本發(fā)明屬于生物鑒別技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種真菌的鑒別方法，特別是涉及一種用于鑒別青霉菌的ITS特異性分子標(biāo)記，以及用于所述鑒別方法的專用引物、探針和基因芯片。

背景技術(shù)：

青霉菌，Penicillium (P.species)，是子囊菌亞門、不整囊菌綱、散囊菌目、散囊菌科青霉屬真菌的總稱。青霉菌菌絲體由多數(shù)具有橫隔的菌絲組成，通常以產(chǎn)生分生孢子進(jìn)行繁殖，分生孢子脫落后，遇適宜的環(huán)境萌發(fā)成菌絲。青霉菌種類很多，通常生于柑桔類水果上，蔬菜、糧食、肉類、皮革和食物上也常有分布。

青霉菌也是食用菌菌種分離、菌種生產(chǎn)和栽培過程中廣泛引起污染的一種雜菌，在蘑菇、平菇、香菇、鳳尾菇、草菇和金針菇等食用菌的制種和栽培過程中均能侵染危害，是影響食用菌產(chǎn)量和品質(zhì)的常見病菌。青霉存在于多種有機(jī)質(zhì)上，多為腐生或弱性寄生。培養(yǎng)料中的麥麩、米糠等輔料是青霉菌孳生的條件，致病后產(chǎn)生的新分生孢子可通過人工噴水、氣流、昆蟲等媒介再次傳染。青霉菌侵害菇床和污染培養(yǎng)料后，能抑制食用菌菌絲的生長，使之不能形成子實(shí)體，即使形成子實(shí)體也會(huì)使其變褐腐爛。因此，對食用菌及其栽培環(huán)境進(jìn)行青霉菌的快速檢測具有現(xiàn)實(shí)意義。

對于這種肉眼無法觀察的致病菌，如果采用常規(guī)的培養(yǎng)方法，至少需要4～5天的檢測周期，而且其菌落形態(tài)還不易明確辨識。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，特別是分于標(biāo)記和基因標(biāo)記技術(shù)的建立與成熟，為發(fā)展簡便、快速、準(zhǔn)確的真菌鑒定技術(shù)提供了有效手段?；蛐酒且环N新型的DNA識別技術(shù)，利用芯片的高通量和特異性優(yōu)勢，可以在芯片上對真菌進(jìn)行有效辨識，以提高檢測的準(zhǔn)確性。同時(shí)，基因芯片檢測主要操作步驟依靠儀器設(shè)備完成，檢測周期只需要6～8小時(shí)，不依賴傳統(tǒng)檢測中人的主觀經(jīng)驗(yàn)，可以在短時(shí)間內(nèi)獲得準(zhǔn)確的檢測鑒別結(jié)果。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種青霉菌特異性ITS分子標(biāo)記，以建立一種快速、靈敏、特異性好的青霉菌鑒別方法。

提供用于所述青霉菌鑒別方法的引物和核酸探針，是本發(fā)明的另一發(fā)明目的。

本發(fā)明采用基因克隆技術(shù)，并結(jié)合基因芯片技術(shù)，首先獲得了青霉菌ITS DNA片段中一段高度保守且特異性強(qiáng)的核酸序列，以作為特異性鑒別青霉菌的分子標(biāo)記；進(jìn)而依據(jù)該分子標(biāo)記設(shè)計(jì)并合成了一組特異性引物和核酸探針，建立了特異性鑒別青霉菌的方法，并對所建立的方法進(jìn)行了有效性評估試驗(yàn)。

為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明所提供的青霉菌ITS特異性分子標(biāo)記的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。所述ITS特異性分子標(biāo)記是使用通用引物ITS1/ITS4對從青霉菌中提取的總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物進(jìn)行毛細(xì)管測序，測序結(jié)果在NCBI中進(jìn)行全核酸數(shù)據(jù)庫比對分析，確定出的能夠作為基因芯片檢測靶序列的特征序列。

