本發(fā)明涉及細(xì)胞工程領(lǐng)域，具體來說是一種高效的人頰脂體脂肪干細(xì)胞的制備方法。
背景技術(shù)：
脂肪干細(xì)胞（adiposed-derivedstemcells,ascs）來源于脂肪組織，是一種處于靜止?fàn)顟B(tài)的，未分化的干細(xì)胞，它具有保持長期自我更新的能力，且在一定條件下，能誘導(dǎo)分化成為特定的組織。由于脂肪組織易獲得，供應(yīng)充足，可反復(fù)取材，無道德爭(zhēng)論，因此，ascs是組織工程優(yōu)秀的種子細(xì)胞，有望在乳房再造、面部凹陷畸形、各種組織缺損修復(fù)、帕金森病治療中發(fā)揮作用。
頰脂體是一團(tuán)特殊的脂肪組織，它與皮下脂肪組織有著明顯的區(qū)別,頰脂墊內(nèi)的脂肪小葉間隔為薄弱而疏松的結(jié)締組織，脂肪細(xì)胞小，富于順應(yīng)性和半流動(dòng)性，非常柔軟，易與周圍組織分離，易于伸展和塑形,抗感染能力強(qiáng)，不易吸收和壞死,頰脂體以上解剖特點(diǎn)為其臨床應(yīng)用提供了有利條件。
脂肪組織是一種非常有前景的間充質(zhì)干細(xì)胞來源，其不需要給病人全身麻醉隔離，而給病人最小的不適感,人脂肪干細(xì)胞已經(jīng)被證明是一種多能干細(xì)胞,尤其是頰脂體很容易在口腔頜面外科領(lǐng)域獲得，并提供了一個(gè)可靠的口腔外科的組織材料,頰脂體包含有大量的脂肪干細(xì)胞，其表型與腹部皮下脂肪組織干細(xì)胞,在適當(dāng)?shù)臈l件下，頰脂體脂肪干細(xì)胞能體外分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等。
目前在人體脂肪干細(xì)胞研究方面，關(guān)于頰脂體脂肪干細(xì)胞研究鮮見報(bào)端,另外脂肪干細(xì)胞的培養(yǎng)方法多采用單一酶消化法，細(xì)胞得率低，消化時(shí)間長，損傷細(xì)胞、影響細(xì)胞活性，且摻雜有內(nèi)皮細(xì)胞等,在細(xì)胞移植方面受到限制。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有技術(shù)中的細(xì)胞得率低、消化時(shí)間長、細(xì)胞活性差的缺陷，提供一種高效的人頰脂體脂肪干細(xì)胞的制備方法來解決上述問題。
本發(fā)明公開了一種高效的人頰脂體脂肪干細(xì)胞的制備方法，具體步驟為：
（1）、通過外科手術(shù)獲得的頰脂體組織，用d-hank’s溶液沖洗3次，洗去組織表面的結(jié)締組織、血管內(nèi)皮；
（2）、用外科手術(shù)剪把人頰脂體組織剪碎成1mm3的小塊；
（3）、用含有0.01%（m/v）ⅰ型膠原酶和0.05%（m/v）中性蛋白酶的高糖dmem培養(yǎng)基10ml，在37℃的條件下，消化60min；
（4）、吹打上述細(xì)胞懸液4-5次，在室溫條件下，以860×g的轉(zhuǎn)速，離心10min；
（5）、吸棄上層懸浮脂肪顆粒和成熟脂肪細(xì)胞，獲取底部細(xì)胞團(tuán)，采用pbs溶液重懸細(xì)胞，并用100μm孔徑濾膜過濾；
（6）、對(duì)細(xì)胞濾液計(jì)數(shù)，用過量的1×bdimag?buffer輕洗細(xì)胞，1500rpm離心5min，棄上清；
（7）、把cd31磁珠徹底渦旋均勻，然后每1×107個(gè)細(xì)胞加50μlcd31磁珠，混合均勻后，在30℃的條件下孵育30min；
（8）、用bdimag?buffer把體系調(diào)整到1-8×107個(gè)/ml細(xì)胞之后，迅速把標(biāo)記好的體系放到磁力架上孵育8-10分鐘；
（9）、吸出磁力架上的流式管里面的液體上清，上清細(xì)胞為cd31-細(xì)胞，此時(shí)即為去除了內(nèi)皮細(xì)胞后，純化的脂肪干細(xì)胞；
