本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測含有BCbi143/144內(nèi)含子灰霉病菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)引物組及其使用方法，屬于植物病害檢測、鑒定、防治及病原菌抗藥性風(fēng)險(xiǎn)預(yù)警的技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

灰霉病菌(Botrytis cinerea Pers.)屬于半知菌類絲孢綱絲孢目葡萄孢屬，是一條件致病菌，腐生性強(qiáng)，屬壞死型植物病原真菌，具有潛伏侵染的特點(diǎn)，潛伏期較長?；移咸焰叩募闹鲗；圆粡?qiáng)，寄主范圍廣，可侵染230多種植物，不同寄主植物間的灰葡萄孢可交互侵染，因而很難像專性寄生菌那樣發(fā)現(xiàn)有效的抗病材料，故而很難培育出抗病品種。

灰霉病菌因具有寄主范圍廣、繁殖快和遺傳變異頻繁等特點(diǎn)，使其極易對殺菌劑產(chǎn)生抗性。甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑(QoIs)是一類來源于具有殺菌活性的天然抗生素strobilurinA的新型殺菌劑，包括嘧菌酯、醚菌酯、肟菌酯等藥劑，具有廣譜高效的抗菌活性。由于其具有獨(dú)特的作用靶標(biāo)，與其它現(xiàn)有的殺菌劑不存在交互抗性。甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑作用于真菌線粒體呼吸鏈上的復(fù)合體III，通過與細(xì)胞色素b基因編碼的cytb的Qo位點(diǎn)結(jié)合來抑制呼吸鏈上的電子傳遞，進(jìn)而影響呼吸作用阻礙病原真菌的合成，干擾細(xì)胞正常分裂和生長，進(jìn)而造成菌體死亡。

從1996年歐洲開始使用甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑防治小麥白粉病到現(xiàn)在，灰霉病菌對嘧菌酯等QoI藥劑產(chǎn)生了明顯的抗藥性。據(jù)報(bào)道，CYTB上的點(diǎn)突變G143A，F(xiàn)129L和G137R可以引起灰霉病菌對QoI藥劑不同水平的抗藥性，但是，灰霉病菌田間抗性的產(chǎn)生主要是因?yàn)辄c(diǎn)突變G143A，藥劑壓力可以提高G143A突變基因的頻率，而且該點(diǎn)突變引起的抗性水平穩(wěn)定。研究表明灰霉病菌中存在2種類型的cyt b基因：Ⅰ型cyt b基因在第143位密碼子后緊跟內(nèi)含子；Ⅱ型cyt b基因在第143位密碼子后沒有緊跟內(nèi)含子。灰霉病菌對QoI藥劑產(chǎn)生抗性的機(jī)制主要是菌株的cyt b基因的第143位密碼子由甘氨酸(GGC)突變?yōu)榱吮彼?GCC)，即抗藥性機(jī)制為cyt b基因的G143A點(diǎn)突變。

