本發(fā)明涉及一種利用環(huán)介導(dǎo)恒溫基因擴增（loop-mediated isothermal amplification of DNA，LAMP）技術(shù)進(jìn)行菌樣快速檢測的試劑盒，具體涉及一種抗生素溶桿菌環(huán)介導(dǎo)恒溫基因擴增快速檢測試劑盒及檢測方法。
背景技術(shù)：
農(nóng)作物病害是制約農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的一個重要因素，生產(chǎn)中主要通過選育抗病品種和化學(xué)農(nóng)藥防治。但由于化學(xué)農(nóng)藥的非生物源性容易使有害生物產(chǎn)生抗性，再加上濫用化學(xué)農(nóng)藥，導(dǎo)致了化學(xué)農(nóng)藥在自然界和食物鏈中長期殘留造成了環(huán)境污染、生態(tài)平衡破壞、社會公害等嚴(yán)重后果。而微生物農(nóng)藥具有對非靶標(biāo)生物安全、毒副作用小、對環(huán)境兼容性好等特點， 在控制植物病害方面倍受青睞?？股厥俏⑸锏奶烊淮x產(chǎn)物。溶桿菌屬細(xì)菌是一類重要的微生物資源，已成為各國開發(fā)新型抗生素的重要來源。在國外該屬細(xì)菌產(chǎn)生的抗生素在醫(yī)學(xué)和農(nóng)業(yè)病害控制方面都有一定的研究。
溶桿菌（Lysobacte）革蘭氏染色陰性，桿狀，兩端鈍圓，單生，無鞭毛，滑行運動，好氣性，代謝為呼吸型，無芽孢，氧化酶陽性，過氧化氫酶陽性，G+C含量為65.4%-70.1%。在自然界，從海洋到河流、土壤中廣泛分布，為腐生性，通過降解有機物和其他微生物獲取營養(yǎng)來生存。溶桿菌屬共有4個種，分別為產(chǎn)酶溶桿菌、抗生素溶桿菌、變棕溶桿菌和膠狀溶桿菌。溶桿菌對多種病原真菌、細(xì)菌和線蟲具有溶菌活性等典型特征。抗生素溶桿菌（Lysobater antibioticus）對多種植物病原菌具有明顯抑制作用，同時在田間對多種細(xì)菌病害表現(xiàn)出良好的防病效果。通過進(jìn)一步研究，有望開發(fā)為一種能防治植物病害的新型微生物農(nóng)藥。
目前針對抗生素溶桿菌有多種檢測方法。傳統(tǒng)的增菌培養(yǎng)方法一般需要10天以上，周期較長，并且需要使用實驗動物，成本較高；免疫學(xué)檢測（Immunoassay，IA）是一種根據(jù)抗原、抗體反應(yīng)的原理，利用已知的抗原檢測未知抗體或利用已知的抗體檢測未知抗原的技術(shù)，主要包括酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）、放射免疫（RIA）、反向間接血凝法（RPHA）和反向乳膠凝集實驗（RPLA）等，此類方法周期短，一次可檢測大量樣本，并且不需實驗動物，但其缺點是必須有高親和性的抗體；實時熒光定量PCR方法能夠用于病原菌的檢測，但對儀器設(shè)備和人員的專業(yè)技術(shù)水平要求較高，并且操作復(fù)雜，耗時較長，限制了該技術(shù)的推廣。
DNA環(huán)介導(dǎo)恒溫核酸擴增技術(shù)（LAMP）是一種新型的恒溫核酸擴增方法，此技術(shù)克服了以往基因擴增方法的不足，能夠在恒溫條件下進(jìn)行核酸的擴增，具有簡單、快速、成本低和特異性強等優(yōu)點，適于現(xiàn)場檢測，有較好的應(yīng)用性。目前，還沒有專門針對抗生素溶桿菌的環(huán)介導(dǎo)恒溫基因擴增快速檢測試劑盒及檢測方法的相關(guān)記載。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供了一種快速靈敏準(zhǔn)確的抗生素溶桿菌環(huán)介導(dǎo)恒溫基因擴增快速檢測試劑盒及檢測方法。
本發(fā)明為實現(xiàn)上述目的采用如下技術(shù)方案：抗生素溶桿菌環(huán)介導(dǎo)恒溫基因擴增快速檢測試劑盒，其特征在于包括：
（1）反應(yīng)液1：由10mmol/L脫氧核苷三磷酸、10×ThermoPol Buffer反應(yīng)緩沖液、150mmol/L硫酸鎂、5mol/L甜菜堿和滅菌雙蒸水組成；
（2）反應(yīng)液2：由10μmol/L外引物1、10μmol/L外引物2、40μmol/L內(nèi)引物1和40μmol/L內(nèi)引物2組成，引物序列如下：
外引物1：GCGAGCATGCAGCAGC，
外引物2：GGCAAGGTCGCGAGGAT，
內(nèi)引物1：CACCGGCAAGGTCGACGAGG-CGATTCCGGCCTGGGA，
內(nèi)引物2：CGCGCCATGTCTTCGTGGG-GCGCAGGTCGGGTTTCA；
（3）8U/μL Bst DNA聚合酶；
（4）顯色劑：質(zhì)量濃度為10%的SYBR Green I熒光染料；
