本發(fā)明屬于分子生物學技術領域，具體涉及一種基因沉默指示基因及其病毒誘導沉默載體以及構建和侵染方法。

背景技術：

柑橘屬于多年生木本植物，通過常規(guī)的遺傳轉(zhuǎn)化技術驗證基因功能，一直受到遺傳轉(zhuǎn)化率低、再生周期長和童期長等困擾。病毒誘導的基因沉默(virus-inducedgenesilencing，vigs)是一個抑制內(nèi)源基因表達的強大工具，因其具有快速、高效、高通量、便利、便宜等優(yōu)點，已被用于如馬鈴薯(solanumtuberosum)、本生煙(nicotianabenthamiana)、擬南芥(arabidopsisthaliana)、西紅柿、水稻(oryzasativa)和玉米(zeamays)等多種植物的基因功能研究。目前，多個vigs載體被應用于解析代謝途徑、植物發(fā)育、生物和非生物脅迫。近年來，多種vigs載體相繼得到開發(fā)并在多種植物中得到廣泛的應用。其中，煙草脆裂病毒(trv)是目前應用最廣泛的vigs載體，它是由trv1與trv2兩條rna病毒鏈組成，trv1用于輔助載有靶基因片段的trv2在植物體內(nèi)移動。trv作為病毒載體有諸多優(yōu)點，比如病毒癥狀較輕、沉默效率高且持久、各種組織均可產(chǎn)生沉默等，因而被廣泛應用。雖然，來源于柑橘的葉皰斑病毒(citrusleafblotchvirus，clbv)和衰退病病毒(citrustristezavirus，ctv)的載體已在柑橘中建立沉默體系，但存在基因沉默表型出現(xiàn)慢、不是很穩(wěn)定，未被應用于更廣泛的基因功能研究。trv是很多草本和少數(shù)木本植物中廣泛應用于鑒定基因功能的vigs載體。在這些寄主植物中，trv引起的癥狀比其它載體相對溫和，并且能夠快速地傳遞到分生組織、根、果實、花和葉等整個植株，甚至通過種子傳到子代。然而，trv載體是否能夠有效地抑制柑橘中的內(nèi)源基因表達，目前尚未見報道。

magnesiumchelatasesubuniti(chll)基因是控制葉綠素的生物合成相關的基因，在一些植物中被作為一個通用的vigs報告基因，沉默此基因?qū)е氯~片形成黃化現(xiàn)象。目前柑橘的chll基因目前還未得到證實和報道。

技術實現(xiàn)要素：

針對以上問題，本發(fā)明一方面提供一種用于trv介導的基因沉默系統(tǒng)中的指示基因，其核酸序列如seqidno:1所示。

本發(fā)明另一方面提供了一種含有柑橘chll指示基因的病毒誘導沉默載體，所述載體為trv介導的柑橘chll基因病毒誘導沉默載體，其含有如seqidno:1所示的核苷酸序列。

本發(fā)明另一方面還提供了一種上述含有柑橘chll指示基因的病毒誘導沉默載體的構建方法，包括如下步驟：

(1)提取柑橘植株cdna；

(2)以柑橘植株cdna為模板，以引物cichll-v2-f和cichll-v2-r進行pcr擴增，引物序列為：

cichll-v2-f：5’-tctagaggtctgtgggacgattgacat-3’，

cichll-v2-r：5’-gagctccgagctctctcctccacaatc-3’；

(3)將步驟(2)的擴增產(chǎn)物進行回收純化得到目的基因片段；

(4)用xbai和saci限制性內(nèi)切酶分別對trv2載體和步驟(3)得到的目的基因片段進行雙酶切；

(5)將步驟(4)得到的目的基因片段和trv2載體的酶切產(chǎn)物進行連接；

(6)將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至dh5α感受態(tài)細胞，篩選得到陽性克隆，提取質(zhì)粒，即得。

在上述技術方案中，所述步驟(2)中的pcr反應程序為：98℃變性10s，56℃退火30s，72℃延伸30s，35個循環(huán)。

本發(fā)明另一方面還提供了一種重組載體侵染柑橘幼苗的方法，包括如下步驟：

(1)將上述制備得到的病毒誘導沉默載體進行擴繁得到擴繁菌液，與trv1的擴繁菌液混合，得到侵染液；

(2)將柑橘幼苗浸入侵染液，在真空條件下進行浸染10s～30min，或采用無菌注射器將重懸液注射葉片；

(3)用清水沖洗浸染的部位后，將幼苗移至光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為19～28℃，白天光照14～18h，夜間黑暗培養(yǎng)6～10h，保持50～95％的濕度進行培養(yǎng)。

本發(fā)明另一方面還提供了一種用于如seqidno:1所示指示基因的實時熒光定量檢測的引物組，所述引物組的上、下游序列為：

cichll-qpcr-f：5’-agatccagaggccatgggtat-3’，

cichll-qpcr-r：5’-atcgtcccacagaccctgtct-3’。

本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明首次成功證實了柑橘的chll基因，并利用trv成功構建了沉默柑橘chll基因的誘導載體，首次證明trv能夠成功應用于柑橘基因沉默和功能驗證，為柑橘類植物的基因功能研究奠定了很好的基礎。本發(fā)明的基因沉默載體構建簡易，沉默表型顯著，性狀表現(xiàn)持久，為快速的基因功能研究起到良好的指示作用。

