本發(fā)明屬于生物鑒別技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種真菌的鑒別方法，特別是涉及一種用于鑒別杯傘屬真菌亞歷山大杯傘的ITS特異性分子標(biāo)記，以及用于所述鑒別方法的專用引物、探針和基因芯片。

背景技術(shù)：

管涔山地處呂梁山系北端，平均海波1800～2000m，是溫帶大陸性季風(fēng)氣候和西伯利亞冬季冷氣團(tuán)交融門戶，降雨量充沛，是山西三大河流的發(fā)源地，植物覆蓋率高，植被分布呈現(xiàn)明顯的垂直帶譜。特殊的地理環(huán)境和氣候環(huán)境造就了該地區(qū)獨(dú)特的生物多樣性，而來(lái)自管涔山脈的食用菌也因其獨(dú)特的風(fēng)味和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，曾被納為皇室貢品。因此，開(kāi)展管涔山系食用菌分子標(biāo)記研究，對(duì)于這一地區(qū)特有品種的開(kāi)發(fā)與保護(hù)具有重要意義。

亞歷山大杯傘，Clitocybe alexandri，擔(dān)子菌綱、傘菌目、白蘑科、杯傘屬，是一種生長(zhǎng)在管涔山一帶的著名野生食用菌。亞歷山大杯傘多發(fā)生在夏末、秋初季節(jié)，生于林中地上或草地上，群生或散生，菌體大且肉厚，香味濃郁，子實(shí)體肉紅色，在當(dāng)?shù)赜址Q為“紅銀盤”。亞歷山大杯傘不僅營(yíng)養(yǎng)豐富，且抗癌效果表明對(duì)小白鼠肉瘤180的抑制率為70%，對(duì)艾氏癌的抑制率為80%，具有極大的開(kāi)發(fā)利用和保健價(jià)值。

傳統(tǒng)的食用菌分類鑒定主要依據(jù)子實(shí)體的形態(tài)學(xué)特征，包括擔(dān)孢子的大小和子實(shí)體真皮菌絲的形態(tài)特征。但子實(shí)體的許多形態(tài)學(xué)特征往往隨生長(zhǎng)條件的不同而發(fā)生變化，同時(shí)許多鑒別性特征又經(jīng)常是幾個(gè)種所共有，這就給傳統(tǒng)的分類學(xué)帶來(lái)了很大困難，僅僅依據(jù)形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行菌種鑒定不是十分可靠。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，特別是分于標(biāo)記和基因標(biāo)記技術(shù)的建立與成熟，為發(fā)展簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確的食用菌鑒定技術(shù)提供了有效手段?；蛐酒且环N新型的DNA識(shí)別技術(shù)，利用芯片的高通量和特異性優(yōu)勢(shì)，可以在芯片上對(duì)相近親緣關(guān)系的食用菌進(jìn)行辨識(shí)，以提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性。同時(shí)，基因芯片檢測(cè)主要操作步驟依靠?jī)x器設(shè)備完成，檢測(cè)周期只需要6～8小時(shí)，不依賴傳統(tǒng)檢測(cè)中人的主觀經(jīng)驗(yàn)，可以在短時(shí)間內(nèi)獲得準(zhǔn)確的檢測(cè)鑒別結(jié)果。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種亞歷山大杯傘特異性ITS分子標(biāo)記，以建立一種快速、靈敏、特異性好的亞歷山大杯傘鑒別方法。

提供用于所述亞歷山大杯傘鑒別方法的引物和核酸探針，是本發(fā)明的另一發(fā)明目的。

本發(fā)明采用基因克隆技術(shù)，并結(jié)合基因芯片技術(shù)，首先獲得了亞歷山大杯傘ITS DNA片段中一段高度保守且特異性強(qiáng)的核酸序列，以作為特異性鑒別亞歷山大杯傘的分子標(biāo)記；進(jìn)而依據(jù)該分子標(biāo)記設(shè)計(jì)并合成了一組特異性引物和核酸探針，建立了特異性鑒別亞歷山大杯傘的方法，并對(duì)所建立的方法進(jìn)行了有效性評(píng)估試驗(yàn)。

