本發(fā)明涉及一種新的殺蟲(chóng)蛋白及其核苷酸序列。
背景技術(shù)：
蟲(chóng)害是造成農(nóng)作物減產(chǎn)的重要原因之一，減少蟲(chóng)害的損失是增加糧食與飼料作物產(chǎn)量的重要途徑。據(jù)統(tǒng)計(jì)全球糧食與飼料作物總產(chǎn)量每年因蟲(chóng)害造成的損失達(dá)14％，直接給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成的經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)數(shù)千億美元。我國(guó)每年因蟲(chóng)害造成的損失水稻減產(chǎn)10％、小麥減產(chǎn)20％、棉花減產(chǎn)30％以上。
其中，棉鈴蟲(chóng)(helicoverpaarmigera)和玉米螟(ostriniafurnacalis)是兩種廣泛分布于世界各地重要的農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)。
棉鈴蟲(chóng)屬鱗翅目夜蛾科，寄主很廣，已知的寄主便有200多種，在蔬菜上主要危害茄科和豆類，其中以番茄和辣椒受害最重，除此外還危害十字花科蔬菜和瓜類。在作物上是棉花、花生、大豆上的重要害蟲(chóng)，并且還可危害小麥、玉米、高粱、豆類、煙草、芝麻、向日葵、蘋(píng)果、梨、桃、葡萄等。多食性，區(qū)域性災(zāi)變是棉鈴蟲(chóng)發(fā)生的特點(diǎn)，對(duì)它的防控是我國(guó)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)面對(duì)的長(zhǎng)期問(wèn)題，上世紀(jì)棉鈴蟲(chóng)危害棉花造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，當(dāng)時(shí)棉鈴蟲(chóng)的防治還主要依賴化學(xué)藥劑，對(duì)環(huán)境和人畜造成了嚴(yán)重的危害，以及產(chǎn)生了嚴(yán)重的抗藥性問(wèn)題。
玉米螟(ostriniafurnacalis)俗名鉆心蟲(chóng)，屬鱗翅目螟蛾科，是我國(guó)玉米生產(chǎn)上最重要的害蟲(chóng)，低齡幼蟲(chóng)危害玉米心葉，大齡幼蟲(chóng)鉆蛀危害玉米莖稈、雄穗柄、雌穗柄和雌穗，每年因亞洲玉米螟的危害造成的產(chǎn)量損失為600萬(wàn)到900萬(wàn)噸。
采用噴施化學(xué)農(nóng)藥和生物殺蟲(chóng)劑等防治手段固然可以減輕害蟲(chóng)對(duì)農(nóng)作物的為害，但化學(xué)農(nóng)藥造成環(huán)境污染，生物殺蟲(chóng)劑成本較高。長(zhǎng)期以來(lái)，大量噴施化學(xué)殺蟲(chóng)劑，不僅會(huì)增強(qiáng)害蟲(chóng)的抗藥性，使益蟲(chóng)及其它生態(tài)區(qū)系遭受破壞，而且嚴(yán)重污染環(huán)境，提高生產(chǎn)成本，破壞生態(tài)平衡。因此，減少殺蟲(chóng)劑使用量，發(fā)展現(xiàn)代植物保護(hù)技術(shù)，已成為可持續(xù)發(fā)展農(nóng)業(yè)中必須正視的課題之一。
蘇云金芽胞桿菌(bacillusthuringiensis，簡(jiǎn)稱bt)是一種分布廣泛的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，是一種對(duì)害蟲(chóng)毒力強(qiáng)且對(duì)天敵無(wú)毒性的昆蟲(chóng)病原微生物，對(duì)高等動(dòng)物和人無(wú)毒性。它是目前研究最為深入、使用最為廣泛的微生物殺蟲(chóng)劑，對(duì)16個(gè)目3000多種害蟲(chóng)有活性。bt在芽胞形成期可形成殺蟲(chóng)晶體蛋白(insecticidalcrystalproteins，icps)，也稱δ-內(nèi)毒素(delta-endotoxin)[bravo.a.,gills.s.,
