本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域,涉及一種用于結(jié)腸腺癌的分子標(biāo)志物,具體的涉及一種用于早期結(jié)腸腺癌的分子標(biāo)志物L(fēng)OC105377352。
背景技術(shù):
:結(jié)結(jié)腸癌是我國最常見的消化道惡性腫瘤之一,其發(fā)病率在我國居第三位,僅次于肺癌和胃癌,嚴重危害著人民健康。近年來,隨著人民生活水平的不斷提高,飲食習(xí)慣和飲食結(jié)構(gòu)的改變以及人口老齡化,我國結(jié)腸癌的發(fā)病率和病死率均保持上升趨勢。結(jié)腸癌的發(fā)生受到遺傳和內(nèi)外環(huán)境因素的作用,其發(fā)病是涉及到多個因素、多個步驟、多個階段的綜合復(fù)雜的病理過程,包括腸上皮細胞增殖、分化、凋亡和存活機制的紊亂?;蛩郊氨碛^遺傳學(xué)改變是結(jié)腸癌發(fā)病的重要原因。在結(jié)腸癌的臨床治療中發(fā)現(xiàn),相同病理類型、分期不同的患者,相同方案治療其療效、預(yù)后存在明顯不同。因此積極探索結(jié)腸癌形成的分子機制,尋找預(yù)測其生物學(xué)行為的標(biāo)志物對結(jié)腸癌的診斷和治療具有重要意義。隨著人類對腫瘤在基因和分子水平的深入認識,以及分子生物學(xué)的發(fā)展,人們逐漸發(fā)現(xiàn)lncRNA在腫瘤中的作用貫穿腫瘤的整個發(fā)生和發(fā)展的過程中。長鏈非編碼RNA(longnoncodingRNA,lncRNA)是一類能在多種生物學(xué)過程中發(fā)揮調(diào)控作用的大分子ncRNA。其分布廣泛,長度一般多于200個堿基,由于缺少有效開放閱讀框(ORF)而無或很少有編碼蛋白的能力。作為分子生物學(xué)中的一個全新領(lǐng)域,lncRNA是以RNA的形式在多個層面上發(fā)揮調(diào)控基因表達的作用,主要是在表觀遺傳調(diào)控、轉(zhuǎn)錄調(diào)控以及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控三個層面進行調(diào)控。lncRNA既可對癌細胞的周期、凋亡、轉(zhuǎn)移等產(chǎn)生影響,也可在表觀遺傳的層面上宏觀調(diào)控腫瘤細胞的很多特征。由于lncRNA與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有重要關(guān)系,人們看到了它在腫瘤的診治中可能具有的重大潛力。診斷方面,在腫瘤組織中往往有l(wèi)ncRNA的異常表達,其可能成為重要的腫瘤標(biāo)志物,尤其在一些腫瘤的早期,由于腫瘤組織很小,傳統(tǒng)的影像學(xué)方法很難發(fā)現(xiàn)。而通過檢測樣本中的某種lncRNA水平,卻可以方便快速了解病人患某種腫瘤的可能性。目前,lncRNA的研究還處于起步階段,對其機制和功能的認識也還在探索之中。lncRNA不僅在生物體中發(fā)揮各種重要的生物學(xué)功能,同時也參與多種疾病的發(fā)生和發(fā)展。在腫瘤研究領(lǐng)域,lncRNA仍是一個相對未知的領(lǐng)域,我們需要通過對lncRNA的不斷研究來為腫瘤的診治提供新的契機。技術(shù)實現(xiàn)要素:為了彌補現(xiàn)有技術(shù)的不足,本發(fā)明的目的之一,提供一種早期結(jié)腸腺癌的診斷產(chǎn)品,使患者在早期就得以預(yù)防,進而提高生存率和生活質(zhì)量。本發(fā)明的目的之二,提供一種分子標(biāo)志物,作為臨床應(yīng)用的檢測指標(biāo)。為了實現(xiàn)上述目的,本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:本發(fā)明提供了長鏈非編碼RNALOC105377352在制備診斷早期結(jié)腸腺癌的產(chǎn)品中的應(yīng)用。本發(fā)明中,LOC105377352指基因或從該基因轉(zhuǎn)錄的mRNA,在人類中,位于4號染色體長臂2區(qū)4帶。