本發(fā)明屬于生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種TTLL12基因新轉(zhuǎn)錄本的鑒定引物及其方法。

背景技術(shù)：

微管蛋白酪氨酸連接酶樣(Tubulin Tyrosine Ligase Like protein,TTLL)蛋白家族有14個(gè)成員，均含有TTL結(jié)構(gòu)域，具有微管蛋白的翻譯后修飾功能，如酪氨酸化修飾、甘氨酸化修飾(TTLL3、TTLL8、TTLL10)、谷氨酰胺化修飾(TTLL1、TTLL2、TTLL4、TTLL5、TTLL6、TTLL7、TTLL9、TTLL11、TTLL13)，進(jìn)而影響微管的穩(wěn)定性。在多種癌細(xì)胞中，TTLL蛋白對(duì)微管蛋白的修飾功能會(huì)被抑制，如在肺癌及乳腺癌細(xì)胞中，只能發(fā)現(xiàn)豐度很低的谷氨酰胺化微管蛋白。

TTLL12是一個(gè)十分特別的TTLL蛋白家族成員，它的TTL結(jié)構(gòu)域與其他成員有明顯的差異：特異性TTL結(jié)構(gòu)域的N端序列缺少結(jié)合ATP和鎂離子的12個(gè)核苷酸序列，還缺少7個(gè)保守的結(jié)構(gòu)域中的3個(gè)，國(guó)內(nèi)外的最新的研究都表明它的TTL結(jié)構(gòu)域不具備微管蛋白修飾酶的催化功能，其影響微管蛋白修飾的機(jī)制還不明確。

一個(gè)基因在不同的發(fā)育階段、分化細(xì)胞和生理狀態(tài)下，可以通過不同的剪切方式得到不同的mRNA和翻譯產(chǎn)物。每個(gè)轉(zhuǎn)錄本可能發(fā)揮著獨(dú)特的功能。因此，研究和開發(fā)基因的新轉(zhuǎn)錄本的方法對(duì)該基因功能的分析具有重要的作用。

CLOCK基因存在2個(gè)不同的轉(zhuǎn)錄本，有研究發(fā)現(xiàn)，CLOCK基因與不孕不育、肥胖及脂肪代謝異常、糖尿病、腫瘤、高血壓疾病、急性心肌梗塞(AMI)等病理過程高度相關(guān)而且其對(duì)沙門氏菌感染抗性中發(fā)揮著重要作用。專利文獻(xiàn)CN103436607B公開了雞CLOCK基因不同轉(zhuǎn)錄本的擴(kuò)增方法及其引物，該擴(kuò)增方法是對(duì)每個(gè)轉(zhuǎn)錄本序列，設(shè)計(jì)了轉(zhuǎn)錄本特異引物，通過反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)可以擴(kuò)增出特定的轉(zhuǎn)錄本，對(duì)不同轉(zhuǎn)錄本功能的分析研究奠定基礎(chǔ)，更有利于CLOCK基因功能的研究，提高CLOCK基因引起的疾病的診斷準(zhǔn)確性。

例如，為了更一步了解AML1基因的功能，許艾寧等發(fā)表了題目為“AML1基因的一種新轉(zhuǎn)錄的鑒定與克隆”。劉世饒等發(fā)表了一篇題目為“一種新的人CNA1基因轉(zhuǎn)錄本的克隆和功能鑒定”的論文，進(jìn)一步的分析CNA1基因的功能。

然而，目前，尚未見有對(duì)TTLL12基因的新轉(zhuǎn)錄本的報(bào)道，不利于TTLL12基因功能的研究和發(fā)現(xiàn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺陷，本發(fā)明提供一種TTLL12基因新轉(zhuǎn)錄本的鑒定引物，該引物具有特異性好、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，用于準(zhǔn)確的確定TTLL12基因一種新轉(zhuǎn)錄本的基因序列，對(duì)TTLL12基因的功能分析和研究具有重要的作用。

本發(fā)明提供一種TTLL12基因新轉(zhuǎn)錄本的鑒定引物，包括針對(duì)TTLL12基因特異性的PCR引物：所述TTLL12基因特異性的PCR引物為：5'-GATTACGCCAAGCTTAGAGCACACAGACGGCGCGGGTG-3'(SEQ ID NO.1)。

另外，本發(fā)明還提供了一種TTLL12基因新轉(zhuǎn)錄本的鑒定方法，包括以下步驟：

S1收集培養(yǎng)中的H1299細(xì)胞株，提取RNA；

S2用特異性的3'-RACE CDS引物反轉(zhuǎn)錄mRNA，形成cDNA鏈；所述反轉(zhuǎn)錄的條件為：

階段1：42℃，90s；階段2：70℃，10min；階段3：4℃，保溫；

S3以步驟S2中的cDNA鏈作為模板，用TTLL12基因特異性的PCR引物和UPM通用性引物擴(kuò)增獲得3'-RACE產(chǎn)物，所述PCR擴(kuò)增條件包括：階段1：94℃，30s；72℃，3min，5個(gè)循環(huán)；階段2：94℃，30s；70℃，30s；72℃，3min，5個(gè)循環(huán)；階段3：94℃，30s；72℃，3min，5個(gè)循環(huán)；階段4：94℃，30s；70℃，30s；72℃，3min，5個(gè)循環(huán)；階段5：94℃，30s；68℃，30s；72℃，3min，5個(gè)循環(huán)；階段6：4℃，保溫；