（10）、在1500rpm條件下，將上清液離心5min，棄上清；
（11）、將上述細(xì)胞置于37℃，5%co2培養(yǎng)箱中，用10mldmem培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，每周換液2次；
（12）、細(xì)胞融合度達(dá)到80%以上后，吸干培養(yǎng)液，用pbs液輕洗細(xì)胞兩次；
（13）、向培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)加入胰蛋白酶-edta溶液，直至覆蓋所有細(xì)胞為止，然后置于37℃，5%的co2溫箱2-3min后，倒置顯微鏡下觀察到細(xì)胞回縮，細(xì)胞間隙增大，再向培養(yǎng)瓶里加入10ml高糖dmem培養(yǎng)基終止消化；
（14）、用吸管反復(fù)吹打瓶底，使細(xì)胞脫落，再將細(xì)胞懸液在1200rpm條件下，離心7min，采用高糖dmem培養(yǎng)基洗3次；
（15）、將細(xì)胞按1:3比例分瓶傳代，并用含有10%（v/v）fbs，40u/ml硫酸慶大霉素的dmem培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)；
（16）、細(xì)胞傳至3代即可用于分化成神經(jīng)細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等組織，或細(xì)胞移植，或傳代至4代、5代進(jìn)行冷凍保存。
作為優(yōu)選，所述的步驟（7）中，在對(duì)cd31磁珠渦旋均勻之前，先用pbs液對(duì)cd31磁珠稀釋10倍，然后置于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>
作為優(yōu)選，所述的步驟（11）中，所述的dmem培養(yǎng)基中含有10%（v/v）fbs和40u/ml硫酸慶大霉素。
作為優(yōu)選，所述的步驟（13）中，所述的胰蛋白酶-edta溶液中的胰蛋白酶的質(zhì)量濃度為0.25%，胰蛋白酶-edta溶液中的edta的質(zhì)量濃度為0.01%。
作為優(yōu)選，所述的步驟（13）中，胰蛋白酶-edta溶液購自北京雷根生物技術(shù)有限公司。
本發(fā)明相比現(xiàn)有技術(shù)具有以下優(yōu)點(diǎn)：
1、本發(fā)明選用頰脂體作為脂肪干細(xì)胞的來源組織，這一組織中含有大量的脂肪干細(xì)胞，易于獲取，且對(duì)供體無影響；
2、本發(fā)明使用0.01%ⅰ型膠原酶和0.05%中性蛋白酶同時(shí)消化細(xì)胞，縮短了消化時(shí)間，對(duì)細(xì)胞損傷小，且得率高，活力旺盛；
3、本發(fā)明使用了cd31免疫磁珠負(fù)選法篩選脂肪干細(xì)胞，由于cd31是內(nèi)皮細(xì)胞的表面標(biāo)志物，通過免疫磁珠系統(tǒng)可以篩除表達(dá)cd31的內(nèi)皮細(xì)胞，使得脂肪干細(xì)胞進(jìn)一步純化，純化的脂肪干細(xì)胞可以應(yīng)用于細(xì)胞移植；
4、本發(fā)明使用了bdimagtm磁分選系統(tǒng)，其成本低廉，操作簡(jiǎn)便。
具體實(shí)施方式
下面對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說明，本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。
本發(fā)明公開了一種高效的人頰脂體脂肪干細(xì)胞的制備方法，具體步驟為：
（1）、通過外科手術(shù)獲得的頰脂體組織，用d-hank’s溶液沖洗3次，洗去組織表面的結(jié)締組織、血管內(nèi)皮；
（2）、用外科手術(shù)剪把人頰脂體組織剪碎成1mm3的小塊；