1996年全世界第一例轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)植物在美國(guó)獲準(zhǔn)應(yīng)用，它使用的基因來(lái)自btcry1ac。在接下來(lái)的幾年里，轉(zhuǎn)cry1ab基因的抗蟲(chóng)玉米，轉(zhuǎn)cry3aa基因的抗蟲(chóng)土豆等相距問(wèn)世。在中國(guó)，自1998年開(kāi)始正式推廣含有cry1ac/cry1a基因的抗蟲(chóng)棉以來(lái)，已經(jīng)被普遍種植，棉鈴蟲(chóng)的危害也得到了很好的控制。從1996年到2015年的20年期間全球轉(zhuǎn)基因作物累計(jì)種植面積達(dá)到空前的20億公頃，相當(dāng)于中國(guó)大陸總面積(9.56億公頃)或美國(guó)總面積(9.37億公頃)的2倍。這累計(jì)的20億公頃包括：10億公頃轉(zhuǎn)基因大豆、6億公頃轉(zhuǎn)基因玉米、3億公頃轉(zhuǎn)基因棉花和1億公頃轉(zhuǎn)基因油菜。20年間，農(nóng)民獲益超過(guò)1500億美元。二十年的商業(yè)化證明，轉(zhuǎn)基因作物已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了其先前的承諾，為農(nóng)民乃至為全社會(huì)帶來(lái)了農(nóng)業(yè)、環(huán)境、經(jīng)濟(jì)、健康和社會(huì)效益。轉(zhuǎn)基因作物的快速應(yīng)用表明，那些進(jìn)行了轉(zhuǎn)基因作物商業(yè)化種植的發(fā)達(dá)國(guó)家的大農(nóng)場(chǎng)主和發(fā)展中國(guó)家的小農(nóng)戶都已經(jīng)認(rèn)識(shí)到這種巨大的多重收益。
然而，由于目前商品化的轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)作物的抗蟲(chóng)基因種類比較單一，如此大面積推廣種植存在害蟲(chóng)避難所減少與害蟲(chóng)抗藥性上升的風(fēng)險(xiǎn)。因此需要不斷分離更高毒力的基因或者新的基因組合來(lái)避免害蟲(chóng)抗藥性上升的風(fēng)險(xiǎn)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
為此，本申請(qǐng)之一提供了一種殺蟲(chóng)蛋白，其具有如(i)和(ii)中的至少一種的氨基酸序列：
(i)seqidno.2所示的氨基酸序列；
(ii)與如seqidno.2所示的氨基酸序列的一致性在98％以上，且與如seqidno.2所示的氨基酸序列具有相同功能的氨基酸序列。
通過(guò)(ii)限定的殺蟲(chóng)蛋白在與如seqidno.2所示的氨基酸序列具有相同功能的同時(shí)，也具有與如seqidno.2所示的氨基酸序列相當(dāng)或者更優(yōu)的效果，因此可以明顯地除去已經(jīng)被公開(kāi)的殺蟲(chóng)蛋白。
其中，全長(zhǎng)殺蟲(chóng)晶體蛋白可以經(jīng)過(guò)蛋白酶等作用的切割，切割得到約52-65kda(例如具有55-60kda)的蛋白后能夠更好地發(fā)揮其活性。因此，具有如(ii)的氨基酸序列的所述的殺蟲(chóng)蛋白可以是具有如(i)的氨基酸序列經(jīng)過(guò)胰凝乳蛋白酶和/或胰蛋白酶消化后獲得的具有52-65kda的蛋白，且與如seqidno.2所示的氨基酸序列具有相同功能的氨基酸序列；優(yōu)選具有如(ii)的氨基酸序列的所述的殺蟲(chóng)蛋白可以是具有如(i)的氨基酸序列經(jīng)過(guò)胰凝乳蛋白酶和/或胰蛋白酶消化后獲得的具有55-60kda的蛋白，且與如seqidno.2所示的氨基酸序列具有相同功能的氨基酸序列。
所述的切割可以一般發(fā)生在有害生物的腸道之內(nèi)，但也可以人為地有目的地改造為具有相同功能的52-65kda(例如具有55-60kda)的蛋白。