QoI藥劑是目前市場占有率最高的一類殺菌劑，但是容易抗藥性是其面臨的主要問題。一旦產(chǎn)生抗藥性，藥劑的防治效果就會顯著降低甚至完全失效。農(nóng)民就會不斷提高藥劑的使用劑量，不但防治效果不佳，用藥量過高后還可能帶來農(nóng)產(chǎn)品安全和環(huán)境安全問題。因此，在防治灰霉病時(shí)，在施藥前如果能快速確定該地的灰霉病菌是否對QoI藥劑容易產(chǎn)生抗藥性，對于指導(dǎo)科學(xué)用藥具有十分重要的意義。而普通的生物測定技術(shù)或者PCR等分子生物學(xué)技術(shù)都不能達(dá)到這一要求，生物測定技術(shù)需要的時(shí)間很長(至少1周以上)、工作量達(dá)；PCR等分子生物學(xué)技術(shù)不但需要昂貴的儀器設(shè)備還需要熟練的高級技術(shù)操作人員。且目前的生物測定技術(shù)或者PCR等分子生物學(xué)技術(shù)都是用于時(shí)候測定病菌對藥劑的抗性狀況。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是于2000年由Notomi等首次發(fā)明、報(bào)道的一種新型、方便快捷、靈敏度極高且廉價(jià)的核酸擴(kuò)增方法。其特點(diǎn)是針對靶基因的個區(qū)域設(shè)計(jì)條特異性引物，在鏈置換DNA酶(Bst DNA polymerase)的作下，60～65℃恒溫?cái)U(kuò)增，60min左右即可觀察結(jié)果，具有操作簡單、快速、特異性強(qiáng)、產(chǎn)檢測便捷等特點(diǎn)。在反應(yīng)液中添加適當(dāng)?shù)娜玖虾徒饘匐x子，通過指示反應(yīng)液顏色變化來判斷反應(yīng)結(jié)果，加入HNB(羥基萘酚藍(lán))，在日光燈下通過肉眼即可觀察到顏色變化，陽性反應(yīng)結(jié)果會由藍(lán)紫色變成天藍(lán)色。從擴(kuò)增原理可知，擴(kuò)增過程中會產(chǎn)生大量大小不一的片段(即莖環(huán)DNA、若干倍莖長度的莖環(huán)結(jié)構(gòu)和類似花椰菜的結(jié)構(gòu))，當(dāng)用的瓊脂糖凝膠對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測時(shí)，會出現(xiàn)一系列呈梯狀的電泳條帶。因此，可以利用瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，來判斷是否進(jìn)行擴(kuò)增。待測樣品為陽性時(shí)，會出現(xiàn)呈梯狀的電泳條帶，反之，不出現(xiàn)呈梯狀的電泳條帶。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種灰霉病菌對QoIs殺菌劑抗性風(fēng)險(xiǎn)的快速評定方法，即，一種用于檢測含有BCbi143/144內(nèi)含子灰霉病菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種用于檢測含有BCbi143/144內(nèi)含子的灰霉病菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)引物，該LAMP引物組合物由SEQ ID NO.1所示的正向外引物F3，SEQ ID NO.2所示的反向外引物TB3，SEQ ID NO.3所示的正向內(nèi)引物FIP，SEQ ID NO.4所示的反向內(nèi)引物BIP組成；

本發(fā)明還同時(shí)提供了一種用于檢測含有BCbi143/144內(nèi)含子的灰霉病菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑盒，包含上述LAMP引物組合物。

作為本發(fā)明的試劑盒的改進(jìn)：LAMP引物組合物的濃度為：1.6μM的正內(nèi)向引物FIP，1.6μM的反向內(nèi)引物BIP、0.2μM正向外引物F3、0.2μM反向外引物B3。

作為本發(fā)明的試劑盒的進(jìn)一步改進(jìn)：試劑盒還包含：10×ThermoPol Buffer、dNTPs(1mM)、MgCl₂(5mM)、甜菜堿(0.8M)、羥基萘酚藍(lán)(150μM，HNB)、8U/μL Bst DNA聚合酶、ddH₂O。

備注：上述成分組成了環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)預(yù)混液。

本發(fā)明還同時(shí)提供了一種用于檢測含有BCbi143/144內(nèi)含子的灰霉病菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法：

25μL反應(yīng)體系由以下成分組成：8U/μL Bst DNA聚合酶0.5μL(4U)、10×ThermoPol Buffer 2.5μL、20μM FIP 2.0μL、20μM BIP 2.0μL、10μM F3 0.5μL、10μM B3 0.5μL、25mM MgCl₂ 5.0μL、10mM dNTPs 2.5μL、5M甜菜堿4.0μL、3.75mM羥基萘酚藍(lán)(HNB)1μL、DNA模板1μL，ddH₂O(雙蒸水)補(bǔ)足至25μL。

作為本發(fā)明的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法的改進(jìn)：

利用25μL檢測反應(yīng)體系進(jìn)行LAMP擴(kuò)增反應(yīng)，擴(kuò)增結(jié)果的分析和判定方法為選擇以下任一：

方法一、先在擴(kuò)增前加入染料羥基萘酚藍(lán)(HNB)作為反應(yīng)指示劑，以羥基萘酚藍(lán)(HNB)的顏色變化做為結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)，然后進(jìn)行LAMP擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，顏色發(fā)生變化，即顯色結(jié)果為天藍(lán)色判斷為陽性，即顯示檢測到含有BCbi143/144內(nèi)含子的灰霉病菌；顏色沒有發(fā)生變化，顯色結(jié)果仍為藍(lán)紫色判斷為陰性，即顯示樣品無含有BCbi143/144內(nèi)含子的灰霉病菌，或所含有BCbi143/144內(nèi)含子的灰霉病菌含量未達(dá)檢測限；

方法二、取5μL擴(kuò)增產(chǎn)物，用2％瓊脂糖凝膠電泳檢測，如果出現(xiàn)梯形條帶判斷為陽性，即顯示檢測到含有BCbi143/144內(nèi)含子的灰霉病菌；無擴(kuò)增條帶則判斷為陰性，即顯示無含有BCbi143/144內(nèi)含子的灰霉病菌，或所含的有BCbi143/144內(nèi)含子的灰霉病菌未達(dá)檢測限。