（3）、用含有0.01%（m/v）ⅰ型膠原酶和0.05%（m/v）中性蛋白酶的高糖dmem培養(yǎng)基10ml，在37℃的條件下，消化60min；
（4）、吹打上述細(xì)胞懸液4-5次，在室溫條件下，以860×g的轉(zhuǎn)速，離心10min；
（5）、吸棄上層懸浮脂肪顆粒和成熟脂肪細(xì)胞，獲取底部細(xì)胞團(tuán)，采用pbs溶液重懸細(xì)胞，并用100μm孔徑濾膜過濾；
（6）、對(duì)細(xì)胞濾液計(jì)數(shù)，用過量的1×bdimag?buffer輕洗細(xì)胞，1500rpm離心5min，棄上清；
（7）、把cd31磁珠徹底渦旋均勻，然后每1×107個(gè)細(xì)胞加50μlcd31磁珠，混合均勻后，在30℃的條件下孵育30min；
（8）、用bdimag?buffer把體系調(diào)整到1-8×107個(gè)/ml細(xì)胞之后，迅速把標(biāo)記好的體系放到磁力架上孵育8-10分鐘；
（9）、吸出磁力架上的流式管里面的液體上清，上清細(xì)胞為cd31-細(xì)胞，此時(shí)即為去除了內(nèi)皮細(xì)胞后，純化的脂肪干細(xì)胞；
（10）、在1500rpm條件下，將上清液離心5min，棄上清；
（11）、將上述細(xì)胞置于37℃，5%co2培養(yǎng)箱中，用10mldmem培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，每周換液2次；
（12）、細(xì)胞融合度達(dá)到80%以上后，吸干培養(yǎng)液，用pbs液輕洗細(xì)胞兩次；
（13）、向培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)加入胰蛋白酶-edta溶液，直至覆蓋所有細(xì)胞為止，然后置于37℃，5%的co2溫箱2-3min后，倒置顯微鏡下觀察到細(xì)胞回縮，細(xì)胞間隙增大，再向培養(yǎng)瓶里加入10ml高糖dmem培養(yǎng)基終止消化；
（14）、用吸管反復(fù)吹打瓶底，使細(xì)胞脫落，再將細(xì)胞懸液在1200rpm條件下，離心7min，采用高糖dmem培養(yǎng)基洗3次；
（15）、將細(xì)胞按1:3比例分瓶傳代，并用含有10%（v/v）fbs，40u/ml硫酸慶大霉素的dmem培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)；
（16）、細(xì)胞傳至3代即可用于分化成神經(jīng)細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等組織，或細(xì)胞移植，或傳代至4代、5代進(jìn)行冷凍保存。
作為優(yōu)選，所述的步驟（7）中，在對(duì)cd31磁珠渦旋均勻之前，先用pbs液對(duì)cd31磁珠稀釋10倍，然后置于4℃保存?zhèn)溆茫?/p>
作為優(yōu)選，所述的步驟（11）中，所述的dmem培養(yǎng)基中含有10%（v/v）fbs和40u/ml硫酸慶大霉素。
作為優(yōu)選，所述的步驟（13）中，所述的胰蛋白酶-edta溶液中的胰蛋白酶的質(zhì)量濃度為0.25%，胰蛋白酶-edta溶液中的edta的質(zhì)量濃度為0.01%。
作為優(yōu)選，所述的步驟（13）中，胰蛋白酶-edta溶液購自北京雷根生物技術(shù)有限公司。
實(shí)施例1
本發(fā)明公開了一種高效的人頰脂體脂肪干細(xì)胞的制備方法，具體步驟為：
（1）、通過外科手術(shù)獲得的頰脂體組織，用d-hank’s溶液沖洗3次，洗去組織表面的結(jié)締組織、血管內(nèi)皮；
（2）、用外科手術(shù)剪把人頰脂體組織剪碎成1mm3的小塊；
（3）、用含有0.01%（m/v）ⅰ型膠原酶和0.05%（m/v）中性蛋白酶的高糖dmem培養(yǎng)基10ml，在37℃的條件下，消化60min；