為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明所提供的亞歷山大杯傘ITS特異性分子標(biāo)記的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。所述ITS特異性分子標(biāo)記是使用通用引物ITS1/ITS4對(duì)從不同產(chǎn)地的亞歷山大杯傘中提取的總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物進(jìn)行毛細(xì)管測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在NCBI中進(jìn)行全核酸數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)分析，確定出的能夠作為基因芯片檢測(cè)靶序列的特征序列。

進(jìn)而，本發(fā)明根據(jù)上述靶序列，依據(jù)引物與探針設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)了一對(duì)具有SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所述核苷酸序列的、用于擴(kuò)增所述ITS特異性分子標(biāo)記的引物，以及一種具有SEQ ID NO.4所述核苷酸序列的、用于檢測(cè)所述ITS特異性分子標(biāo)記的核酸探針。

更具體地，本發(fā)明是在引物1的5'端標(biāo)記有熒光報(bào)告基團(tuán)Hex，并將所述核酸探針進(jìn)行氨基化處理，即在核酸探針的5'端連接氨基，最終人工合成出具有下述核苷酸序列的引物和核酸探針。

引物1：5'Hex-GCTGGTCTCTTTTTGAAATCA-3'。

引物2：5'-TCAAAGTTAGAGAGGTTGAGA-3'。

核酸探針：5'NH₃-TTTTTTTTTTTTGAAAAGATAGACCAGAAATATAAGAGA-3'。

本發(fā)明還提供了一種用于檢測(cè)亞歷山大杯傘的基因芯片。本發(fā)明所述的基因芯片采用本領(lǐng)域常規(guī)方法制備，并在所述基因芯片上固定有上述核酸探針。所述基因芯片采用的片基優(yōu)選常規(guī)的醛基片基，以與所述氨基化的探針配合。

本發(fā)明也提供了一種用于鑒別亞歷山大杯傘的試劑盒，在所述試劑盒中至少包含有上述的亞歷山大杯傘檢測(cè)用基因芯片或核酸探針，用于擴(kuò)增本發(fā)明所述亞歷山大杯傘ITS特異性分子標(biāo)記的專用引物和PCR擴(kuò)增試劑，以及其他必要的相關(guān)試劑。

最后，本發(fā)明提供了一種鑒別亞歷山大杯傘的方法，本發(fā)明所述方法是利用上述亞歷山大杯傘ITS特異性分子標(biāo)記對(duì)亞歷山大杯傘進(jìn)行鑒定，利用PCR方法獲得的亞歷山大杯傘擴(kuò)增產(chǎn)物中應(yīng)包含有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

具體地，本發(fā)明所述鑒別亞歷山大杯傘的方法包括：

a) 提取亞歷山大杯傘待測(cè)樣本菌株或子實(shí)體的基因組總DNA；

b) 以所述引物對(duì)所述提取的總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；

c) 將所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與所述核酸探針進(jìn)行原位雜交，以特異性鑒定出亞歷山大杯傘。

本發(fā)明在PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與核酸探針原位雜交后，洗去未雜交的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，對(duì)雜交結(jié)果進(jìn)行檢測(cè)。雜交結(jié)果為陽(yáng)性，則所述待測(cè)樣本為亞歷山大杯傘；雜交結(jié)果為陰性，則所述待測(cè)樣本不為亞歷山大杯傘。

本發(fā)明優(yōu)選采用激光共聚焦掃描儀對(duì)上述雜交結(jié)果進(jìn)行熒光掃描檢測(cè)。

本發(fā)明上述方法中，所述基因組總DNA提取、PCR擴(kuò)增、原位雜交的方法也都是常規(guī)的。

本發(fā)明較佳的PCR擴(kuò)增程序如下：95℃預(yù)熱5min；36個(gè)循環(huán)：95℃ 20s，58℃ 20s，72℃ 40s；最后72℃延伸5min。