在一個(gè)具體實(shí)施例中，優(yōu)選殺蟲(chóng)蛋白的氨基酸序列為與如seqidno.2所示的氨基酸序列的一致性在99％以上，且與如seqidno.2所示的氨基酸序列具有相同功能的氨基酸序列。通過(guò)這種方式限定的殺蟲(chóng)蛋白在與如seqidno.2所示的氨基酸序列具有相同功能的同時(shí)，也具有與如seqidno.2所示的氨基酸序列相當(dāng)或者更優(yōu)的效果，因此可以明顯地除去已經(jīng)被公開(kāi)的殺蟲(chóng)蛋白。
在一個(gè)具體實(shí)施例中，優(yōu)選殺蟲(chóng)蛋白的氨基酸序列為與如seqidno.2所示的氨基酸序列的一致性在99.5％以上，且與如seqidno.2所示的氨基酸序列具有相同功能的氨基酸序列。通過(guò)這種方式限定的殺蟲(chóng)蛋白在與如seqidno.2所示的氨基酸序列具有相同功能的同時(shí)，也具有與如seqidno.2所示的氨基酸序列相當(dāng)或者更優(yōu)的效果，因此可以明顯地除去已經(jīng)被公開(kāi)的殺蟲(chóng)蛋白。
在一個(gè)具體實(shí)施例中，所述殺蟲(chóng)蛋白還可以為如(i)的氨基酸序列經(jīng)過(guò)取代和/或缺失和/或添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸后，與具有如(i)的氨基酸序列的殺蟲(chóng)蛋白具有相同功能的蛋白。通過(guò)這種方式限定的殺蟲(chóng)蛋白在與如seqidno.2所示的氨基酸序列具有相同功能的同時(shí)，也具有與如seqidno.2所示的氨基酸序列相當(dāng)或者更優(yōu)的效果，因此可以明顯地除去已經(jīng)被公開(kāi)的殺蟲(chóng)蛋白。
本申請(qǐng)的殺蟲(chóng)蛋白對(duì)害蟲(chóng)體重的抑制活性，特別是對(duì)棉鈴蟲(chóng)和玉米螟的體重抑制活性顯著優(yōu)于現(xiàn)有技術(shù)中的殺蟲(chóng)蛋白的抑制活性，因此，其不但豐富殺蟲(chóng)基因資源，為轉(zhuǎn)基因作物與工程菌株提供新的基因來(lái)源，提高bt轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的抗蟲(chóng)效果，并且可以降低害蟲(chóng)對(duì)bt毒蛋白的抗性風(fēng)險(xiǎn)，避免新的生態(tài)災(zāi)難降臨，具有重要的經(jīng)濟(jì)、社會(huì)和生態(tài)效益。殺蟲(chóng)蛋白對(duì)棉鈴蟲(chóng)和玉米螟等害蟲(chóng)具有的優(yōu)良的體重抑制作用使得大多數(shù)害蟲(chóng)不能完成其生長(zhǎng)發(fā)育，不但會(huì)大大減少害蟲(chóng)的取食量，達(dá)到了保護(hù)植物的目的；而且即使有小部分可以發(fā)育為成蟲(chóng)，其產(chǎn)生的后代的質(zhì)量和數(shù)量都會(huì)受到影響，比如其后代容易產(chǎn)生某些缺陷。從某種程度上來(lái)講，這種對(duì)害蟲(chóng)的體重抑制作用一方面有利于延緩害蟲(chóng)的抗性，另一方面對(duì)害蟲(chóng)產(chǎn)生的后代不利，從而減弱其整個(gè)種群在環(huán)境中的優(yōu)勢(shì)地位，屬于不可多得的防治害蟲(chóng)的植保材料。
本申請(qǐng)之二提供了一種核苷酸序列，所述核苷酸序列為編碼如本申請(qǐng)之一所述的殺蟲(chóng)蛋白中任意一種的核苷酸序列。該核苷酸序列可以以其來(lái)源菌株為模板，或以克隆的全長(zhǎng)dna片段為模板，通過(guò)pcr擴(kuò)增得到；也可以根據(jù)給定的序列人工合成。
在一個(gè)具體的實(shí)施例中，當(dāng)所述殺蟲(chóng)蛋白的氨基酸序列如seqidno.2所示時(shí)，編碼所述殺蟲(chóng)蛋白的所述核苷酸序列如seqidno.1所示。
本申請(qǐng)之三提供了一種組合物，其包括如本申請(qǐng)之一所述殺蟲(chóng)蛋白的至少一種。