進(jìn)而，本發(fā)明根據(jù)上述靶序列，依據(jù)引物與探針設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)了一對具有SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所述核苷酸序列的、用于擴(kuò)增所述ITS特異性分子標(biāo)記的引物，以及一種具有SEQ ID NO.4所述核苷酸序列的、用于檢測所述ITS特異性分子標(biāo)記的核酸探針。

更具體地，本發(fā)明是在引物1的5'端標(biāo)記有熒光報(bào)告基團(tuán)Hex，并將所述核酸探針進(jìn)行氨基化處理，即在核酸探針的5'端連接氨基，最終人工合成出具有下述核苷酸序列的引物和核酸探針。

引物1：5'Hex-GATCTTTCCTGAGTGAGGGCC -3'。

引物2：5'-CTACAGAGCGGGTGACAAAGC -3'。

核酸探針：5'NH₃-TTTTTTTTTTTTACACGGGTGGGGAGGTTGGACCCAGGA -3'。

本發(fā)明還提供了一種用于檢測青霉菌的基因芯片。本發(fā)明所述的基因芯片采用本領(lǐng)域常規(guī)方法制備，并在所述基因芯片上固定有上述核酸探針。所述基因芯片采用的片基優(yōu)選常規(guī)的醛基片基，以與所述氨基化的探針配合。

本發(fā)明也提供了一種用于鑒別青霉菌的試劑盒，在所述試劑盒中至少包含有上述的青霉菌檢測用基因芯片或核酸探針，用于擴(kuò)增本發(fā)明所述青霉菌ITS特異性分子標(biāo)記的專用引物和PCR擴(kuò)增試劑，以及其他必要的相關(guān)試劑。

最后，本發(fā)明提供了一種鑒別青霉菌的方法，本發(fā)明所述方法是利用上述青霉菌ITS特異性分子標(biāo)記對青霉菌進(jìn)行鑒定，利用PCR方法獲得的青霉菌擴(kuò)增產(chǎn)物中應(yīng)包含有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

具體地，本發(fā)明所述鑒別青霉菌的方法包括：

a) 提取待檢測樣本的基因組總DNA；

b) 以所述引物對所述提取的總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；

c) 將所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與所述核酸探針進(jìn)行原位雜交，以特異性鑒定出所述待檢測樣本中是否含有青霉菌。

本發(fā)明在PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與核酸探針原位雜交后，洗去未雜交的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，對雜交結(jié)果進(jìn)行檢測。雜交結(jié)果為陽性，則所述待測樣本中含有青霉菌；雜交結(jié)果為陰性，則所述待測樣本中不含有青霉菌。

本發(fā)明優(yōu)選采用激光共聚焦掃描儀對上述雜交結(jié)果進(jìn)行熒光掃描檢測。

本發(fā)明上述方法中，所述基因組總DNA提取、PCR擴(kuò)增、原位雜交的方法也都是常規(guī)的。

本發(fā)明較佳的PCR擴(kuò)增程序如下：95℃預(yù)熱5min；36個(gè)循環(huán)：95℃ 20s，58℃ 20s，72℃ 40s；最后72℃延伸5min。

使用本發(fā)明提供的專用引物和核酸探針對青霉菌和不含青霉菌的食用菌進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示，只有青霉菌的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與本發(fā)明核酸探針雜交結(jié)合并呈現(xiàn)陽性結(jié)果(檢測位點(diǎn)亮)，其他食用菌或食用菌內(nèi)生菌的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與本發(fā)明核酸探針沒有雜交結(jié)合(檢測位點(diǎn)不亮)，說明本發(fā)明設(shè)計(jì)的引物能將青霉菌的特異性基因片段擴(kuò)增出來，并與青霉菌核酸探針進(jìn)行有效結(jié)合。同時(shí)，采用不同的核酸探針與青霉菌的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雜交，也只有本發(fā)明的核酸探針具有陽性響應(yīng)，其他核酸探針無響應(yīng)，說明本發(fā)明青霉菌核酸探針的特異性較好。以上結(jié)果證明本發(fā)明提供的檢測方法特異性、準(zhǔn)確性好。