上述環(huán)介導(dǎo)恒溫基因擴增快速檢測試劑盒中反應(yīng)液1折合每樣品19μL，其組成為：10mmol/L脫氧核苷三磷酸4μL、10×ThermoPol Buffer反應(yīng)緩沖液2.5μL、150mmol/L硫酸鎂1μL、5mol/L甜菜堿5μL和滅菌雙蒸水6.5μL；反應(yīng)液2折合每樣品3μL，其組成為：10μmol/L外引物1 0.5μL、10μmol/L外引物2 0.5μL、40μmol/L內(nèi)引物1 1μL和40μmol/L內(nèi)引物2 1μL。
本發(fā)明所述的抗生素溶桿菌環(huán)介導(dǎo)恒溫基因擴增快速檢測試劑盒的檢測方法，其特征在于具體步驟為：
步驟（1），提取待檢樣品基因組DNA，采用試劑盒提取法制備待檢樣品基因組DNA；
步驟（2），環(huán)介導(dǎo)恒溫擴增反應(yīng)，取2μL待檢樣品基因組DNA溶液，加入19μL反應(yīng)液1、3μL反應(yīng)液2和1μL 8U/μL Bst DNA聚合酶，將配制好的反應(yīng)體系在65℃擴增反應(yīng)50-70min后取出待檢；
步驟（3），分析判斷反應(yīng)結(jié)果，在反應(yīng)產(chǎn)物中加入1μL顯色劑，混勻，靜置2min，若反應(yīng)液顯現(xiàn)綠色即為陽性，橙色則為陰性。
本發(fā)明根據(jù)抗生素溶桿菌的吩嗪合成基因phz F設(shè)計了四條特異性引物，該基因序列為抗生素溶桿菌所共有，以保證檢測不同來源的抗生素溶桿菌的可靠性。本發(fā)明采用LAMP技術(shù)，針對抗生素溶桿菌建立了快速靈敏準(zhǔn)確的檢測方法，并構(gòu)建用于該方法的快速檢測試劑盒。使用本發(fā)明的快速檢測試劑盒和檢測方法，在反應(yīng)后可通過肉眼觀察鑒定，無需電泳等其它任何分析設(shè)備，具有檢測時間短、特異性強、儀器設(shè)備要求低和操作簡便等優(yōu)點，可用于抗生素溶桿菌的快速檢測。
附圖說明
圖1是不同菌株的陽性擴增結(jié)果對比圖，其中1號反應(yīng)管內(nèi)樣品為綠色，2-7號反應(yīng)管內(nèi)樣品為橙色。
具體實施方式
下面結(jié)合具體實施例，對本發(fā)明中試劑盒及檢測方法的建立和應(yīng)用作進(jìn)一步說明，但并不以任何形式限制本發(fā)明的內(nèi)容。
實施例1
抗生素溶桿菌環(huán)介導(dǎo)恒溫基因擴增快速檢測試劑盒及檢測方法的建立
步驟（1），引物的設(shè)計、合成試劑盒的組裝
本實施例確定用于檢測的引物序列如下：
外引物1：GCGAGCATGCAGCAGC，
外引物2：GGCAAGGTCGCGAGGAT，
內(nèi)引物1：CACCGGCAAGGTCGACGAGG-CGATTCCGGCCTGGGA，
內(nèi)引物2：CGCGCCATGTCTTCGTGGG-GCGCAGGTCGGGTTTCA；
在此基礎(chǔ)上設(shè)計用于抗生素溶桿菌環(huán)介導(dǎo)恒溫基因擴增快速檢測試劑盒，該試劑盒包括以下試劑：
（1）反應(yīng)液1：由10mmol/L脫氧核苷三磷酸（dNTP）、10×ThermoPol Buffer反應(yīng)緩沖液、150mmol/L硫酸鎂（MgSO4）、5 mol/L甜菜堿和滅菌雙蒸水（ddH2O）組成；
（2）反應(yīng)液2：由10μmol/L外引物1（F3）、10μmol/L外引物2（B3）、40μmol/L內(nèi)引物1（FIP）和40μmol/L內(nèi)引物2（BIP）組成；
（3）8U/μL Bst DNA聚合酶；
（4）顯色劑：質(zhì)量濃度為10%的SYBR Green I熒光染料；
上述環(huán)介導(dǎo)恒溫基因擴增快速檢測試劑盒中反應(yīng)液1折合每樣品19μL，其組成為：10mmol/L脫氧核苷三磷酸（dNTP）4μL、10×ThermoPol Buffer反應(yīng)緩沖液2.5μL、150mmol/L硫酸鎂（MgSO4）1μL、5mol/L甜菜堿5μL和滅菌雙蒸水（ddH2O）6.5μL；反應(yīng)液2折合每樣品3μL，其組成為：10μmol/L外引物1（F3）0.5μL、10μmol/L外引物2（B3）0.5μL、40μmol/L內(nèi)引物1（FIP）1μL和40μmol/L內(nèi)引物2（BIP）1μL。
步驟（2），待檢樣品的制備
采用試劑盒提取法制備待檢樣品基因組DNA
檢測菌種抗生素溶桿菌（Lysobater antibioticus）來源于北納生物，編號BNCC222260。使用北京天根生物工程公司生產(chǎn)的細(xì)菌基因組提取試劑盒提取樣品基因組DNA。
步驟（3），進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)恒溫擴增反應(yīng)
（1）取2μL待檢樣品基因組DNA溶液，加入19μL反應(yīng)液1、3μL反應(yīng)液2和1μL 8U/μL Bst DNA聚合酶；
（2）將配制好的反應(yīng)體系在65℃擴增反應(yīng)50min后取出待檢。