在一個(gè)具體的實(shí)施例中，當(dāng)所述殺蟲(chóng)蛋白的氨基酸序列如seqidno.2所示時(shí)，編碼所述殺蟲(chóng)蛋白的核苷酸序列如seqidno.1所示。
本申請(qǐng)之四提供了一種含有本申請(qǐng)之二所述的核苷酸序列，且能產(chǎn)生本申請(qǐng)之一相應(yīng)的所述的殺蟲(chóng)蛋白的轉(zhuǎn)基因微生物。
在一個(gè)具體的實(shí)施例中，優(yōu)選所述轉(zhuǎn)基因微生物包括芽胞桿菌(bacillus)、假單胞菌(pseudomonas)、腸桿菌(escherichia)和酵母(saccharomyces)中的至少一種。
在一個(gè)具體的實(shí)施例中，優(yōu)選所述芽胞桿菌包括蘇云金芽胞桿菌(bacillusthuringiensis)、枯草芽胞桿菌(bacillussubtilis)、萎縮芽胞桿菌(bacillusatrophaeus)和蠟樣芽胞桿菌(bacilluscereus)中的至少一種；所述假單胞菌包括熒光假單胞桿菌(pseudomonasfluorescens)；所述腸桿菌包括大腸桿菌(escherichiacoli)。
在一個(gè)具體實(shí)施例中，本申請(qǐng)的轉(zhuǎn)基因微生物的出發(fā)株(即在轉(zhuǎn)入本申請(qǐng)之二所述的核苷酸序列之前的微生物)為野生微生物和/或遺傳工程微生物。
其中，野生微生物是指從自然界中分離出的未經(jīng)過(guò)人工改造的微生物。
遺傳工程微生物是指將野生微生物人工改造的微生物。
本申請(qǐng)的轉(zhuǎn)基因微生物和/或遺傳工程微生物的物種并不因進(jìn)行了轉(zhuǎn)基因修飾而改變，因此，轉(zhuǎn)基因微生物與發(fā)生轉(zhuǎn)基因之前的微生物(即作為受體微生物)為相同的物種。
在一個(gè)具體實(shí)施例中，如上的本申請(qǐng)二的所述的核酸序列能夠被連接在表達(dá)載體上。所述表達(dá)載體例如可以是能夠在大腸桿菌和蘇云金芽胞桿菌中穿梭的pstk表達(dá)載體。
本申請(qǐng)之五提供了根據(jù)本申請(qǐng)之二所述的核苷酸序列在制備轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用，其中，所述轉(zhuǎn)基因植物能夠產(chǎn)生如本申請(qǐng)之一所述的殺蟲(chóng)蛋白；所述轉(zhuǎn)基因植物包括禾本科(liliaceae)、豆科(leguminosae)、藜科(chenopodiaceae)、菊科(compositae)、和錦葵科(malvaceae)中的至少一種。
在一個(gè)具體的實(shí)施例中，優(yōu)選所述轉(zhuǎn)基因植物包括蜀黍?qū)?zea)、高梁屬(sorghum)、狗尾巴草屬(setaria)、稻屬(oryza)、甘蔗屬(saccharum)、小麥屬(triticum)、大豆屬(glycine)、苜蓿屬(medicago)、甜菜屬(beta)、向日葵屬(helianthus)和棉屬(gossypium)中的至少一種。
在一個(gè)具體的實(shí)施例中，優(yōu)選所述轉(zhuǎn)基因植物包括玉米(zeamaysl.)、高粱(sorghumbicolor(l.)moench)、谷子(setariaitalica)、水稻(oryzasatival.)、甘蔗(saccharumofficinarum)、小麥(triticumaestivum)、大豆(glycinemax(l.)merr)、苜蓿(medicagosativalinn)、甜菜(betavulgaris)、向日葵(helianthus)、亞洲棉(gossypiumarboreuml.)、非洲棉(gossypiumherbaceuml.)、陸地棉(gossypiumhirsutuml.)和海島棉(gossypiumbarbadensel.)中的至少一種。
轉(zhuǎn)基因植物的物種并不因進(jìn)行了轉(zhuǎn)基因修飾而改變，因此，轉(zhuǎn)基因植物與發(fā)生轉(zhuǎn)基因之前的植物(即作為受體植物)為相同的物種。