該基因具有7個注釋轉(zhuǎn)錄本(或剪接變體):長5110bp的LOC105377352-001(轉(zhuǎn)錄本ID為XR001741411.1.1)、長4634bp的LOC105377352-002(轉(zhuǎn)錄本ID為XR_001741410.1.1)、長4531bp的LOC105377352-003(轉(zhuǎn)錄本ID為XR_939038.2.1)、長3540bp的轉(zhuǎn)錄本LOC105377352-004(轉(zhuǎn)錄本ID為XR_001741412.1.1)、長3463bp的轉(zhuǎn)錄本LOC105377352-005(轉(zhuǎn)錄本ID為XR_001741414.1.1)、長3401的轉(zhuǎn)錄本LOC105377352-006(轉(zhuǎn)錄本ID為XR_939040.2.1)和長1785bp的轉(zhuǎn)錄本LOC105377352-007(轉(zhuǎn)錄本ID為XR_001741413.1.1)。進一步,所述LOC105377352基因產(chǎn)物為長轉(zhuǎn)錄物,其序列如SEQIDNO.1所示。進一步,所述LOC105377352在結(jié)腸腺癌患者中表達上調(diào)。進一步,所述診斷早期結(jié)腸腺癌的產(chǎn)品包括:通過測序技術(shù)、核酸雜交技術(shù)、核酸擴增技術(shù)或免疫測定的方法檢測LOC105377352基因的表達水平。進一步,所述核酸擴增技術(shù)選自聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴增、連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、鏈置換擴增和基于核酸序列的擴增。本發(fā)明提供了一種體外檢測樣品中l(wèi)ncRNALOC105377352表達水平的產(chǎn)品,其特征在于所述產(chǎn)品包括制劑、芯片、或試劑盒。進一步,所述制劑、芯片或試劑盒包括針對LOC105377352的特異性引物對或探針。其中,所述芯片包括:固相載體;以及有序固定在所述固相載體上的寡核苷酸探針,所述寡核苷酸探針特異性地對應(yīng)于上面所述的lncRNA的部分或全部序列。固相載體包括(但不限于)玻璃片、硅片、聚丙烯膜、硝酸纖維素膜、尼龍膜或聚苯乙烯膜。進一步,所述特異性引物對的序列如SEQIDNo.2和SEQIDNo.3所示。進一步,所述特異性引物對用于SYBRGreen、Taqman探針、分子信標(biāo)、雙雜交探針、復(fù)合探針的檢測。本發(fā)明提供了上面所述的產(chǎn)品在制備診斷早期結(jié)腸腺癌的工具中的應(yīng)用。本發(fā)明的優(yōu)點和有益效果:本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)了與早期結(jié)腸腺癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)的lncRNA,通過檢測該lncRNA的表達水平即可對早期結(jié)腸腺癌進行檢測,從而對早期結(jié)腸腺癌患者進行治療,提高患者的生存質(zhì)量。本發(fā)明提供了一種診斷早期結(jié)腸腺癌的產(chǎn)品,有利于結(jié)腸腺癌的早發(fā)現(xiàn),進而實現(xiàn)早治療,提供患者的生活質(zhì)量,降低治療成本。附圖說明圖1是利用高通量測序檢測結(jié)腸腺癌患者中的基因LOC105377352差異表達圖;圖2是利用QPCR檢測LOC105377352在結(jié)腸腺癌患者中的表達情況圖。具體的實施方式本發(fā)明經(jīng)過廣泛而深入的研究,通過高通量方法,采用目前覆蓋數(shù)據(jù)庫最廣的芯片,檢測基因在早期結(jié)腸腺癌患者中的表達情況,發(fā)現(xiàn)其中具有明顯表達差異的lncRNA片段,探討其與結(jié)腸腺癌的發(fā)生發(fā)展之間的關(guān)系,從而為結(jié)腸腺癌的早期檢測尋找更好的途徑和方法。通過篩選,本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)了結(jié)腸腺癌中的LOC105377352表達顯著性上調(diào),通過QPCR進行大樣本的驗證,進一步證實,該基因為早期結(jié)腸腺癌的特異性基因。分子標(biāo)志物“分子標(biāo)志物”是其在組織或細胞中的表達水平與正常或健康細胞或組織的表達水平相比發(fā)生改變的任何基因。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認識到,本發(fā)明的實用性并不局限于對本發(fā)明的標(biāo)志物基因的任何特定變體的基因表達進行定量。作為非限制性的實例,標(biāo)志物基因可具有SEQIDNO.1指定的核苷酸序列。