，每份約1 g，冷凍保存；
第三步：注射免疫家兔，獲得抗血清
取1份上述膠體，加2.0 mL生理鹽水，于研缽內(nèi)充分磨細(xì)，吸入到5mL規(guī)格的一次性注射器中，總體積約3.5mL，免疫注射2.5kg左右的家兔，共注射4次，二次免疫間隔7天，第一次注射皮下注射1.25mL,腹腔注射2.25mL，第二、第三和第四次注射均腹腔注射3.5mL，第四次注射后第3天以切斷頸動(dòng)脈方式殺死家兔取血，6小時(shí)后離心獲得抗血清，冷凍保存。
第四步：抗血清效價(jià)的測(cè)定
抗血清效價(jià)的測(cè)定與ELISA方法相似。
將眼鏡蛇毒用包被液（0.1mol/L pH 9.5的碳酸鹽緩沖液）配制成10μg/mL作為抗原樣品，將獲得的抗血清進(jìn)行倍比稀釋，以不含蛇毒的包被液代替抗原樣品作為空白，以正常兔血清（未免疫的家兔血清）替代待測(cè)抗血清作為陰性對(duì)照，用制備的抗血清作為一抗，羊抗兔IgG-堿性磷酸酶為二抗，1 mg/mL的p-NPP為底物，顯色45分鐘后在酶標(biāo)儀上測(cè)定OD405值，以空白對(duì)照調(diào)零，待測(cè)抗血清的吸光值2倍于陰性對(duì)照吸光值的效價(jià)定為1，抗血清的稀釋倍數(shù)既為抗血清的效價(jià)。
（1）抗原包被：酶標(biāo)板每孔加100μL包被抗原，酶標(biāo)板置4oC冰箱過夜。
（2）封閉：加封閉液，每孔120 μL ，37 oC孵育1 h。
（3）加一抗：加入倍比稀釋的抗血清（ELISA緩沖液稀釋），陰性為未免疫的家兔血清，37 oC孵育1 h。
（4）加酶標(biāo)二抗：加入1/10000的羊抗兔IgG-堿性磷酸酶（Sigma，ELISA緩沖液稀釋），37 oC孵育1 h。
（5）加底物：1 mg/mL的p-NPP（Sigma，溶于底物緩沖液，pH 9.8），37 oC黑暗中孵育45 分鐘，測(cè)OD405值。
注：每一步完成后均用PBST洗3次，每次5分鐘以上。
經(jīng)過計(jì)算，實(shí)施例一制備的抗血清效價(jià)達(dá)到560，而用常規(guī)蛇毒加佐劑乳化制備的抗血清效價(jià)只有80，可見本發(fā)明制備的抗血清效價(jià)提高約7倍。
實(shí)施例二：
第一步：眼鏡蛇神經(jīng)毒素的獲得
除了用0.09g 眼鏡蛇毒外其他步驟與“實(shí)施例一”第一步相同。
第二步：神經(jīng)毒素的包埋
將第一步獲得的神經(jīng)毒素溶液加入1.3mL 30%丙烯酰胺、50uL10 %過硫酸銨、2uL TEMED，充分混勻，其他步驟與“實(shí)施例一”第二步相同；
第三步：注射免疫家兔,獲得抗血清
與“實(shí)施例一”第三步相同。
第四步：抗血清效價(jià)的測(cè)定
測(cè)定過程與“實(shí)施例一”第四步相同。
經(jīng)過計(jì)算，“實(shí)施例二”制備的抗血清效價(jià)達(dá)到544，而用常規(guī)蛇毒加佐劑乳化制備的抗血清效價(jià)只有80，可見本發(fā)明制備的抗血清效價(jià)提高約6.8倍。
實(shí)施例三：
第一步：眼鏡蛇神經(jīng)毒素的獲得
除了用0.11g 眼鏡蛇毒外，其他步驟與“實(shí)施例一”第一步相同。
第二步：蛇毒蛋白的包埋
將第一步獲得的神經(jīng)毒素溶液加入1.5mL 30%丙烯酰胺、50uL10 %過硫酸銨、2uL TEMED，充分混勻，其他步驟與“實(shí)施例一”第二步相同；
第三步：注射免疫家兔,獲得抗血清
與“實(shí)施例一”第三步相同。
第四步：抗血清效價(jià)的測(cè)定
檢測(cè)過程與“實(shí)施例一”第四步相同。
經(jīng)過計(jì)算，“實(shí)施例三”制備的抗血清效價(jià)達(dá)到584，而用常規(guī)蛇毒加佐劑乳化制備的抗血清效價(jià)只有80，可見本發(fā)明制備的抗血清效價(jià)提高7.3倍。
本發(fā)明用不同劑量的眼鏡蛇毒，采用加熱、SDS和β-巰基乙醇三種處理減弱神經(jīng)毒性，聚丙烯酰胺凝膠包埋代替乳化，均獲得穩(wěn)定和滿意的結(jié)果，說明該技術(shù)實(shí)用、可靠。