本申請(qǐng)之六提供了一種制備如本申請(qǐng)之一所述的殺蟲(chóng)蛋白的方法，其包括利用本申請(qǐng)之四所述的轉(zhuǎn)基因微生物，和/或利用本申請(qǐng)之五所述的應(yīng)用中的轉(zhuǎn)基因植物來(lái)生產(chǎn)所述殺蟲(chóng)蛋白。
在一個(gè)具體的實(shí)施例中，優(yōu)選還包括在利用所述轉(zhuǎn)基因微生物和/或轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)所述殺蟲(chóng)蛋白后，純化所述殺蟲(chóng)蛋白使所述殺蟲(chóng)蛋白的純度達(dá)到80％以上。
在一個(gè)具體的實(shí)施例中，更優(yōu)選在利用所述轉(zhuǎn)基因微生物和/或轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)所述殺蟲(chóng)蛋白后，純化所述殺蟲(chóng)蛋白使所述殺蟲(chóng)蛋白的純度達(dá)到90％以上。
在一個(gè)具體的實(shí)施例中，甚至是在利用所述轉(zhuǎn)基因微生物和/或轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)所述殺蟲(chóng)蛋白后，純化所述殺蟲(chóng)蛋白使所述殺蟲(chóng)蛋白的純度達(dá)到99％以上。
因此，本申請(qǐng)之七提供了根據(jù)本申請(qǐng)之一所述的殺蟲(chóng)蛋白，本申請(qǐng)之三所述的組合物，本申請(qǐng)之四所述的轉(zhuǎn)基因微生物，以及本申請(qǐng)之五所述的應(yīng)用中的轉(zhuǎn)基因植物中的至少一種在防治鱗翅目(lepidoptera)中的至少一種害蟲(chóng)中的應(yīng)用。
在一個(gè)具體的實(shí)施例中，優(yōu)選根據(jù)本申請(qǐng)之一所述的殺蟲(chóng)蛋白，本申請(qǐng)之三所述的組合物，本申請(qǐng)之四所述的轉(zhuǎn)基因微生物，以及本申請(qǐng)之五所述的應(yīng)用中的轉(zhuǎn)基因植物中的至少一種在防治夜蛾科(noctuidae)和螟蛾科(pyralidae)中的至少一種害蟲(chóng)中的應(yīng)用。
在一個(gè)具體的實(shí)施例中，特別優(yōu)選根據(jù)本申請(qǐng)之一所述的殺蟲(chóng)蛋白，本申請(qǐng)之三所述的組合物，本申請(qǐng)之四所述的轉(zhuǎn)基因微生物，以及本申請(qǐng)之五所述的應(yīng)用中的轉(zhuǎn)基因植物中的至少一種在防治鈴夜蛾屬(helicoverpa)和稈野螟屬(ostrinia)中的至少一種害蟲(chóng)中的應(yīng)用。
在一個(gè)具體的實(shí)施例中，最優(yōu)選根據(jù)本申請(qǐng)之一所述的殺蟲(chóng)蛋白，本申請(qǐng)之三所述的組合物，本申請(qǐng)之四所述的轉(zhuǎn)基因微生物，以及本申請(qǐng)之五所述的應(yīng)用中的轉(zhuǎn)基因植物中的至少一種在防治棉鈴蟲(chóng)(helicoverpaarmigerahubner)和/或玉米螟(ostrinianubilalis)中的應(yīng)用。
單克隆抗體的制備技術(shù)已經(jīng)較為成熟，因此，根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)的常規(guī)技術(shù)手段，可以制得本申請(qǐng)之一所述的殺蟲(chóng)蛋白的單克隆抗體。因此，本申請(qǐng)之八提供了根據(jù)本申請(qǐng)之一所述的殺蟲(chóng)蛋白的單克隆抗體。
在本申請(qǐng)中沒(méi)有特殊說(shuō)明的情況下，本申請(qǐng)中的術(shù)語(yǔ)均屬于現(xiàn)有技術(shù)中所指的通用術(shù)語(yǔ)。
具體實(shí)施方式
以下通過(guò)優(yōu)選的實(shí)施例的形式對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明，但不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限制。