在一些實施方案中,其具有與所列的序列至少85%相同或相似的cDNA序列諸如上述所列的序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或至少99%相同或相似的cDNA序列。本發(fā)明可以利用本領(lǐng)域內(nèi)已知的任何方法測定基因表達。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解,測定基因表達的手段不是本發(fā)明的重要方面??梢栽谵D(zhuǎn)錄水平上檢測生物標(biāo)志物的表達水平。LOC105377352基因本發(fā)明中,LOC105377352指基因或從該基因轉(zhuǎn)錄的mRNA,在人類中,位于4號染色體長臂2區(qū)4帶。該基因具有7個注釋轉(zhuǎn)錄本(或剪接變體)。在具體的實施方案中,LOC105377352基因產(chǎn)物指長轉(zhuǎn)錄物。本發(fā)明中的LOC101926969包括野生型、突變型或其片段。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認識到,本發(fā)明的實用性并不局限于對本發(fā)明的靶標(biāo)基因的任何特定變體的基因表達進行定量。如果當(dāng)核酸或其片段與其它核酸(或其互補鏈)最佳比對時(具有適當(dāng)?shù)暮塑账岵迦牖蛉笔?,在至少大約60%的核苷酸堿基、通常至少大約70%、更通常至少大約80%、優(yōu)選至少大約90%、及更優(yōu)選至少大約95-98%核苷酸堿基中存在核苷酸序列相同性,則這兩個序列是“基本同源的”(或者基本相似的)?;蛘?,當(dāng)核酸或其片段與另一核酸(或其互補鏈)、一條鏈或其互補序列在選擇性雜交條件下雜交時,則其間存在基本同源或(相同性)。當(dāng)雜交比特異性整體喪失發(fā)生更具選擇性時,存在雜交選擇性。典型地,當(dāng)在至少大約14個核苷酸的一段序列存在至少大約55%相同性、優(yōu)選至少大約65%、更優(yōu)選至少大約75%及最優(yōu)選至少大約90%相同性時,發(fā)生選擇性雜交。如本文所述,同源對比的長度可以是較長的序列節(jié)段,在某些實施方案中通常為至少大約20個核苷酸,更通常為至少大約24個核苷酸,典型為至少大約28個核苷酸,更典型為至少大約32個核苷酸,及優(yōu)選至少大約36或更多個核苷酸。因此,本發(fā)明的多核苷酸與SEQIDNO.1優(yōu)選具有至少75%、更優(yōu)選至少85%、更優(yōu)選至少90%同源性。更優(yōu)選地,存在至少95%、更優(yōu)選至少98%同源性。本發(fā)明可以利用本領(lǐng)域內(nèi)已知的任何方法測定基因表達。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解,測定基因表達的手段不是本發(fā)明的重要方面??梢栽谵D(zhuǎn)錄水平上檢測生物標(biāo)志物的表達水平。檢測技術(shù)本發(fā)明的lncRNA使用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的多種核酸技術(shù)進行檢測,這些技術(shù)包括但不限于:核酸測序、核酸雜交和核酸擴增技術(shù)。核酸測序技術(shù)的示例性非限制性實例包括但不限于鏈終止子(Sanger)測序和染料終止子測序。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將認識到,由于RNA在細胞中不太穩(wěn)定并且在實驗中更易受到核酸酶攻擊,因此在測序前通常將RNA逆轉(zhuǎn)錄成DNA。本發(fā)明可在檢測前或與檢測同時地對核酸(例如,ncRNA)進行擴增。核酸擴增技術(shù)的示例性非限制性實例包括但不限于:聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴增(TMA)、連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)、鏈置換擴增(SDA)和基于核酸序列的擴增(NASBA)。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將認識到,某些擴增技術(shù)(例如,PCR)需要在擴增前將RNA逆轉(zhuǎn)錄成DNA(例如,RT-PCR),而其他擴增技術(shù)則直接擴增RNA(例如,TMA和NASBA)。