作為本發(fā)明的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法的進(jìn)一步改進(jìn)，LAMP擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃擴(kuò)增60min；80℃滅活10min。

作為本發(fā)明的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法的進(jìn)一步改進(jìn)：所述方法一、方法二中的檢測限D(zhuǎn)NA濃度為1pg/μL。

本發(fā)明的LAMP引物組合物能用于檢測含有BCbi143/144內(nèi)含子的灰霉病菌。

在本發(fā)明中，依據(jù)灰葡萄孢菌cytb基因第143位氨基酸后緊跟的內(nèi)含子序列，基于環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)建立了含有BCbi143/144內(nèi)含子灰霉病菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法，此種類型灰霉菌株均為對QoI藥劑抗性風(fēng)險(xiǎn)低的菌株。通過快速的現(xiàn)場含有BCbi143/144內(nèi)含子灰霉病菌檢測，能及時(shí)指導(dǎo)防治灰霉病的科學(xué)用藥。該檢測技術(shù)具有簡單、快速、成本低，靈敏性高等特點(diǎn)，能大大提高檢測效率，對灰霉病的檢測、抗藥性風(fēng)險(xiǎn)預(yù)警具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。然而，經(jīng)檢索目前國內(nèi)外尚未有含有BCbi143/144內(nèi)含子灰霉病菌的快速分子檢測的相關(guān)報(bào)道，更沒用將LAMP技術(shù)應(yīng)用于快速評價(jià)病菌對藥劑的抗藥性風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)技術(shù)或報(bào)道。

LAMP快速檢測技術(shù)特異性高，4條引物針對6個不同的區(qū)域，任何一個不能匹配反應(yīng)就無法進(jìn)行(因此，引物的設(shè)計(jì)非常重要)，因此特異性高，而且由于簡便、快速、準(zhǔn)確、廉價(jià)、以及不需要特定實(shí)驗(yàn)儀器就能快速完成檢測，所以更適用于在田間種植基地等基層部門應(yīng)用。并且本發(fā)明首次將LAMP應(yīng)用于快速評定某地灰霉病菌對藥劑抗藥性的抗藥性風(fēng)險(xiǎn)。

本發(fā)明的發(fā)明方案具體如下：

1、引物的設(shè)計(jì)和篩選

引物的篩選是LAMP檢測的關(guān)鍵因素，首先從灰霉病菌數(shù)據(jù)庫中下載cytb的基因組序列進(jìn)行比對分析，根據(jù)BCbi143/144內(nèi)含子的1205bp序列，利用在線軟件Primer Explore V5設(shè)計(jì)LAMP引物，合理設(shè)置各組引物的含量(設(shè)置CG含量為50-60％)、發(fā)夾結(jié)構(gòu)形成傾向、自身配對傾向等指標(biāo)，選擇比較優(yōu)化的組合進(jìn)行設(shè)計(jì)，調(diào)整各條引物退火溫度：Flc和Blc(64-66℃)，F(xiàn)2和B2(59-61℃)，F(xiàn)3和B3(55-60℃)，從而確定正向外引物FIP、反向內(nèi)引物BIP、正向外引物F3、反向外引物B3，篩選設(shè)計(jì)出5套引物，然后對這5套引物進(jìn)行進(jìn)一步試驗(yàn)篩選。

表1、初篩引物信息表

篩選過程為：

以篩選出能與含有BCbi143/144內(nèi)含子的灰霉病菌反應(yīng)的LAMP引物為目的，以含有BCbi143/144內(nèi)含子的灰霉病菌DNA為模板，取1μL DNA溶液，加入24μL由不同LAMP引物所配制反應(yīng)液進(jìn)行LAMP反應(yīng)，反應(yīng)溫度設(shè)為65℃，60min；反應(yīng)后觀察反應(yīng)管顏色變化，常光下，顯色結(jié)果觀察反應(yīng)管由反應(yīng)前藍(lán)紫色變成天藍(lán)色，則該引物符合實(shí)驗(yàn)要求，可繼續(xù)下一步反應(yīng)條件優(yōu)化實(shí)驗(yàn)；取5μL擴(kuò)增產(chǎn)物，用2％瓊脂糖凝膠電泳檢測作為驗(yàn)證，如果出現(xiàn)梯形條帶判斷為陽性，即顯示檢測到含有BCbi143/144內(nèi)含子的灰霉病菌，若不能進(jìn)行顯色反應(yīng)及出現(xiàn)梯形條帶，則該引物不符合實(shí)驗(yàn)要求，廢棄。