1)液體lb：胰蛋白胨1％，酵母粉0.5％，nacl1％，ph7.0，15磅滅菌15min。用于培養(yǎng)大腸桿菌。
2)固體lb：在液體lb培養(yǎng)基中加1.3％瓊脂，15磅滅菌15min。用于培養(yǎng)大腸桿菌。
3)抗生素：氨芐青霉素水溶液100mg/ml，用時(shí)稀釋500倍-20℃保存。其中pet21b質(zhì)粒載體具有氨芐青霉素抗性。
蛋白電泳檢測(cè)
120v預(yù)電泳約10-20min，取蛋白樣品40μl，加入10μl5×加樣緩沖液，混勻，再將上清和沉淀分別梯度稀釋，煮沸5-10min，12000rpm離心5min，取10l上清點(diǎn)樣。80v恒壓電泳至樣品濃縮呈直線，150v恒壓電泳至指示的溴酚藍(lán)到達(dá)凝膠底部。
脫色：電泳后取出凝膠，電泳后取出凝膠并用蒸餾水沖洗，加入50ml溶液ⅰ，微波爐中加熱30s，60rpm振蕩10min。
染色：倒掉溶液i后加入溶液ii(每50ml溶液ii加200l溶液iii)微波爐加熱30s，60rpm振蕩15min以上。
倒掉溶液ii，加入無(wú)菌水，凝膠成像系統(tǒng)照相保存。
觀察結(jié)果，根據(jù)蛋白條帶著色程度比較目的蛋白表達(dá)情況，用凝膠成像系統(tǒng)照相保存。
表1為sds聚丙烯酰氨凝膠的制備表。
表1sds聚丙烯酰氨凝膠的制備表
實(shí)施例1
新基因的篩選及克隆
pcr-rflp鑒定：對(duì)實(shí)驗(yàn)室保存的2000株蘇云金芽胞桿菌(bacillusthuringiensis，bt)菌株進(jìn)行基因組提取、定量、均一化后，等量混合，建立bt基因組池，并以其為pcr模板，利用引物s5un2(seqidno.3)：ggaagaactactatttgtgatgc；s3un2(seqidno.4)：aatagtttgaattaccgcgagc，進(jìn)行pcr擴(kuò)增。擴(kuò)增循環(huán)：94℃變性1min；54℃退火1min；72℃延伸2min20s；30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min，pcr產(chǎn)物用0.7％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。然后對(duì)pcr產(chǎn)物進(jìn)行rflp酶切，結(jié)合對(duì)pcr產(chǎn)物的測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)了一種新的基因，暫將其定名為cry2a-like。
新基因的克隆與表達(dá)：以建立bt基因組池為模板，利用引物cry2f：5‘-ccggaattcgatgaataatgtattg-3’；cry2r：5‘-cccaagcttataaagtggtggaag-3’，采用pfu高保真聚合酶進(jìn)行pcr擴(kuò)增?；厥誴cr產(chǎn)物，用限制酶ecori和hindiii處理pet21b載體和回收的pcr產(chǎn)物，然后分別回收酶切產(chǎn)物，將目的片段連接到載體上，命名為petcry2a-like，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌jm110菌株，篩選出陽(yáng)性克隆。最后將petcry2a-like重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化之大腸桿菌表達(dá)菌株rosetta(de3)中。
經(jīng)測(cè)序分析，cry2a-like(seqidno.1)基因長(zhǎng)度1899bp，其編碼蛋白為cry2a-like，共633個(gè)氨基酸(seqidno.2)，表達(dá)71.1kda蛋白。
將上述基因在大腸桿菌rosetta(de3)中進(jìn)行iptg誘導(dǎo)表達(dá)，sds-page電泳結(jié)果發(fā)現(xiàn)，cry2a-like基因在可溶組分和不可溶組分中均表達(dá)；其中表達(dá)約70kda左右蛋白，與預(yù)期結(jié)果相符。陰性對(duì)照(即不含有cry2a-like基因的大腸桿菌rosetta(de3))在可溶和不可溶性組份中都沒(méi)有相應(yīng)蛋白的表達(dá)條帶。