通常稱為PCR的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)使用變性、引物對與相反鏈的退火以及引物延伸的多個循環(huán),以指數(shù)方式增加靶核酸序列的拷貝數(shù);TMA的轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴增(在基本上恒定的溫度、離子強度和pH的條件下自身催化地合成靶核酸序列的多個拷貝,其中靶序列的多個RNA拷貝自身催化地生成另外的拷貝;LCR的連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)使用與靶核酸的相鄰區(qū)域雜交的兩組互補DNA寡核苷酸;其他擴增方法包括例如:通常稱為NASBA的基于核酸序列的擴增;使用RNA復(fù)制酶(通常稱為Qβ復(fù)制酶)擴增探針分子本身的擴增;基于轉(zhuǎn)錄的擴增方法;以及自我維持的序列擴增。本發(fā)明中非擴增或擴增的核酸可通過任何常規(guī)的手段檢測。芯片、試劑盒本發(fā)明提供了檢測中LOC105377352基因的表達水平的產(chǎn)品,所述產(chǎn)品包括(但不限于)制劑、芯片或試劑盒。其中芯片包括:固相載體;以及有序固定在所述固相載體上的寡核苷酸探針,所述的寡核苷酸探針特異性地對應(yīng)于LOC101926969所示的部分或全部序列。術(shù)語“探針”指能與另一分子的特定序列或亞序列或其它部分結(jié)合的分子。除非另有指出,術(shù)語“探針”通常指能通過互補堿基配對與另一多核苷酸(往往稱為“靶多核苷酸”)結(jié)合的多核苷酸探針。根據(jù)雜交條件的嚴格性,探針能和與該探針缺乏完全序列互補性的靶多核苷酸結(jié)合。探針可作直接或間接的標(biāo)記,其范圍包括引物。雜交方式,包括,但不限于:溶液相、固相、混合相或原位雜交測定法。本發(fā)明提供了一種試劑盒,所述試劑盒可用于檢測LOC101926969的表達。優(yōu)選的,所述試劑盒還可包括dNTP、隨機引物、還原劑、RNase抑制劑、反轉(zhuǎn)錄酶、MgCl2和PCR緩沖液等中的一種或多種的組合,此外,所述試劑盒還可以含有標(biāo)準(zhǔn)品和/或?qū)φ掌?;在本發(fā)明的一個優(yōu)選例中,選用了GAPDH作為內(nèi)參。優(yōu)選的,試劑盒還包含其它一些輔助試劑,所述的輔助試劑是定量PCR擴增試劑盒中常規(guī)使用的一些試劑,這些試劑的特性以及它們的配制方法均是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的;所述的試劑例如(但不限于):陰性對照品、陽性對照品;還可以包括熒光定量PCR反應(yīng)板、PCR反應(yīng)板封口膜等。本發(fā)明中基因檢測試劑盒或基因芯片可用于檢測包括LOC105377352在內(nèi)的多個基因(例如,與結(jié)腸腺癌相關(guān)的多個基因)的表達水平,將結(jié)腸腺癌的多個標(biāo)志物同時進行檢測,可大大提高結(jié)腸腺癌診斷的準(zhǔn)確率。本發(fā)明中提及的LOC105377352基因產(chǎn)物表達上調(diào),指比正常存在的更高的水平。通常,這可通過與對照比較來估計。根據(jù)特定的實施方案,lncRNA增加的水平是比對照高10%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、90%、100%、150%、200%或甚至更高的水平。根據(jù)另一個特定的實施方案,意指LOC105377352基因產(chǎn)物表達或存在,而其在正常情況下(或在對照中)缺失。換句話說,在這些實施方案中,測定LOC105377352基因產(chǎn)物增加的表達相當(dāng)于檢測LOC105377352基因產(chǎn)物的存在。通常,這種情況下,將包括對照以確保檢測反應(yīng)正確進行。本發(fā)明中,術(shù)語“樣本”以其最廣泛的含義使用。在一種含義中,意在包括從任何來源獲得的標(biāo)本或培養(yǎng)物,以及生物和環(huán)境樣本。生物樣本可獲自動物(包括人)并涵蓋液體、固體、組織和氣體。生物樣本包括血液制品,諸如血漿、血清等。然而,此類樣本不應(yīng)解釋為限制適用于本發(fā)明的樣本類型。下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步詳細的說明。以下實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體條件的實驗方法,通常按照常規(guī)條件,例如Sambrook等人,分子克?。簩嶒炇沂謨?NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件,或按照制造廠商所建議的條件。