使用本發(fā)明提供的專用引物和核酸探針對(duì)同一地域生長(zhǎng)的不同食用菌進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示只有亞歷山大杯傘的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與本發(fā)明核酸探針雜交結(jié)合并呈現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果(檢測(cè)位點(diǎn)亮)，其他食用菌的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與本發(fā)明核酸探針沒(méi)有雜交結(jié)合(檢測(cè)位點(diǎn)不亮)，說(shuō)明本發(fā)明設(shè)計(jì)的引物能將亞歷山大杯傘的特異性基因片段擴(kuò)增出來(lái)，并與亞歷山大杯傘核酸探針進(jìn)行有效結(jié)合。同時(shí)，采用不同的核酸探針與亞歷山大杯傘的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雜交，也只有本發(fā)明的核酸探針具有陽(yáng)性響應(yīng)，其他核酸探針無(wú)響應(yīng)，說(shuō)明亞歷山大杯傘核酸探針的特異性較好。以上結(jié)果證明本發(fā)明提供的檢測(cè)方法特異性、準(zhǔn)確性好。

因此，本發(fā)明提供的亞歷山大杯傘ITS特異分子標(biāo)記以及專用引物和核酸探針能夠應(yīng)用于亞歷山大杯傘的快速鑒定檢測(cè)中。本發(fā)明的特異性分子標(biāo)記鑒別方法不僅具有比常規(guī)形態(tài)學(xué)判斷更精確的鑒定結(jié)果，而且與其他檢測(cè)方法比較檢測(cè)時(shí)間短、準(zhǔn)確性高，檢測(cè)所需時(shí)間只需8個(gè)小時(shí)，而傳統(tǒng)的培養(yǎng)聯(lián)合化學(xué)顯色反應(yīng)鑒定耗時(shí)10～15天，拮抗試驗(yàn)則至少需要兩周時(shí)間，出菇試驗(yàn)更需要5～6個(gè)月的時(shí)間。

附圖說(shuō)明

圖1是本發(fā)明核酸探針對(duì)不同真菌的鑒定結(jié)果。

圖中：Cl為亞歷山大杯傘檢測(cè)位點(diǎn)，Hy為煙色垂膜菇檢測(cè)位點(diǎn)，Le為木瑚菌屬Lentaria patouillardii檢測(cè)位點(diǎn)，Tr為鱗蓋口蘑檢測(cè)位點(diǎn)，Me為條柄铦囊蘑檢測(cè)位點(diǎn)，Ly為荷葉離褶傘檢測(cè)位點(diǎn)，Pe為青霉菌檢測(cè)位點(diǎn)，Cy為柱孢菌檢測(cè)位點(diǎn)。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的說(shuō)明，但應(yīng)該理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。本領(lǐng)域技術(shù)人員在本發(fā)明基礎(chǔ)上對(duì)本發(fā)明作出的各種改動(dòng)或修改，均應(yīng)同樣落于本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

下述實(shí)施例所用方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均按照常規(guī)方法和條件進(jìn)行，或按照商品說(shuō)明書選擇。所用引物、核酸探針和所用序列測(cè)定工作均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成和完成。

實(shí)施例1：亞歷山大杯傘基因組DNA提取。

亞歷山大杯傘菌樣材料采集于山西忻州岢嵐地區(qū)的管涔山落葉闊葉林帶，經(jīng)鑒定為杯傘屬真菌亞歷山大杯傘(Clitocybe alexandri)。

采用組織分離法，將子實(shí)體整體用75%乙醇擦拭消毒后，以手術(shù)刀在菌蓋、菌柄、菌褶、根部切取小塊組織，將切下的組織置于75%乙醇中浸泡30s，無(wú)菌水沖洗干凈，接種于121℃滅菌30min的PDA培養(yǎng)基(馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂15g，水1L)中。將接種的培養(yǎng)基置于27℃恒溫培養(yǎng)箱中，每隔24小時(shí)檢查一次菌絲生長(zhǎng)情況。

培養(yǎng)8天后，收集菌絲，用SIGMA真菌基因組提取試劑盒提取真菌的總DNA。提取方法及步驟詳見(jiàn)說(shuō)明書。將提取的基因組DNA稀釋至50ng/μL，-20℃保存。

實(shí)施例2：ITS特異性分子標(biāo)記的確定。

以實(shí)施例1獲取的亞歷山大杯傘總DNA為模板，使用通用引物ITS1/ITS4對(duì)DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物進(jìn)行毛細(xì)管測(cè)序，得到詳細(xì)的序列信息。