實(shí)施例2
蛋白的表達(dá)與定量分析
將攜帶cry2a-like基因的大腸桿菌rosetta(de3)菌株以1％的接種量接種于lb液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至od600值達(dá)到0.5-1.0之間時(shí)，加入誘導(dǎo)物50mmiptg，在150rpm，20℃低溫下誘導(dǎo)12h。然后在4℃下，8000rpm離心3min。離心收集菌體，加入50mmtris·cl(ph8.0)懸??；破碎菌體(利用超聲波常規(guī)完全破碎)，將超聲破碎后的菌液在4℃下12,000rpm離心15min；然后收集上清液。按照如下方法對(duì)所述上清液進(jìn)行sds-page定量分析：制備以下5種不同濃度梯度的bsa：0.8μg/μl、0.4μg/μl、0.2μg/μl、0.1μg/μl、0.05μg/μl，并將目標(biāo)蛋白進(jìn)行梯度稀釋，使其終濃度介于0.8-0.05μg/μl，目標(biāo)蛋白和5種不同濃度的bsa(蛋白定量試劑盒：dcproteinassay)上樣量均為10μl，進(jìn)行蛋白電泳檢測(cè)。以牛血清蛋白(bsa)為標(biāo)準(zhǔn)蛋白制作蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)定大腸桿菌rosetta(de3)重組菌株中總蛋白的濃度。結(jié)合imagemastervds軟件分析sds-page中目的蛋白所占比例，計(jì)算目的蛋白，即cry2a-like的濃度。
對(duì)比例1
以cn201310150965.4中克隆到pet21b上的cry2ah-likesp(seqidno.7)基因在大腸桿菌rosetta(de3))中相同條件下的表達(dá)產(chǎn)物為生物活性測(cè)定分析的陽(yáng)性對(duì)照。cry2ah-likesp(seqidno.8)蛋白的表達(dá)與定量分析同實(shí)施例2。
實(shí)施例3
活性分析
敏感品系棉鈴蟲(chóng)(helicoverpaarmigera)、抗cry1ac1000倍的抗性品系棉鈴蟲(chóng)(helicoverpaarmigera)和敏感品系亞洲玉米螟(ostriniafurnacalis)分別由中國(guó)農(nóng)科院植物保護(hù)研究所棉花害蟲(chóng)組和玉米害蟲(chóng)組提供的標(biāo)準(zhǔn)化試蟲(chóng)。
棉鈴蟲(chóng)飼料由中國(guó)農(nóng)科院植物保護(hù)研究所棉花害蟲(chóng)組提供；亞洲玉米螟飼料由中國(guó)農(nóng)科院植物保護(hù)研究所玉米害蟲(chóng)組提供。
校正抑制率(％)＝1-處理組平均體重/陰性對(duì)照組平均體重
利用poloplus軟件算出蛋白對(duì)試蟲(chóng)的抑制中濃度(ic50)。
1.敏感品系棉鈴蟲(chóng)的室內(nèi)殺蟲(chóng)活性測(cè)定
根據(jù)實(shí)施例2中的殺蟲(chóng)蛋白的定量結(jié)果，首先將殺蟲(chóng)蛋白進(jìn)行系列稀釋；然后稱取8份10g人工飼料中分別置于滅菌培養(yǎng)皿中，并向每份的人工飼料中分別加入1ml上述稀釋液，充分混勻，依次得到含殺蟲(chóng)蛋白濃度為0.25μg/g、0.5μg/g、1μg/g、2μg/g、4μg/g、8μg/g、16μg/g、32μg/g的飼料，分裝于經(jīng)消毒(5％福爾馬林浸泡)的24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。用毛筆輕輕接入棉鈴蟲(chóng)1-2齡幼蟲(chóng)，每孔一頭，每處理重復(fù)三次，放置25℃光照培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)七天調(diào)查試蟲(chóng)的體重。
cry2ah-likesp蛋白對(duì)棉鈴蟲(chóng)的室內(nèi)殺蟲(chóng)活性測(cè)定操作步驟同上。