S4將步驟S3的3'-RACE產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳，回收3'-RACE產(chǎn)物，連接到載體上，進(jìn)行一代測(cè)序。

進(jìn)一步地，所述步驟S2中的特異性的3'-RACE CDS引物為：5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC-3’(SEQ ID NO.2)。

進(jìn)一步地，所述步驟S3中的UPM引物的長(zhǎng)引物為：5'-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3'(SEQ ID NO.3)，所述步驟S3中的UPM引物的短引物為：5'-CTAATACGACTCACTATAGGGC-3'(SEQ ID NO.4)。

此外，本發(fā)明還提供了所述的TTLL12基因新轉(zhuǎn)錄本的鑒定引物在制備檢測(cè)TTLL12基因新轉(zhuǎn)錄本試劑盒中的用途。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明提供了一種TTLL12基因新轉(zhuǎn)錄本的鑒定引物，該引物的特異性好，準(zhǔn)確性好，提高了檢測(cè)效率。此外，本發(fā)明還提供了TTLL12基因新轉(zhuǎn)錄本的鑒定方法，通過使用特異性的引物，具有特異性好、靈敏度高、準(zhǔn)確性好等優(yōu)點(diǎn)，用于準(zhǔn)確的確定TTLL12基因一種新轉(zhuǎn)錄本的基因序列，便于TTLL12基因的研究。

附圖說明

圖1本發(fā)明提供的新的TTLL12基因轉(zhuǎn)錄本的編碼區(qū)中，與舊的TTLL12基因轉(zhuǎn)錄本比較，多出來的108bp序列的測(cè)序峰圖

具體實(shí)施方式

以上內(nèi)容是結(jié)合具體的優(yōu)選實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明所作的進(jìn)一步詳細(xì)說明，不能認(rèn)定本發(fā)明的具體實(shí)施只局限于這些說明。對(duì)于本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干簡(jiǎn)單推演或替換，都應(yīng)當(dāng)視為屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

實(shí)施例1、引物

發(fā)明人針對(duì)TTLL12基因特異性的PCR引物設(shè)計(jì)了大量引物，通過引物反應(yīng)條件的優(yōu)化和比較，篩選出了特異性好的引物。并同時(shí)提供3'-RACE CDS特異性引物、GSP引物和UPM引物的長(zhǎng)引物和短引物。

表1本發(fā)明提供的引物

實(shí)施例2、TTLL12基因新轉(zhuǎn)錄本的鑒定方法

S1收集培養(yǎng)中的H1299細(xì)胞株，提取RNA；所述肺癌細(xì)胞株H1299，購(gòu)買自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)；

S2用實(shí)施例1表1中的特異性的3'-RACE CDS引物反轉(zhuǎn)錄mRNA，形成cDNA鏈；所述反轉(zhuǎn)錄的條件為：

階段1：42℃，90s；階段2：70℃，10min；階段3：4℃，保溫；

S3以步驟S2中的cDNA鏈作為模板，用實(shí)施例1表1中的TTLL12基因特異性的PCR引物和UPM通用性引物擴(kuò)增獲得3'-RACE產(chǎn)物，所述PCR擴(kuò)增條件包括：階段1：94℃，30s；72℃，3min，5個(gè)循環(huán)；階段2：94℃，30s；70℃，30s；72℃，3min，5個(gè)循環(huán)；階段3：94℃，30s；72℃，3min，5個(gè)循環(huán)；階段4：94℃，30s；70℃，30s；72℃，3min，5個(gè)循環(huán)；階段5：94℃，30s；68℃，30s；72℃，3min，5個(gè)循環(huán)；階段6：4℃，保溫；

S4將步驟S3的3'-RACE產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳，回收3'-RACE產(chǎn)物，連接到載體上，進(jìn)行一代測(cè)序，新的TTLL12基因轉(zhuǎn)錄本的編碼區(qū)中，與舊的TTLL12基因轉(zhuǎn)錄本比較，多出來的108bp序列的測(cè)序峰圖如圖1所示。新轉(zhuǎn)錄本的編碼區(qū)堿基序列如下(5’到3’，下劃線加粗部分為多出的108bp)，以下為TTLL12基因新轉(zhuǎn)錄本多出的108bp的堿基序列：