所得結(jié)果如圖1所示，具體為：設(shè)計(jì)的5套引物對應(yīng)的反應(yīng)產(chǎn)物有明暗不同的條帶出現(xiàn)，但只有S2引物組，擴(kuò)增條帶最清晰，且反應(yīng)管顏色變化最明顯?？蓪⒑蠦Cbi143/144內(nèi)含子灰霉病菌樣品擴(kuò)增出來。因此，挑選引物組S2進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

最終篩選出一套穩(wěn)定性和特異性相對最好的引物，如下述表2所示。

表2、本發(fā)明中檢測含有BCbi143/144內(nèi)含子的灰霉病菌的LAMP引物組合物

2、特異性實(shí)驗(yàn)

驗(yàn)證能特異性檢測含有BCbi143/144內(nèi)含子的灰霉病菌的LAMP引物為目的。用本發(fā)明試劑盒即上述篩選出的相對最佳引物組合，同反應(yīng)預(yù)混液構(gòu)成檢測液，對不同灰霉菌株DNA(濃度均為100ng/μL)1μL進(jìn)行檢測，加入24μL所述檢測溶液進(jìn)行LMAP反應(yīng)，并設(shè)置雙蒸水為陰性對照。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃，60min；80℃滅活10min。進(jìn)一步用2％瓊脂糖凝膠電泳檢測作為驗(yàn)證。反應(yīng)后觀察反應(yīng)管顏色變化，結(jié)果見圖3。含有BCbi143/144內(nèi)含子的灰霉病菌的反應(yīng)管均發(fā)生了顏色變化，對應(yīng)的電泳檢測結(jié)果也均有典型的LAMP梯形條帶產(chǎn)生，而不含有BCbi143/144內(nèi)含子的灰霉病菌的反應(yīng)管和陰性對照反應(yīng)前后均未發(fā)生顏色變化，電泳檢測也結(jié)果表明，沒有LAMP條帶產(chǎn)生。檢測到三株含有BCbi143/144內(nèi)含子的灰霉病菌菌株(編號為1，2，3；寄主分別為草莓，草莓，番茄)和四株不含有BCbi143/144內(nèi)含子的灰霉病菌菌株(編號為4～7，寄主分別為草莓，草莓，番茄，番茄)說明該引物組可以特異性檢測出含有BCbi143/144內(nèi)含子的灰霉病菌。

本發(fā)明通過對灰霉病菌cytb基因所含BCbi143/144內(nèi)含子的1205序列進(jìn)行LAMP引物設(shè)計(jì)，篩選出特異性強(qiáng)、靈敏度高、適用于LAMP快速分子檢測的引物，進(jìn)而建立該菌對QoI殺菌劑抗性風(fēng)險(xiǎn)的快速評定技術(shù)，可用肉眼觀察檢測結(jié)果。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下技術(shù)優(yōu)勢：

1)、實(shí)用性好。傳統(tǒng)的殺菌劑敏感性檢測的方法主要是通過分離培養(yǎng)病原菌，然后在含藥培養(yǎng)基上培養(yǎng)，根據(jù)藥劑對菌絲生長的抑制作用鑒定是否為敏感型菌株，該方法檢測周期較長，從分離到鑒定長達(dá)1周，耗時(shí)長。普通PCR反應(yīng)對產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，需要溴化乙錠(EB)染色并在紫光燈下觀察才可判別結(jié)果，且檢測時(shí)間長，檢測成本高昂，不能滿足經(jīng)濟(jì)高效檢測的需求。而LAMP反應(yīng)只需在恒溫(65℃)下進(jìn)行，反應(yīng)結(jié)束后可通過肉眼在常光下直接判斷結(jié)果，能快速檢測出病原菌抗藥性，從而增加了其在田間檢測的應(yīng)用價(jià)值。

2)、恒溫?cái)U(kuò)增。不像PCR法必須要熱循環(huán)，這樣就擺脫了對熱循環(huán)儀器的依賴，只要有穩(wěn)定的熱源如恒溫水浴鍋LAMP反應(yīng)就可以完成，不需要昂貴的儀器設(shè)備，因而便于基層農(nóng)業(yè)生產(chǎn)單位推廣應(yīng)用。LAMP之所以能在恒定的熱源下發(fā)生反應(yīng)是因?yàn)樵贚AMP反應(yīng)液中添加了甜菜堿，使雙鏈DNA處于解鏈的動態(tài)平衡中，在Bst DNA聚合酶的作用下實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增。