以清水為陰性對(duì)照。
蛋白對(duì)試蟲(chóng)的ic50具體結(jié)果見(jiàn)表2。
2.抗性品系棉鈴蟲(chóng)的室內(nèi)殺蟲(chóng)活性測(cè)定
根據(jù)實(shí)施例2中的殺蟲(chóng)蛋白的定量結(jié)果，首先將殺蟲(chóng)蛋白進(jìn)行系列稀釋；然后稱取8份10g人工飼料中分別置于滅菌培養(yǎng)皿中，并向每份的人工飼料中分別加入1ml上述稀釋液，充分混勻，依次得到含殺蟲(chóng)蛋白濃度為2μg/g、4μg/g、8μg/g、16μg/g、32μg/g、64μg/g的飼料，分裝于經(jīng)消毒(5％福爾馬林浸泡)的24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。用毛筆輕輕接入棉鈴蟲(chóng)1-2齡幼蟲(chóng)，每孔一頭，每處理重復(fù)三次，放置25℃光照培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)七天調(diào)查試蟲(chóng)的體重。
cry2ah-likesp蛋白對(duì)棉鈴蟲(chóng)的室內(nèi)殺蟲(chóng)活性測(cè)定操作步驟同上。
以清水為陰性對(duì)照。
蛋白對(duì)試蟲(chóng)的ic50具體結(jié)果見(jiàn)表2。
3.敏感品系亞洲玉米螟(o.furnacalis)的室內(nèi)殺蟲(chóng)活性測(cè)定
配置飼料，50g干飼料加入48g超純水得到濕飼料。
根據(jù)殺蟲(chóng)蛋白的定量結(jié)果，首先將殺蟲(chóng)蛋白進(jìn)行系列稀釋。
稱取6份2g濕飼料于每個(gè)無(wú)菌的培養(yǎng)皿中，并向每份的人工飼料中分別加入200μl上述稀釋液，充分混勻。依次得到含殺蟲(chóng)蛋白濃度為2μg/g、4μg/g、8μg/g、16μg/g、32μg/g、64μg/g的飼料。每個(gè)培養(yǎng)皿接20頭初孵幼蟲(chóng)，每個(gè)處理重復(fù)3次，26℃生化培養(yǎng)箱中保溫，培養(yǎng)7天后調(diào)查試蟲(chóng)的體重。
cry2ah-likesp蛋白對(duì)亞洲玉米螟的室內(nèi)殺蟲(chóng)活性測(cè)定操作步驟同上。
以清水為陰性對(duì)照。
蛋白對(duì)試蟲(chóng)的ic50具體結(jié)果見(jiàn)表2
表2
由表2的結(jié)果可知，本申請(qǐng)的cry2a-like殺蟲(chóng)蛋白對(duì)棉鈴蟲(chóng)和亞洲玉米螟的活性均顯著地優(yōu)于已知的人工突變殺蟲(chóng)蛋白cry2ah-likesp。將本申請(qǐng)的cry2a-like殺蟲(chóng)蛋白用于防治棉鈴蟲(chóng)和/或亞洲玉米螟可以顯著地降低生產(chǎn)成本，從而帶來(lái)更為可觀的經(jīng)濟(jì)效益。
雖然本發(fā)明已經(jīng)參照其優(yōu)選地具體實(shí)施方式進(jìn)行了描述，但是本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該理解在沒(méi)有脫離本發(fā)明的真正的精神和范圍的情況下，可以進(jìn)行的各種改變。例如，可以對(duì)本發(fā)明的主體、精神和范圍進(jìn)行多種改變以適應(yīng)特定的情形、材料、材料組合物或方法步驟。所有的這些改變均包括在本發(fā)明的權(quán)利要求的范圍內(nèi)。并且利用上述揭示的技術(shù)內(nèi)容做出些許的變動(dòng)或修飾均等同于等效實(shí)施案例，均屬于技術(shù)方案范圍內(nèi)。
lha1760078核苷酸和氨基酸序列表
<110>中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所
<120>一種新的殺蟲(chóng)蛋白及其核苷酸序列
<130>lha1760078
<160>8
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