步驟（4），分析判斷反應(yīng)結(jié)果
在反應(yīng)產(chǎn)物中加入1μL顯色劑，混勻，靜置2min，肉眼觀察顏色變化，反應(yīng)液顏色變?yōu)榫G色，說明待檢菌株為抗生素溶桿菌。
實施例2
陰性對照
步驟（1），引物的設(shè)計、合成試劑盒的組裝
本實施例確定用于檢測的引物序列同實施例1。
在此基礎(chǔ)上設(shè)計用于抗生素溶桿菌環(huán)介導(dǎo)恒溫基因擴增快速檢測試劑盒，該試劑盒包括以下試劑：
（1）反應(yīng)液1：由10mmol/L脫氧核苷三磷酸（dNTP）、10×ThermoPol Buffer反應(yīng)緩沖液、150mmol/L硫酸鎂（MgSO4）、5mol/L甜菜堿和滅菌雙蒸水（ddH2O）組成；
（2）反應(yīng)液2：由10μmol/L外引物1（F3）、10μmol/L外引物2（B3）、40μmol/L內(nèi)引物1（FIP）和40μmol/L內(nèi)引物2（BIP）組成；
（3）8U/μL Bst DNA聚合酶；
（4）顯色劑：質(zhì)量濃度為10%的SYBR Green I熒光染料；
上述環(huán)介導(dǎo)恒溫基因擴增快速檢測試劑盒中反應(yīng)液1折合每樣品19μL，其組成為：10mmol/L脫氧核苷三磷酸（dNTP）4μL、10×ThermoPol Buffer反應(yīng)緩沖液2.5μL、150mmol/L硫酸鎂（MgSO4）1μL、5mol/L甜菜堿5μL和滅菌雙蒸水（ddH2O）6.5μL；反應(yīng)液2折合每樣品3μL，其組成為：10μmol/L外引物1（F3）0.5μL、10μmol/L外引物2（B3）0.5μL、40μmol/L內(nèi)引物1（FIP）1μL和40μmol/L內(nèi)引物2（BIP）1μL。
步驟（2），待檢樣品的制備
采用試劑盒提取法制備待檢樣品基因組DNA
使用北京天根生物工程公司生產(chǎn)的細(xì)菌基因組提取試劑盒提取產(chǎn)酶溶桿菌、變棕溶桿菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、肺炎克雷伯菌等6種細(xì)菌的基因組DNA。
步驟（3），進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)恒溫擴增反應(yīng)
（1）取2μL待檢樣品基因組DNA溶液，加入19μL反應(yīng)液1、3μL反應(yīng)液2、1μL 8U/μL Bst DNA聚合酶；
（2）將配制好的反應(yīng)體系在65℃擴增反應(yīng)50min后取出待檢。
步驟（4），分析判斷反應(yīng)結(jié)果
在反應(yīng)產(chǎn)物中加入1μL顯色劑，混勻，靜置2min，肉眼觀察顏色變化，若反應(yīng)液顯現(xiàn)綠色即為陽性，橙色則為陰性。
如圖1所示，編號為1-7的反應(yīng)管分別對應(yīng)抗生素溶桿菌、產(chǎn)酶溶桿菌、變棕溶桿菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、肺炎克雷伯菌。
實施例1與實施例2中各陰性對照組比較，實施例1中產(chǎn)生陽性擴增結(jié)果，如圖1中1號反應(yīng)管，而不攜帶phz F基因的實施例2陰性對照菌株沒有產(chǎn)生陽性擴增結(jié)果，如圖1中2-7號反應(yīng)管，從而證明本試劑盒及檢測方法具有較強的特異性，對不攜帶phz F基因的其它菌株不會產(chǎn)生假陽性結(jié)果。
以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理，主要特征和優(yōu)點，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下，本發(fā)明還有各種變化和改進(jìn)，這些變化和改進(jìn)都落入要求保護的本發(fā)明的范圍。
SEQUENCE LISTING
<110> 河南師范大學(xué)
<120> 抗生素溶桿菌環(huán)介導(dǎo)恒溫基因擴增快速檢測試劑盒及檢測方法
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gcgagcatgc agcagc 16
<210> 2
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ggcaaggtcg cgaggat 17
<210> 3
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
caccggcaag gtcgacgagg cgattccggc ctggga 36
<210> 4
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
cgcgccatgt cttcgtgggg cgcaggtcgg gtttca 36