將測(cè)序結(jié)果在NCBI中進(jìn)行全核酸數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)分析，篩選獲得保守性高的片段，對(duì)選取的不同序列的結(jié)果進(jìn)行比較和選擇，最終確定了一段測(cè)序結(jié)果中的特征性序列，所述亞歷山大杯傘的特異性基因片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

經(jīng)過(guò)同源性比對(duì)檢索后，確定所選取的靶序列為一段特異性較高的DNA 序列，可以作為基因芯片檢測(cè)的靶序列。

實(shí)施例3：引物與核酸探針的設(shè)計(jì)。

根據(jù)實(shí)施例2確定的靶序列作為分子標(biāo)記，依據(jù)引物與核酸探針設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的專用引物，以及SEQ ID NO.4所示的核酸探針。

引物1：5'Hex-GCTGGTCTCTTTTTGAAATCA-3'。

引物2：5'-TCAAAGTTAGAGAGGTTGAGA-3'。

核酸探針：5'NH₃-TTTTTTTTTTTTGAAAAGATAGACCAGAAATATAAGAGA-3'。

其中，在引物1的5'端標(biāo)記有熒光報(bào)告基團(tuán)Hex；在核酸探針的5'端連接氨基，將核酸探針進(jìn)行氨基化處理。

實(shí)施例4：基因芯片的制備。

將實(shí)施例3中氨基化的核酸探針按一定濃度點(diǎn)在醛基片基上，室溫放置過(guò)夜，先后用洗脫液I(5×SSC，1%SDS)、洗脫液II(0.25×SSC，1%SDS)各洗脫5min，將沒(méi)有固定上的探針洗脫掉，然后離心甩干，制備成基因芯片備用。

實(shí)施例5：待測(cè)真菌的PCR擴(kuò)增及熒光標(biāo)記鑒定。

取待測(cè)真菌，以SIGMA真菌基因組提取試劑盒提取真菌的總DNA。以實(shí)施例3設(shè)計(jì)的帶有熒光標(biāo)記的專用引物對(duì)所提取的總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增體系如下。

PCR擴(kuò)增程序如下：95℃預(yù)熱5min；36個(gè)循環(huán)：95℃ 20s，58℃ 20s，72℃ 40s；最后72℃延伸5min。

將上述擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物與實(shí)施例4制備的基因芯片進(jìn)行原位雜交，在42℃下保持40min，用洗脫液I(5×SSC，1%SDS)、洗脫液II(0.25×SSC，1%SDS)各洗脫5min，洗去未雜交的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，用激光共聚焦掃描儀檢測(cè)基因芯片雜交結(jié)果。核酸探針檢測(cè)位點(diǎn)顯綠色熒光，證明雜交結(jié)果為陽(yáng)性，待測(cè)真菌為亞歷山大杯傘。核酸探針檢測(cè)位點(diǎn)無(wú)熒光亮點(diǎn)則雜交結(jié)果為陰性，待測(cè)真菌不屬于亞歷山大杯傘。

實(shí)施例6：核酸探針對(duì)亞歷山大杯傘的特異性檢測(cè)驗(yàn)證。

為證明本發(fā)明核酸探針對(duì)亞歷山大杯傘的特異性響應(yīng)，選取另外5種在亞歷山大杯傘生長(zhǎng)環(huán)境中常見(jiàn)的其他食用菌：煙色垂膜菇、微黃木瑚菌、條柄铦囊蘑、鱗蓋口蘑、荷葉離褶傘，以及食用菌中常見(jiàn)的一般內(nèi)生菌：青霉菌和柱孢菌，與亞歷山大杯傘一同提取總DNA并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以本發(fā)明核酸探針進(jìn)行原位雜交，檢測(cè)結(jié)果如圖1所示。

結(jié)果顯示與亞歷山大杯傘相同生長(zhǎng)環(huán)境內(nèi)的其他食用菌以及內(nèi)生菌均沒(méi)有被檢測(cè)，只有亞歷山大杯傘檢測(cè)位點(diǎn)顯色，證明本發(fā)明設(shè)計(jì)的靶序列及對(duì)應(yīng)的核酸探針和專用引物可以特異性的檢測(cè)出亞歷山大杯傘。