（4）、吹打上述細(xì)胞懸液5次，在室溫條件下，以860×g的轉(zhuǎn)速，離心10min；
（5）、吸棄上層懸浮脂肪顆粒和成熟脂肪細(xì)胞，獲取底部細(xì)胞團(tuán)，采用pbs溶液重懸細(xì)胞，并用100μm孔徑濾膜過濾；
（6）、對(duì)細(xì)胞濾液計(jì)數(shù)，用過量的1×bdimag?buffer輕洗細(xì)胞，1500rpm離心5min，棄上清；
（7）、把cd31磁珠徹底渦旋均勻，然后每1×107個(gè)細(xì)胞加50μlcd31磁珠，混合均勻后，在30℃的條件下孵育30min；
（8）、用bdimag?buffer把體系調(diào)整到7×107個(gè)/ml細(xì)胞之后，迅速把標(biāo)記好的體系放到磁力架上孵育9分鐘；
（9）、吸出磁力架上的流式管里面的液體上清，上清細(xì)胞為cd31-細(xì)胞，此時(shí)即為去除了內(nèi)皮細(xì)胞后，純化的脂肪干細(xì)胞；
（10）、在1500rpm條件下，將上清液離心5min，棄上清；
（11）、將上述細(xì)胞置于37℃，5%co2培養(yǎng)箱中，用10mldmem培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，每周換液2次；
（12）、細(xì)胞融合度達(dá)到80%以上后，吸干培養(yǎng)液，用pbs液輕洗細(xì)胞兩次；
（13）、向培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)加入胰蛋白酶-edta溶液，直至覆蓋所有細(xì)胞為止，然后置于37℃，5%的co2溫箱2-3min后，倒置顯微鏡下觀察到細(xì)胞回縮，細(xì)胞間隙增大，再向培養(yǎng)瓶里加入10ml高糖dmem培養(yǎng)基終止消化；
（14）、用吸管反復(fù)吹打瓶底，使細(xì)胞脫落，再將細(xì)胞懸液在1200rpm條件下，離心7min，采用高糖dmem培養(yǎng)基洗3次；
（15）、將細(xì)胞按1:3比例分瓶傳代，并用含有10%（v/v）fbs，40u/ml硫酸慶大霉素的dmem培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)；
（16）、細(xì)胞傳至3代即可用于分化成神經(jīng)細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等組織，或細(xì)胞移植，或傳代至4代、5代進(jìn)行冷凍保存。
所述的步驟（7）中，在對(duì)cd31磁珠渦旋均勻之前，先用pbs液對(duì)cd31磁珠稀釋10倍，然后置于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>
所述的步驟（11）中，所述的dmem培養(yǎng)基中含有10%（v/v）fbs和40u/ml硫酸慶大霉素。
所述的步驟（13）中，所述的胰蛋白酶-edta溶液中的胰蛋白酶的質(zhì)量濃度為0.25%，胰蛋白酶-edta溶液中的edta的質(zhì)量濃度為0.01%。
所述的步驟（13）中，胰蛋白酶-edta溶液購自北京雷根生物技術(shù)有限公司。
實(shí)施例2
本發(fā)明公開了一種高效的人頰脂體脂肪干細(xì)胞的制備方法，具體步驟為：
（1）、通過外科手術(shù)獲得的頰脂體組織，用d-hank’s溶液沖洗3次，洗去組織表面的結(jié)締組織、血管內(nèi)皮；
（2）、用外科手術(shù)剪把人頰脂體組織剪碎成1mm3的小塊；
（3）、用含有0.01%（m/v）ⅰ型膠原酶和0.05%（m/v）中性蛋白酶的高糖dmem培養(yǎng)基10ml，在37℃的條件下，消化60min；
（4）、吹打上述細(xì)胞懸液5次，在室溫條件下，以860×g的轉(zhuǎn)速，離心10min；