ATGGAGGCCGAGCGGGGTCCCGAGCGCCGGCCTGCGGAGCGTAGCAGCCCGGGCCAGACGCCGGAGGAGGGCGCGCAGGCCTTGGCCGAGTTCGCGGCGCTGCACGGCCCGGCGCTGCGCGCTTCGGGGGTCCCCGAACGTTACTGGGGCCGCCTCCTGCACAAGCTGGAGCACGAGGTTTTCGACGCTGGGGAAGTGTTTGGGATCATGCAAGTGGAGGAGGTAGAAGAGGAGGAGGACGAGGCAGCCCGGGAGGTGCGGAAGCAGCAGCCCAACCCGGGGAACGAGCTGTGCTACAAGGTCATCGTGACCAGGGAGAGCGGGCTCCAGGCAGCCCACCCCAACAGCATCTTCCTCATCGACCACGCCTGGACGTGCCGTGTGGAGCACGCGCGCCAGCAGCTGCAGCAGGTGCCCGGGCTGCTGCACCGCATGGCCAACCTGATGGGCATTGAGTTCCACGGTGAGCTGCCCAGTACAGAGGCTGTGGCCCTGGTGCTGGAGGAGATGTGGAAGTTCAACCAGACCTACCAGCTGGCCCATGGGACAGCTGAGGAGAAGATGCCGGTGTGGTATATCATGGACGAGTTCGGTTCGCGGATCCAGCACGCGGACGTGCCCAGCTTCGCCACGGCACCCTTCTTCTACATGCCGCAGCAGGTGGCCTACACGCTGCTGTGGCCCCTGAGGGACCTGGACACTGGCGAGGAGGTGACCCGAGACTTTGCCTACGGAGAGACGGACCCCCTGATCCGGAAGTGCATGCTGCTGCCCTGGGCCCCCACCGACATGCTGGACCTCAGCTCTTGCACACCCGAGCCGCCCGCCGAGCACTACCAGGCCATTCTGGAGGAAAACAAGGAGAAGCTGCCACTTGACATCAACCCCGTGGTGCACCCCCACGGCCACATCTTCAAGGTCTACACGGACGTGCAGCAGGTGGCCAGCAGCCTCACCCACCCGCGCTTCACCCTCACCCAGAGTGAGGCGGACGCCGACATCCTCTTCAACTTCTCACACTTCAAGGACTACAGGAAACTCAGCCAGGAGAGGCCAGGCGTGCTGCTGAACCAGTTCCCCTGCGAGAACCTGCTGACTGTCAAGGACTGCCTGGCCTCCATCGCGCGCCGGGCAGGTGGCCCCGAGGGCCCACCCTGGCTGCCCCGAACCTTCAACCTGCGCACTGAGCTGCCCCAGTTTGTCAGCTACTTCCAGCAGCGGGAAAGGTGGGGCGAGGACAACCACTGGATCTGCAAGCCCTGGAACCTGGCGCGCAGCCTGGACACCCACGTCACCAAGAGCCTGCACAGCATCATCCGGCACCGAGAGAGCACCCCCAAGGTTGTGTCCAAGTACATCGAAAGTCCCGTGTTGTTCCTTCGAGAAGACGTGGGAAAGGTCAAGTTCGACATCCGCTACATCGTGCTGCTGCGGTCAGTGAGGCCCCTACGGTTGTTCGTGTATGATGTGTTCTGGCTGCGGTTCTCCAACCGGGCCTTTGCACTCAACGACCTGGATGACTACGAGAAGCACTTCACGGTCATGAACTATGACCCGGATGTGGTGCTGAAGCAGGTGCACTGTGAAGAGTTCATCCCCGAGTTTGAGAAGCAATACCCAGAATTTCCCTGGACGGACGTCCAGGCTGAGATCTTCCGGGCCTTCACGGAGCTGTTCCAGGTGGCCTGTGCCAAGCCACCACCCCTGGGCCTCTGCGACTACCCCTCATCCCGGGCCATGTATGCCGTCGACCTCATGCTGAAGTGGGACAACGGCCCAGATGGAAGGCGGGTGATGCAGCCGCAGATCCTGGAGGTGAACTTCAACCCCGACTGTGAGCGAGCCTGCAGGTACCACCCCACCTTCTTCAACGACGTCTTCAGCACCTTGTTTCTGGACCAGCCCGGTGGCTGCCACGTTACCTGCCTTGTCTAG

因此，本發(fā)明所提供的引物和檢測(cè)方法可作為一種獨(dú)立的、應(yīng)用廣泛的檢測(cè)方法，解決了TTLL12基因新轉(zhuǎn)錄本的基因序列的檢測(cè)問題，用于準(zhǔn)確的確定TTLL12基因一種新轉(zhuǎn)錄本的基因序列，便于TTLL12基因的研究。

SEQUENCE LISTING

<110> 廣州金域醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心有限公司

<120> 一種TTLL12基因新轉(zhuǎn)錄本的鑒定引物及其方法

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