附圖說明

圖1是trv2-cichll和trv1混合的重懸液侵染柑橘幼苗后的熒光觀察圖。

圖2是處理組浸染的柑橘幼苗的dna常規(guī)pcr擴增產(chǎn)物電泳圖，v1：trv1部分片段，v2：trv2部分片段，g：gfp部分片段，m：dl2000marker。

圖3是墨西哥萊檬和長壽金柑用對照組和處理組進行侵染后14天時的植株葉片表型圖，mxglm：墨西哥萊檬，csk：長壽金柑，c+：對照組，chll-trv：處理組。

圖4是長壽金柑侵染后14天chll基因qrt-pcr表達量檢測結果圖，chll-trv：處理組，trv+：對照組，trv-：未進行侵染的植株。

具體實施方式

以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。

主要試劑及生產(chǎn)者：

primescript^tm1ststrandcdnasynthesiskit、t4dnaligase、ex：takara公司，日本。

biospingelextractionkit：杭州博日科技有限公司，中國。

限制性內(nèi)切酶xbai、saci：thermoscientific公司，美國。

trv1、trv2-gfp、trv2載體：中國農(nóng)業(yè)科學院柑桔研究所資源育種研究室保存提供。

dh5α感受態(tài)細胞：takara公司，日本。

eha105農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞：中國農(nóng)業(yè)科學院柑桔研究所資源育種研究室保存提供。

e.z.n.a.tmplasmidminikiti：omegabio-tek公司，美國。

總rna提取試劑盒：天根公司，中國。

實施例1柑橘chll基因病毒誘導沉默載體的構建

1、提取柑橘葉片cdna：用cdna提取試劑盒primescript^tm1ststrandcdnasynthesiskit提取柑橘葉片cdna。

2、擴增柑橘chll基因

從擬南芥基因組數(shù)據(jù)庫搜尋到chll的氨基酸序列，通過與柑橘的基因組數(shù)據(jù)庫(http://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)進行blast比對后獲得同源基因序列，根據(jù)該同源基因設計帶有酶切位點的柑橘chll基因的pcr擴增引物cichll-v2-f和cichll-v2-r，引物序列為：

cichll-v2-f：5’-tctagaggtctgtgggacgattgacat-3’(seqidno:2)，

cichll-v2-r：5’-gagctccgagctctctcctccacaatc-3’(seqidno:3)。

以柑橘葉片cdna為模板，利用引物cichll-v2-f和cichll-v2-r，采用takara公司的ex(pcr反應體系參照說明書)進行pcr擴增，pcr反應程序為98℃變性10s，56℃退火30s，72℃延伸30s，35個循環(huán)。

3、pcr產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳得到348bp的基因片段，用膠回收純化試劑盒biospingelextractionkit回收純化目的片段，對回收片段進行測序，其序列如seqidno:1所示，認為該序列為柑橘的chll基因，有待后續(xù)進一步驗證。

4、用fastdigestxbai和saci限制性內(nèi)切酶分別對回收純化的目的基因片段和trv2載體進行雙酶切(酶切體系參照說明書)，37℃酶切5-30min。

5、將前述得到的目的基因片段和trv2載體酶切產(chǎn)物回收純化后，用t4dnaligase進行連接(連接方法參照說明書)。

6、連接產(chǎn)物42℃熱激90s，轉(zhuǎn)化至dh5α感受態(tài)細胞，挑取陽性克隆利用質(zhì)粒提取試劑盒e.z.n.a.tmplasmidminikiti提取質(zhì)粒(提取方法參照說明書)，得到重組質(zhì)粒，命名為trv2-cichll質(zhì)粒，即得到柑橘chll基因的病毒誘導沉默載體。

實施例2制備擴繁菌液

分別取0.5μl的trv1、trv2-gfp、trv2-cichll質(zhì)粒，采用電擊法分別轉(zhuǎn)化到20μl的eha105農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞，涂布到lb固體培養(yǎng)基(含50mg/l卡那霉素、50mg/l慶大霉素和50mg/l利福平)，置于28℃暗培養(yǎng)2-3天。挑取含有trv1、trv2-gfp、trv2-cichll農(nóng)桿菌的單克隆至lb液體培養(yǎng)基(50mg/l含卡那霉素、50mg/l慶大霉素和50mg/l利福平)，置于28℃搖床上200r/min過夜培養(yǎng)，收集農(nóng)桿菌細胞，用mma(含10mmmgcl2，10mm2-嗎啉乙磺酸(mes),100μm乙酰丁香酮(acetosyringone))液體重懸菌體，調(diào)od600至0.5以上。分別向trv2-gfp、trv2-cichll重懸液中加入等體積的trv1重懸液，然后加入重懸液體積0.05～0.25％的silwetl-77表面活性劑，混勻后靜置1h以上。將trv2-gfp和trv1混合的重懸液作為對照組，將trv2-cichll和trv1混合的重懸液作為處理組。