3)、準(zhǔn)確性高。傳統(tǒng)的灰霉病菌抗藥性檢測技術(shù)是在含藥培養(yǎng)基上培養(yǎng)鑒定，鑒定方法耗時(shí)長、易受人為及環(huán)境等諸多因素的干擾。LAMP反應(yīng)通過4條引物特異性識別靶序列上的6個獨(dú)立區(qū)域，相對于普通PCR引物識別靶序列的2個獨(dú)立區(qū)域而言，特異性和靈敏度都顯著提高，幾乎不受其他任何外源DNA和雜質(zhì)的影響。所以更適用于在田間種植基地等基層部門應(yīng)用，為生產(chǎn)中病原菌對藥劑抗藥性群體發(fā)展的風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測、抗藥性植物病害的流行預(yù)測及植物病害的綜合防控提供用藥指導(dǎo)。

附圖說明

下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的具體實(shí)施方式作進(jìn)一步詳細(xì)說明。

圖1為引物篩選圖；

a：引物篩選LAMP顯色變化圖；b：引物篩選LAMP瓊脂糖凝膠電泳圖；

M表示DL2000DNAMarker；1、2、3、4、5代表5組引物組合，6、ddH₂O陰性對照。

圖2為試劑盒通用性考察；

a：LAMP顯色變化圖；b：LAMP瓊脂糖凝膠電泳圖；

M表示DL2000DNAMarker；1、不含BCbi143/144內(nèi)含子的灰霉病菌；2、含有BCbi143/144內(nèi)含子的灰霉病菌；3、ddH₂O。

圖3為LAMP檢測不同類型灰霉菌株；

a：特異性LAMP顯色變化圖；b：LAMP瓊脂糖凝膠電泳圖；

M表示DL2000DNAMarker；1、2、3：含有BCbi143/144內(nèi)含子的不同灰霉病菌菌株；寄主分別為草莓，草莓，番茄；4、5、6、7：不含有BCbi143/144內(nèi)含子的不同灰霉病菌菌株；寄主分別為草莓，草莓，番茄，番茄；8：ddH₂O空白對照。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此。

以下實(shí)施例中使用的主要試劑及儀器Bst DNA聚合酶(New England Biolabs、MgCl₂(Sigma)，dNTPs，甜菜堿、ddhH₂O水、分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)DL DNA Maker(TaKaRa生物工程公司基因組)、真菌基因組DNA快速抽提試劑盒(生工生物工程股份有限公司)，上海精宏實(shí)驗(yàn)儀器廠DK-8D型電加熱恒溫水浴鍋。

以下所用的所有含有BCbi143/144內(nèi)含子的灰霉病菌以及不含有BCbi143/144內(nèi)含子的灰霉病菌，均已事先檢測證明了其定性的正確性。

實(shí)施例1、本發(fā)明最佳LAMP反應(yīng)引物組篩選：

根據(jù)灰霉病菌cytb基因(NW_001814458.1)，BCbi143/144內(nèi)含子的1205bp序列，設(shè)計(jì)LAMP引物，合理設(shè)置各組引物的CG含量為50-60％、發(fā)夾結(jié)構(gòu)形成傾向、自身配對傾向等指標(biāo)，選擇比較優(yōu)化的組合進(jìn)行設(shè)計(jì)，調(diào)整各條引物退火溫度：Flc和Blc(64-66℃)，F(xiàn)2和B2(59-61℃)，F(xiàn)3和B3(55-60℃)，從而確定正向外引物FIP、反向內(nèi)引物BIP、正向外引物F3、反向外引物B3，篩選設(shè)計(jì)出5套引物，以含有BCbi143/144內(nèi)含子的灰霉病菌菌株的DNA為模板進(jìn)行LAMP試驗(yàn)，篩選出能特異性檢測出含有BCbi143/144內(nèi)含子的灰霉病菌菌株的LAMP引物組合。

各引物序列如下：

F3：5’-CCTAATCAAATGGCTAAACGTATT-3’

B3：5’-CGTACAGTAACCATGGGATA-3’

FIP：5’-TGAGAATCACCTAAGAGTGAACCATGCTTTTAAACGAATAGGACCG-3’