實施例1篩選與結(jié)腸腺癌相關(guān)的基因標(biāo)志物1、樣品的收集收集8例結(jié)腸腺癌組織和結(jié)腸腺癌癌旁粘膜組織樣本,所有患者手術(shù)前未接受過放療、化療,患者均知情同意,上述所有標(biāo)本的取得均通過組織倫理委員會的同意。2、RNA樣品的制備(利用QIAGEN的組織RNA提取試劑盒進行操作)1)制冰,取組織放入研缽,將其研為碎末,研磨過程要保持組織冷凍。2)將組織轉(zhuǎn)入1.5mlEP管中,加入1mlTrizol試劑,用研磨棒細研磨,漩渦混合器充分勻漿,冰浴10min。3)4℃,12000rpm離心10min。4)吸取上層水相至另一新1.5mlEP管中,加入與上清等體積的異丙醇,反復(fù)吹打,冰浴10min。5)4℃,12000rpm離心10min。6)吸取上清至另一新1.5mlEP管中,加入與上清等體積的異丙醇,反復(fù)吹打,冰浴10min。7)4℃,12000rpm離心10min,棄上清。8)加入75%乙醇1ml搖振充分混勻,4℃,7500rpm離心10min,棄上清。9)重復(fù)步驟8)。10)倒盡上清,自然干燥。DEPC水完全溶解RNA,取1μlRNA加入99μl蒸餾水,蛋白核酸分析儀測OD260及OD280。3、高通量轉(zhuǎn)錄組測序1)RNA-seq讀段定位首先將低質(zhì)量的讀段去除得到清潔讀段,然后利用TopHatv1.3.1將清潔片段與UCSCH.sapiens參考基因組(hg19)進行匹配,H.sapiensUCSChg19版的預(yù)先構(gòu)建的索引從TopHat主頁下載,并作為參考基因組,利用TopHat與基因組匹配時,允許每個讀段(默認到20)有多個匹配位點,最多2次錯配。TopHat根據(jù)外顯子區(qū)域和GT-AG剪切信號建立可能的剪切位點庫,根據(jù)這些剪切位點庫將沒有定位到基因組的讀段定位到基因組上。我們使用TopHat方法的系統(tǒng)默認參數(shù)。2)轉(zhuǎn)錄豐度評估匹配上的讀段文件通過Cufflinksv1.0.3處理,Cufflinksv1.0.3將RNA-seq片段數(shù)目進行標(biāo)準(zhǔn)化計算轉(zhuǎn)錄本的相對豐度。FPKM值指的是每一百萬測序片段中匹配到特定基因1kb長的外顯子區(qū)域的片段數(shù)目。通過貝葉斯推理方法計算FPKM估計值的置信區(qū)間。Cufflinks使用的參考的GTF注釋文件從Ensembl數(shù)據(jù)庫下載(Homo_sapiens.GRCh37.63.gtf)。3)差異表達基因的檢測將下載的EnsemblGTF文件和通過TopHat匹配的原始文件傳輸?shù)紺uffdiff,Cuffdiff使用原始的匹配文件重新估算GTF文件中列出的轉(zhuǎn)錄本的表達豐度,檢測差異表達。在Cuffidff輸出中只有q值<0.01,測試顯示成功的比較才被認為是差異表達。4、結(jié)果RNA-seq結(jié)果如圖1所示,LOC105377352基因在結(jié)腸腺癌組織中的表達量顯著高于癌旁正常組織。實施例2QPCR測序驗證LOC105377352基因的差異表達1、根據(jù)高通量測序的檢測結(jié)果選擇LOC105377352基因進行大樣本QPCR驗證。按照實施例1中的樣本收集方式選擇結(jié)腸腺癌組織和結(jié)腸腺癌癌旁粘膜組織各60例。2、RNA提取步驟同實施例1。3、逆轉(zhuǎn)錄:1)反應(yīng)體系:試劑體積MgCl22μl10×RTBuffer1μl無Rnase水3.75μldNTP混合液1μlRnase抑制劑0.25μlAMV反轉(zhuǎn)錄酶0.5μl寡聚dT適配子引物0.5μl實驗樣品1μl2)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件按照RNAPCRKit(AMV)Ver.3.0中逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件進行。42℃~55℃60min,99℃2min,5℃5min。3)聚合酶鏈反應(yīng)1)引物設(shè)計根據(jù)Genebank中LOC105377352基因和GAPDH基因的編碼序列設(shè)計QPCR擴增引物,由博邁德生物公司合成。具體引物序列如下:LOC105377352基因:正向引物為5’-AGGATGAGATGCTGAAGATAA-3’(SEQIDNO.2);反向引物為5’-TCTGTGGTGTTGGCTATT-3’(SEQIDNO.3)。