（5）、吸棄上層懸浮脂肪顆粒和成熟脂肪細(xì)胞，獲取底部細(xì)胞團(tuán)，采用pbs溶液重懸細(xì)胞，并用100μm孔徑濾膜過濾；
（6）、對(duì)細(xì)胞濾液計(jì)數(shù)，用過量的1×bdimag?buffer輕洗細(xì)胞，1500rpm離心5min，棄上清；
（7）、把cd31磁珠徹底渦旋均勻，然后每1×107個(gè)細(xì)胞加50μlcd31磁珠，混合均勻后，在30℃的條件下孵育30min；
（8）、用bdimag?buffer把體系調(diào)整到7×107個(gè)/ml細(xì)胞之后，迅速把標(biāo)記好的體系放到磁力架上孵育10分鐘；
（9）、吸出磁力架上的流式管里面的液體上清，上清細(xì)胞為cd31-細(xì)胞，此時(shí)即為去除了內(nèi)皮細(xì)胞后，純化的脂肪干細(xì)胞；
（10）、在1500rpm條件下，將上清液離心5min，棄上清；
（11）、將上述細(xì)胞置于37℃，5%co2培養(yǎng)箱中，用10mldmem培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，每周換液2次；
（12）、細(xì)胞融合度達(dá)到80%以上后，吸干培養(yǎng)液，用pbs液輕洗細(xì)胞兩次；
（13）、向培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)加入胰蛋白酶-edta溶液，直至覆蓋所有細(xì)胞為止，然后置于37℃，5%的co2溫箱3min后，倒置顯微鏡下觀察到細(xì)胞回縮，細(xì)胞間隙增大，再向培養(yǎng)瓶里加入10ml高糖dmem培養(yǎng)基終止消化；
（14）、用吸管反復(fù)吹打瓶底，使細(xì)胞脫落，再將細(xì)胞懸液在1200rpm條件下，離心7min，采用高糖dmem培養(yǎng)基洗3次；
（15）、將細(xì)胞按1:3比例分瓶傳代，并用含有10%（v/v）fbs，40u/ml硫酸慶大霉素的dmem培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)；
（16）、細(xì)胞傳至3代即可用于分化成神經(jīng)細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等組織，或細(xì)胞移植，或傳代至4代、5代進(jìn)行冷凍保存。
所述的步驟（7）中，在對(duì)cd31磁珠渦旋均勻之前，先用pbs液對(duì)cd31磁珠稀釋10倍，然后置于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>
所述的步驟（11）中，所述的dmem培養(yǎng)基中含有10%（v/v）fbs和40u/ml硫酸慶大霉素。
所述的步驟（13）中，所述的胰蛋白酶-edta溶液中的胰蛋白酶的質(zhì)量濃度為0.25%，胰蛋白酶-edta溶液中的edta的質(zhì)量濃度為0.01%。
所述的步驟（13）中，胰蛋白酶-edta溶液購自北京雷根生物技術(shù)有限公司。
以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理、主要特征和本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)。本行業(yè)的技術(shù)人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實(shí)施例的限制，上述實(shí)施例和說明書中描述的只是本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下本發(fā)明還會(huì)有各種變化和改進(jìn)，這些變化和改進(jìn)都落入要求保護(hù)的本發(fā)明的范圍內(nèi)。本發(fā)明要求的保護(hù)范圍由所附的權(quán)利要求書及其等同物界定。