BIP：5’-CCGATTACATGGAAACGGAACTCAAAAGTCATGCAGTCACAAT-3’。

實(shí)施例2、本發(fā)明反應(yīng)體系及檢測試劑盒體系優(yōu)化：

為了確定反應(yīng)檢測體系中各組分的最佳含量構(gòu)成，設(shè)置Bst DNA polemerase(0.08/0.16/0.24/0.32/0.40U/μL)，dNTPs(0.4/0.6/0.8/1.0/1.2mM)，甜菜堿(0.6/0.8/1.0/1.2/1.4M)，F(xiàn)3/B3引物(0.1/0.2/0.3/0.4/0.5μM)和FIP/BIP引物(0.4/0.8/1.2/1.6/2.0μM)，最終確定反應(yīng)25μL體系：1.6μM的正內(nèi)向引物FIP，1.6μM的反向內(nèi)引物BIP、0.2μM正向外引物F3、0.2μM反向外引物B3；環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)預(yù)混液：10×ThermoPol Buffer、1mM dNTPs、5mM MgCl₂、0.8M甜菜堿、150μM羥基萘酚藍(lán)(HNB)、8U/μL Bst DNA聚合酶、ddH₂O。

實(shí)施例3、一種用于檢測含有BCbi143/144內(nèi)含子的灰霉病菌的LAMP試劑盒：

該試劑盒包含環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物混合液和環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)預(yù)混液構(gòu)成的檢測溶液，引物組合混合液濃度為：1.6μM的正內(nèi)向引物FIP，1.6μM的反向內(nèi)引物BIP、0.2μM正向外引物F3、0.2μM反向外引物B3；環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)預(yù)混液：10×ThermoPol Buffer、1mM dNTPs、5mM MgCl₂、0.8M甜菜堿、150μM羥基萘酚藍(lán)(HNB)、8U/μL Bst DNA聚合酶、ddH₂O。

且LAMP引物組序列如下：

F3：5’-CCTAATCAAATGGCTAAACGTATT-3’

B3：5’-CGTACAGTAACCATGGGATA-3’

FIP：5’-TGAGAATCACCTAAGAGTGAACCATGCTTTTAAACGAATAGGACCG-3’

BIP：5’-CCGATTACATGGAAACGGAACTCAAAAGTCATGCAGTCACAAT-3’。

檢測溶液共24μL，加入待測DNA模板1μL，構(gòu)成25μL檢測反應(yīng)體系。體系中含有8U/μL Bst DNA聚合酶0.5μL(4U)、10×ThermoPol Buffer 2.5μL、20μM FIP 2.0μL、20μM BIP 2.0μL、10μM F3 0.5μL、10μM B3 0.5μL、25mM MgCl₂ 5.0μL、10mM dNTPs 2.5μL、5M甜菜堿4.0μL、3.75mM羥基萘酚藍(lán)(HNB)1μL、DNA模板1μL，雙蒸水補(bǔ)足至25μL。

實(shí)施例4、本發(fā)明試劑盒通用性考察：

選擇含有BCbi143/144內(nèi)含子的灰霉病菌，以不含有BCbi143/144內(nèi)含子的不同灰霉病菌DNA模板作為陰性對照；ddH₂O作為空白對照。取1μL DNA溶液(濃度為：100ng/μL)，加入24μL實(shí)施例3中的檢測溶液進(jìn)行LAMP反應(yīng)，反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃，60min；80℃滅活10min。反應(yīng)后觀察反應(yīng)管顏色變化，圖2可以看出，常光下，第二個PCR管中含有BCbi143/144內(nèi)含子的灰霉菌株的樣品在常光下變?yōu)樘焖{(lán)色，第一個PCR管中不含有BCbi143/144內(nèi)含子的灰霉菌株樣品的陰性對照和第三個PCR管中含有ddH₂O空白對照的反應(yīng)管均呈藍(lán)紫色；分別取5μL擴(kuò)增產(chǎn)物，用2％瓊脂糖凝膠電泳檢測，只有第二管含有BCbi143/144內(nèi)含子的灰霉菌株DNA的樣品出現(xiàn)梯形條帶，判斷為陽性，即顯示檢測到BCbi143/144內(nèi)含子的灰霉菌株，不含有BCbi143/144內(nèi)含子的灰霉菌株樣品和ddH₂O空白對照均無擴(kuò)增條帶，則判斷為陰性，說明本發(fā)明引物組合物及由此制備的試劑盒具有很好的通用性。

實(shí)施例5、本發(fā)明試劑盒對不同類型灰霉菌株特異性檢測：

用本發(fā)明試劑盒對不同類型灰霉菌株DNA進(jìn)行檢測，取不同灰霉菌株DNA 1μL作為模板(濃度均為100ng/μL)，加入24μL實(shí)施例3中的檢測溶液進(jìn)行LAMP反應(yīng)，反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃，60min；80℃滅活10min。反應(yīng)后觀察反應(yīng)管顏色變化，結(jié)果見圖3。檢測到3株含有BCbi143/144內(nèi)含子的灰霉菌株(反應(yīng)管1、2、3，反應(yīng)前后反應(yīng)管顏色由藍(lán)紫色變?yōu)樘焖{(lán)色)；反應(yīng)管4～7檢測到為不含BCbi143/144內(nèi)含子的灰霉菌株，反應(yīng)前后顏色變化不明顯，均為藍(lán)紫色；反應(yīng)管8為空白對照；凝膠電泳檢測結(jié)果與顯色結(jié)果相對應(yīng)。

實(shí)施例6、本發(fā)明試劑盒的最低檢測限(靈敏度)：

以考察本發(fā)明試劑盒檢測含有BCbi143/144內(nèi)含子的灰霉病菌的靈敏度，將含有BCbi143/144內(nèi)含子的灰霉病菌菌株DNA模板稀釋為不同的濃度梯度分別為：100ng/μL、10ng/μL、1ng/μL、100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL、100fg/μL、10fg/μL、1fg/μL。分別取不同濃度DNA 1μL作為模板，加入24μL實(shí)施例3中的檢測溶液進(jìn)行LMAP反應(yīng)，反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃，60min；80℃滅活10min。反應(yīng)后觀察反應(yīng)管顏色變化，并進(jìn)一步用2％瓊脂糖凝膠電泳檢測作為驗(yàn)證。反應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果具體為：BCbi143/144內(nèi)含子的灰霉病菌DNA模板濃度為100ng/μL、10ng/μL、1ng/μL、100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL時(shí)LAMP反應(yīng)結(jié)果均呈陽性，反應(yīng)前后反應(yīng)管的顏色由藍(lán)紫色變成天藍(lán)色，且用2％瓊脂糖凝膠電泳檢測反應(yīng)后產(chǎn)物，均有典型的LAMP梯形條帶出現(xiàn)；當(dāng)模板DNA濃度低于1pg/μL時(shí)反應(yīng)前后反應(yīng)管顏色無明顯變化，仍為藍(lán)紫色，2％瓊脂糖凝膠電泳檢測也無梯形條帶出現(xiàn)。本反應(yīng)中普通PCR的最低檢測限為100pg/μL，結(jié)果表明本發(fā)明LAMP反應(yīng)的靈敏度達(dá)到1pg/μL是普通PCR的100倍。

實(shí)施例7、本發(fā)明試劑盒的S2引物組與其他引物組優(yōu)越性對比：

根據(jù)實(shí)施例6得出，由S2引物組構(gòu)成的檢測含有BCbi143/144內(nèi)含子的灰霉病菌試劑盒的最低檢測限為1pg/μL，進(jìn)一步對比其他S1、S3、S4、S5引物組的構(gòu)成的檢測液，最低檢測限分別為100ng/μL、10ng/μL、100ng/μL、100ng/μL，但反應(yīng)產(chǎn)物顏色變化均不明顯且沒有S2引物組變化明顯，電泳檢測結(jié)果均只是有少量條帶產(chǎn)生。即使DNA濃度調(diào)至1000ng/μL，S1、S3、S4、S5引物組的構(gòu)成的檢測液反應(yīng)產(chǎn)物顏色變化仍然不明顯，此結(jié)果表明S2引物組的靈敏度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于其他引物組，且反應(yīng)前后反應(yīng)管顏色變化最明顯，電泳條帶最清晰。

實(shí)施例8、本發(fā)明試劑盒對其他外源植物病原菌的特異性檢測：

為了檢驗(yàn)本發(fā)明試劑盒的特異性，用本發(fā)明試劑盒對其他外源植物病原菌進(jìn)行LAMP檢測。以含有BCbi143/144內(nèi)含子的灰霉菌株(Botrytis cinerea)作為陽性對照，不含BCbi143/144內(nèi)含子的灰霉菌株(Botrytis cinerea)作為陰性對照，以雙蒸水作為空白對照，利用實(shí)施例3中所述的發(fā)明試劑盒，反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃，60min；80℃滅活10min，對含有cyt b-G143(2157bp)內(nèi)含子交鏈格孢(Alternaria alternata)、大豆核盤菌(Sclerotinia sclerotiorum)、膠孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)、尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)等不同基因型及病原菌為供試材料，進(jìn)行LAMP檢測。反應(yīng)檢測結(jié)果表明，只有含有BCbi143/144內(nèi)含子的灰霉菌株(Botrytis cinerea)的陽性對照的反應(yīng)產(chǎn)物發(fā)生顏色變化，電泳檢測有典型的LAMP梯形條帶，其他供試菌株反應(yīng)產(chǎn)物顏色沒有發(fā)生變化，顯色結(jié)果仍為藍(lán)紫色判斷為陰性，且電泳檢測結(jié)果也判斷為陰性。表明本發(fā)明檢測方法具有排他性和特異性。