實施例3浸染

用實施例2制備的對照組和處理組重懸液分別去浸染不同的柑橘幼苗，然后檢測侵染是否成功，按照如下步驟操作：

(1)將柑橘幼苗浸入重懸液，在真空條件下進行浸染10s～30min?；虿捎脽o菌注射器將重懸液注射葉片。

(2)用清水沖洗浸染的部位后，將幼苗移至光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為19～28℃，白天光照16h，夜間黑暗培養(yǎng)8h，保持50～95％的濕度進行培養(yǎng)。

(3)侵染結果檢測

a、用對照組和處理組侵染的柑橘幼苗，都能檢測到綠色熒光，處理組幼苗熒光觀察如圖1所示。

b、用pcr方法檢測侵染后的幼苗：

①采用常規(guī)pcr方法擴增

提取顯示熒光的幼苗的dna(ctab法)，分別用擴增trv1、trv2、gfp的引物組trv1-f/trv1-r、trv2-f/trv2-r、trv2-gfp-f/trv2-gfp-r進行常規(guī)pcr擴增，在對照組和處理組侵染的柑橘幼苗中都能檢測到trv1、trv2、gfp的部分片段，處理組的擴增結果如圖2所示。

所述引物的序列如下：

trv1-f：5’-ttgggttgctactgattcgact-3’(seqidno:4)，

trv1-r：5’-ctgtaaggaccatcatacttcgc-3’(seqidno:5)，

trv2-f：5’-attcactgggagatgatacgct-3’(seqidno:6)，

trv2-r：5’-gaatctaagtccactcgtccgt-3’(seqidno:7)，

trv2-gfp-f：5’-ctgcccgacaaccactacct-3’(seqidno:8)，

trv2-gfp-r：5’-cttgtacagctcgtccatgcc-3’(seqidno:9)。

②采用實時熒光定量pcr檢測侵染后的幼苗中cichll基因表達量

侵染后培養(yǎng)14天后，從植株表型可以觀察到(如圖3所示)：侵染了對照組重懸液的墨西哥萊檬和長壽金柑植株的葉片并未發(fā)生黃化現(xiàn)象，而侵染了處理組重懸液的葉片則出現(xiàn)了黃化現(xiàn)象，進一步證明seqidno:1就是柑橘的chll基因。處理組重懸液誘導的沉默效率如表1所示：

表1處理組誘導的不同品種的沉默效率

然后，用總rna提取試劑盒提取長壽金柑對照組、處理組、未進行任何處理的幼苗的總rna，利用引物cichll-qpcr-f(5’-agatccagaggccatgggtat-3’，seqidno:10)、cichll-qpcr-r(5’-atcgtcccacagaccctgtct-3’，seqidno:11)進行qrt-pcr表達量檢測。檢測結果如圖4所示，可見在侵染后14天，用處理組處理的沉默植株的cichll基因的表達量明顯下降，進一步證明seqidno:1就是柑橘的chll基因，本申請構建的trv介導的病毒誘導沉默載體trv-cichll能夠成功沉默柑橘的chll基因。

序列表

<110>中國農(nóng)業(yè)科學院柑桔研究所

<120>基因沉默指示基因及其病毒誘導沉默載體以及構建和侵染方法

<130>1

<160>11

<210>1

<211>348

<212>dna

<213>人工序列

<223>柑橘chll基因

<400>1

ggtctgtgggacgattgacattgagaaagctctaacggagggtgtcaaagcatttgagcc60

tggccttcttgctaaagctaacagaggaattctttatgttgatgaagttaatcttctgga120

tgaccatttagtggatgttcttttggattctgctgcctcgggatggaacacagtagagag180

agagggcatttcaatttcacatcctgcaaggtttattctgattggttcaggtaatcctga240

ggaaggagagctaaggcctcagctgcttgatcggtttggaatgcatgcccaagtggggac300

tgtaagggatgcagaactcagagtaaagattgtggaggagagagctcg348

<210>2

<211>27

<212>dna

<213>人工序列

<223>cichll-v2-f

<400>2

tctagaggtctgtgggacgattgacat27

<210>3

<211>27

<212>dna

<213>人工序列

<223>cichll-v2-r

<400>3

gagctccgagctctctcctccacaatc27

<210>4

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<223>trv1-f

<400>4

ttgggttgctactgattcgact22

<210>5

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<223>trv1-r

<400>5

ctgtaaggaccatcatacttcgc23

<210>6

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<223>trv2-f

<400>6

attcactgggagatgatacgct22

<210>7

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<223>trv2-r

<400>7

gaatctaagtccactcgtccgt22

<210>8

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<223>trv2-gfp-f

<400>8

ctgcccgacaaccactacct20

<210>9

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<223>trv2-gfp-r

<400>9

cttgtacagctcgtccatgcc21

<210>10

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<223>cichll-qpcr-f

<400>10

agatccagaggccatgggtat21

<210>11

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<223>cichll-qpcr-r

<400>11

atcgtcccacagaccctgtct21