GAPDH基因:正向引物為5’-CTCTGGTAAAGTGGATATTGT-3’(SEQIDNO.4);反向引物為5’-GGTGGAATCATATTGGAACA-3’(SEQIDNO.5)。2)按照表1配制PCR反應(yīng)體系:表1PCR反應(yīng)體系試劑體積正向引物0.5μl反向引物0.5μlTakaraExTaqHS12.5μl模板10μl去離子水補足25μl3)PCR反應(yīng)條件:95℃10min,(95℃30s,60℃40s)×40個循環(huán)。以SYBRGreen作為熒光標(biāo)記物,在LightCycler熒光定量PCR儀上進行PCR反應(yīng),通過融解曲線分析和電泳確定目的條帶,ΔΔCT法進行相對定量。5、統(tǒng)計學(xué)方法實驗都是按照重復(fù)3次來完成的,結(jié)果數(shù)據(jù)都是以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的方式來表示,采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件來進行統(tǒng)計分析的,兩者之間的差異采用t檢驗,認為當(dāng)P<0.05時具有統(tǒng)計學(xué)意義。6、結(jié)果結(jié)果如圖2所示,與結(jié)腸腺癌癌旁粘膜組織相比,LOC105377352基因在結(jié)腸腺癌組織中的表達上調(diào),差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),同RNA-sep結(jié)果一致。實施例3早期結(jié)腸腺癌診斷試劑盒的制備根據(jù)LOC105377352基因與結(jié)腸腺癌的相關(guān)性,可以通過檢測LOC105377352基因的表達情況來診斷結(jié)腸腺癌,據(jù)此本發(fā)明提供了一種基于檢測LOC105377352基因表達來診斷結(jié)腸腺癌的試劑盒,該診斷試劑盒中的組分如下:SYBRGreen聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系;擴增LOC105377352基因和GAPDH基因的引物對。擴增LOC105377352基因的引物對序列如SEQIDNO.2和SEQIDNO.3所示;擴增GAPDH的引物對序列如SEQIDNO.4和SEQIDNO.5所示。SYBRGreen聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系包含PCR緩沖液、dNTPs、SYBRGreen熒光染料。PCR緩沖液成分為:25mMKCl,2.5mMMgCl2、200mM(NH4)2SO4。上述實施例的說明只是用于理解本發(fā)明的方法及其核心思想。應(yīng)當(dāng)指出,對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說,在不脫離本發(fā)明原理的前提下,還可以對本發(fā)明進行若干改進和修飾,這些改進和修飾也將落入本發(fā)明權(quán)利要求的保護范圍內(nèi)。SEQUENCELISTING<110>中日友好醫(yī)院<120>一種用于結(jié)腸腺癌的分子標(biāo)志物<160>5<170>PatentInversion3.5<210>1<211>5110<212>DNA<213>人源<400>1tatatatatctcctattagttctgtccctctagagaaccctgattaatacactcacatag60tcattacataccatgtattctattttctttggggattgattttgtttaagctgtttatta120tacatgaaattgccttctctatcctcatgaaatatgacacacctttcatgatacaactta180atgtcccctcctctgtgacatttccctcctgctccttgagcacaatcactccctccctct240tctgaaatcacaaatcagcatacctccatcatagtagagggagctctgtacattatgtga300ctctagttacattatgagttcttcaaggaatttgcctttgaaactcttatcatgactagc360aatatgagatcaataaatgtttgctgttgttggaagtcaggcatagcagcttaagatcat420gtgcagcctaccaatgtatggggagaggcttagatgcaagctgctaattttttttcccct