對比例1-1、將F3、B3改成如下內(nèi)容：

F3-1：GACTAGAATTAACATCTACCGAATT

B3-1：CGAGTTCCGTTTCCATGT；

其余內(nèi)容等同于實(shí)施例3。

所得結(jié)果為：取1μLDNA模板(濃度為：100ng/μL)，加入24μL檢測溶液進(jìn)行LAMP反應(yīng)，反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃，60min；80℃滅活10min。反應(yīng)后觀察反應(yīng)管無顏色變化，結(jié)果表明該引物組構(gòu)成的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增體系不能有效檢測出含有BCbi143/144內(nèi)含子的灰霉病菌。即使將DNA模板的濃度增加至1000ng/μL，仍然無法有效區(qū)分。

對比例1-2、將F3、B3改成如下內(nèi)容：

B3-1：GGAAGTGGGGTTAAACTTG

F3-2：CAATTTGTAAAACATAGTGGGC；

其余內(nèi)容等同于實(shí)施例3。

所得結(jié)果為：取1μLDNA模板(濃度為：500ng/μL)，加入24μL檢測溶液進(jìn)行LAMP反應(yīng)，反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃，60min；80℃滅活10min。反應(yīng)后觀察反應(yīng)管無顏色變化，結(jié)果表明該引物組構(gòu)成的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增體系不能有效檢測出含有BCbi143/144內(nèi)含子的灰霉病菌。即使將DNA模板的濃度增加至1000ng/μL，仍然無法有效區(qū)分。

對比例2-1、將FIP、BIP改成如下內(nèi)容：

FIP-1：GCTGGAATACGTTTAGCCATTTGATTATGGTTTTATTAAGTGCGTCT

BIP-1：AACGAATAGGACCGCATCATCACGGTACTCAGCGTGAGAA；

其余內(nèi)容等同于實(shí)施例3。

所得結(jié)果為：取1μLDNA溶液(濃度為：100ng/μL)，加入24μL檢測溶液進(jìn)行LAMP反應(yīng)，反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃，60min；80℃滅活10min。反應(yīng)后觀察反應(yīng)管無顏色變化，結(jié)果表明該引物組構(gòu)成的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增體系不能有效檢測出含有BCbi143/144內(nèi)含子的灰霉病菌。即使將DNA模板的濃度增加至1000ng/μL，仍然無法有效區(qū)分。

對比例2-2、將FIP、BIP改成如下內(nèi)容：

FIP-2：TTGCACCGAAGATTTTAATCCAAATCAACTAACTCTTTCACTTTTGAGG

BIP-2：AGTGCAGGAGTGAAAGACCAGGTGTTGCTTTACTAAACTTCGTAAT；

其余內(nèi)容等同于實(shí)施例3。

所得結(jié)果為：所得結(jié)果為：取1μLDNA溶液(濃度為：100ng/μL)，加入24μL檢測溶液進(jìn)行LAMP反應(yīng)，反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃，60min；80℃滅活10min。反應(yīng)后觀察反應(yīng)管無顏色變化，結(jié)果表明該引物組構(gòu)成的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增體系不能有效檢測出含有BCbi143/144內(nèi)含子的灰霉病菌。即使將DNA模板的濃度增加至1000ng/μL，仍然無法有效區(qū)分。

最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的若干個具體實(shí)施例。顯然，本發(fā)明不限于以上實(shí)施例，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。

<110> 浙江農(nóng)林大學(xué)

<120> 灰霉病菌對QoIs殺菌劑抗性風(fēng)險(xiǎn)的快速評定方法

<160> 4

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物F3

<400> 1

cctaatcaaa tggctaaacg tatt 24

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物TB3

<400> 2

cgtacagtaa ccatgggata 20

<210> 3

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物FIP

<400> 3

tgagaatcac ctaagagtga accatgcttt taaacgaata ggaccg 46

<210> 4

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物BIP

<400> 4

ccgattacat ggaaacggaa ctcaaaagtc atgcagtcac aat 43