繼而，收集了多份不同的亞歷山大杯傘樣本并提取總DNA，以本發(fā)明專用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，與核酸探針原位雜交，檢測(cè)結(jié)果顯示所有亞歷山大杯傘樣本的雜交結(jié)果均呈陽(yáng)性，證明具有專屬性。

實(shí)施例7：核酸探針的檢測(cè)特異性。

為進(jìn)一步驗(yàn)證本發(fā)明核酸探針的可靠性和分辨率，選取另外7種不同的核酸探針，與本發(fā)明所述核酸探針共同對(duì)亞歷山大杯傘總DNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行原位雜交。其中核酸探針1為本發(fā)明采用的核酸探針。

核酸探針1：5'NH₃-TTTTTTTTTTTTGAAAAGATAGACCAGAAATATAAGAGA-3'。

核酸探針:2：5'NH₃-TTTTTTTTTTTTACCTCGGAAAATAGAATCCAGGTCTA-3'。

核酸探針3：5'NH₃-TTTTTTTTTTTTAAGTGTATATGGACAAAGGCGAGGGGCG-3'。

核酸探針4：5'NH₃-TTTTTTTTTTTTAGGCGTGCACATACATGCTCCGAAGGAG-3'。

核酸探針5：5'NH₃-TTTTTTTTTTTTCTCAAGGACTGAATTACATTCATTACA-3'。

核酸探針6：5'NH₃-TTTTTTTTTTTTCAACCCCCACATCCAAACCTAACCAAAC-3'。

核酸探針7：5'NH₃-TTTTTTTTTTTTACACGGGTGGGGAGGTTGGACCCAGGA-3'。

核酸探針8：5'NH₃-TTTTTTTTTTTTGACGGCGGGCGCGCGGCTCCCGGAGGTG-3'。

鑒別試驗(yàn)過(guò)程同實(shí)施例5。結(jié)果顯示，只有核酸探針1對(duì)亞歷山大杯傘呈陽(yáng)性顯示，其他核酸探針均為陰性顯示，說(shuō)明本發(fā)明核酸探針對(duì)亞歷山大杯傘具有非常高的特異性，能將亞歷山大杯傘與其他真菌區(qū)分開(kāi)。

SEQUENCE LISTING

〈110〉 山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所

〈120〉 一種亞歷山大杯傘鑒別用分子標(biāo)記及引物和探針

〈160〉 4

〈170〉 Patentin version 3.2

〈210〉 1

〈211〉 460

〈212〉 DNA

〈213〉 亞歷山大杯傘 Clitocybe alexandri

〈400〉 1

GGAGGACATT ATTGAATAAA CTTGGTGCAT TGTAGCTGGC TCTTTGGAGC ATGTGCACAT 60

GTGCTTTTGT TCTTTTCCAC CTGTGCACCC ATTGTAGATC TTGGATACCT CTCGAGGAAA 120

CTCGGTTTGA GAGTTGCTGG TCTCTTTTTG AAATCAGCTT CTCTTATATT TCTGGTCTAT 180

CTTTTCATAT ACCCTATAGT ATGTTTTAGA ATGTTTATAA TGGGCTTGGT TGCCTTTAAC 240

ATTAATACAA CTTTCAACAA CGGATCTCTT GGCTCTCGCA TCGATGAAGA ACGCAGCGAA 300

ATGCGATAAG TAATGTGAAT TGCAGAATTC AGTGAATCAT CGAATCTTTG AACGCACCTT 360

GCGCTCCTTG GTATTCCGAG GAGCATGCCT GTTTGAGTGT CATTAAATTC TCAACCTCTC 420

TAACTTTGAC CAAGTTGGTT AGGTTTGGAT TGTGGGGGTT 460

〈210〉 2

〈211〉 21

〈212〉 DNA

〈213〉 正向引物

〈400〉 2

GCTGGTCTCT TTTTGAAATC A 21

〈210〉 3

〈211〉 21

〈212〉 DNA

〈213〉 反向引物

〈400〉 3

TCAAAGTTAG AGAGGTTGAG A 21

〈210〉 4

〈211〉 39

〈212〉 DNA

〈213〉 探針

〈400〉 4

TTTTTTTTTT TTGAAAAGAT AGACCAGAAA TATAAGAGA 39