480ctctatgatcagtaccctctctcctggaaagaaaaaatatagatttggaagcaaagagaa540attcagggaatattatttcctcaaagatgagatcattaatgtatttgtgagacgaccata600aagccagctttgagagctctctattcaactataaattgttcatactggccctgctatctt660gtagctctgtttttatattcactgctgtgcttcctgaaagcaacaatttctgctaatgca720ctgaccaagcagcagcataataatcctgtcagccaacaatggatgggagctgaggattga780aaggagatgcagaatcaagactgaaagaagttaagtaacttcactctagatcatctggta840gagggtataaaggagatctagccctgggaagttaggctctaaaacctgtgccgttcctat900gaaagcacatttccttcataaaagggtaacttacatcttgtcttttctgtagtctctaag960tggttgattccataagaaagtactcaaagccagtgactgttgaactcagttttagcattt1020ttggaaactgagatccaaaaagtgtaaatgattgtgaaacgggcttcagtggcttcgttg1080caaatctagaactaaacatctttttcttttgctacaaaatgttgtaaatactgaaaacaa1140tttctcatctaattcactattgcaagctgtcgcataatttggctataatcttgaagccaa1200atggctcattttgcaggcattatttgcacagccatttcctttctttttttgtggcagtat1260atgtgtggattaggagtaactcacagcaaccaaaagtaaactaaaaacaaatatgtcatt1320tgattttaaatgtgctaaattttgtcctgatgttagtataaatagtgtataaacaagatg1380tgcacactacttggggtgggatataaggtcatgaatccttaattgtaaagaaaccaaaaa1440gtttttagaaaaagagtaggtggagaaaacagaagattattgaacaggcaataataagag1500agatttagtgagagactataaaaggcaaaaaaaaaagagaaacagctcagagactctgaa1560ctgagactatgtccaccccaaaagaagactttatgcaggggaattctggaagcagacttt1620taaataggctaatatgtaatcaagtcctgggcagactatagggtagcaagtttaacctat1680tgctgggaaaaggagctggatataaaaaaaaggaatcttgacccctctgtgaccaaagtt1740taagaaagaaacatttagcgtattattagggtgagatatatgactgtgtgtgtcttgagt1800gcagagaaaggaggcagggatactcaagggttgacagaaaaatgggtgtagcaacacgtg1860tgatgggatagaaaaagtcacaggaaagccatatgcgattgcaactttgagataaggtga1920gtaaacccacatgtgtctgtactcatgtcttaccgcttttactgatactcattttcattt1980cagtttcaagaaatcatttaagtccttttttctctgaaggtaaatcaaagtgaaagaagt2040cattaagtcaggtaacaaatacttatcaagtgcctgttgtttgctggacatagcaggagt2100gctcccaggcaaggaatagacacctatttttcagacttctgatctctttggggattgcca2160aaatgacctcaagtagtgaagatatagtggaataatctgtatttctgctgaccttgatga2220catttggatctcatttgaggtactaagaagaataagcaattggtttgaaaaaagcccttt2280taagagcaaaatgaattctgctaaagttgaagcaggaacaaatatcaaatttatggtgaa2340gctcaggtggaagaatgatgaaatcactgatgctttacaagaagtttatggggacaatgc2400cttaaagaaatcagcagtttacaaatggataacttgttttaggaaaggatgagatgctga2460agataaatcctgcagtggcaaattcatccacatcaatttgtaaggaaaaaatttatcttc2520ttcatgccctaactaaccaacatttaatagcttggacaatagccaacaccacagacatct2580caattagttcagcttacacaatcctgactaaaaaatcaaagttgagcaccttccactcaa2640ttggtgccaaaaccatggcacccagatcaactgcagacaagagtggagctttccatgaat2700attttaaacaactgggatcaagatcctgtagcatttctcaaagaatagtaacaagagatg2760aaacatagctttaccagtatgatcctgaagacaaagcacaatcaaagcaatggctaccaa2820gaggtggagtggtccagtcaaagcaaaagcagaccagtcaaaagcaagggtcatggcaac2880agtgttttgggatgcccaaggcactttgtttgctgacttgctggaaggccaaaaaacgat2940cacatctgcttattatgagagtgttctgagaaagttagccagagctttagtagaaaaatg3000cctgggaaagctccaccaaagagtccttctctaccatgacaatgctcctgctcattcatc3060tcatcaaacaagaggaaatttgtgacagtttcaatgggaaatcaataggcatccacctta3120tagtcctgatttggctccttttaacctgtttttgtttcttagtctttttttaaaaaaatc3180tttaaagggcaatcatttttcttcggtaaataatgtagagtgcattgacatggttaaaaa3240gactgcattgacatggttaaattaccagaactctcagtacattaggtatggattaaatgg3300ctgatatatcactttctcatcaatttcaagacatttttgttttctcatatgatgcatcat3360gaagcaaagatgactgaagtgcctctttgtacctgatagtttcccaatgtgtttttataa3420ttttaggttctaagcttatttttaatatgtatgtgtttctcctgtagaaaatcttggttg3480ataatttgtccttttgctacttctaggcttcccaggatatcccaatttcagagcactttt3540tatgttaatttctcacttagaggttggcaaacctcacatatattacctatttcaattata3600agcccccaaatttatgtgaggggaggcatggttacaaactcatagggaagacattttcct3660ctttacttagagcccaaaccaagacattcatttatgcaataaaagcttactaagttactg3720tgctaaagactagggatgtcataagaaacaggcaaaatctctgctctcatgaaagttata3780ttttggaagaatatccttgtgctgatggggaaattttctagtcctccagcaggaatctca3840gttttcactccctgactccattaggctcatggcctcatttcatattcttttatggttatt3900ataacccatttccatgattaccaaggctggcaatattctttcctccaccatcttcaaatt3960gaccttaccattttattttgccttcttcatttttggcaagtaggagcttggcttacttta4020ttgtaagctcagctatacatttaaaagtaaatatacaatttcttttcatcatttctatgg4080gtttggtggcacagggagttacaatatctggtctaccacattgcaggaactagatttccc4140cagatgactaactcttcagtcaaaagtcttcttttttccccgcctcaaacactttagatt4200tacttatgccactgt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