因此，本發(fā)明提供的青霉菌ITS特異分子標(biāo)記以及專用引物和核酸探針能夠應(yīng)用于內(nèi)生真菌青霉菌的快速鑒定檢測。本發(fā)明的特異性分子標(biāo)記鑒別方法不僅具有比常規(guī)形態(tài)學(xué)判斷更精確的鑒定結(jié)果，而且與其他檢測方法比較檢測時(shí)間短、準(zhǔn)確性高，檢測所需時(shí)間只需8個(gè)小時(shí)，而傳統(tǒng)的培養(yǎng)聯(lián)合化學(xué)顯色反應(yīng)鑒定耗時(shí)10～15天，拮抗試驗(yàn)則至少需要兩周時(shí)間。

附圖說明

圖1是本發(fā)明核酸探針對不同真菌的鑒定結(jié)果。

圖中：Cl為亞歷山大杯傘檢測位點(diǎn)，Hy為煙色垂膜菇檢測位點(diǎn)，Le為木瑚菌屬Lentaria patouillardii檢測位點(diǎn)，Tr為鱗蓋口蘑檢測位點(diǎn)，Me為條柄铦囊蘑檢測位點(diǎn)，Ly為荷葉離褶傘檢測位點(diǎn)，Pe為青霉菌檢測位點(diǎn)，Cy為柱孢菌檢測位點(diǎn)。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的說明，但應(yīng)該理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。本領(lǐng)域技術(shù)人員在本發(fā)明基礎(chǔ)上對本發(fā)明作出的各種改動(dòng)或修改，均應(yīng)同樣落于本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

下述實(shí)施例所用方法如無特殊說明，均按照常規(guī)方法和條件進(jìn)行，或按照商品說明書選擇。所用引物、核酸探針和所用序列測定工作均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成和完成。

實(shí)施例1：青霉菌基因組DNA提取。

取500μl過夜培養(yǎng)的青霉素菌液(OD₂₈₀值0.6)，置于-80℃冷凍30min使充分凝固；將凝固的菌塊放于研磨中，液氮環(huán)境下充分研磨至粉末狀，轉(zhuǎn)移至500μl的CTAB中，65℃水浴約30min；冷卻后加入600μl酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)混勻，12000rpm離心15min；吸上清于EP管中，加入600μl氯仿∶異戊醇(24∶1)，12000rpm離心15min；吸上清，轉(zhuǎn)入新的離心管中，加入1/3體積NaAc(3mol/l)，1ml -20℃預(yù)冷的無水乙醇，混勻后置于-20℃靜置3～4h；12000rpm離心10min，棄上清，向離心管中加入75%乙醇洗滌2～3次，置于吸水紙上倒置晾干；加入ddH₂O 20μl溶解DNA，-20℃保存。

實(shí)施例2：ITS特異性分子標(biāo)記的確定。

以實(shí)施例1獲取的青霉菌總DNA為模板，使用通用引物ITS1/ITS4對DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物進(jìn)行毛細(xì)管測序，得到詳細(xì)的序列信息。

將測序結(jié)果在NCBI中進(jìn)行全核酸數(shù)據(jù)庫比對分析，篩選獲得保守性高的片段，對選取的不同序列的結(jié)果進(jìn)行比較和選擇，最終確定了一段測序結(jié)果中的特征性序列，所述青霉菌的特異性基因片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

經(jīng)過同源性比對檢索后，確定所選取的靶序列為一段特異性較高的DNA 序列，可以作為基因芯片檢測的靶序列。

實(shí)施例3：引物與核酸探針的設(shè)計(jì)。

根據(jù)實(shí)施例2確定的靶序列作為分子標(biāo)記，依據(jù)引物與核酸探針設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的專用引物，以及SEQ ID NO.4所示的核酸探針。

引物1：5'Hex-GATCTTTCCTGAGTGAGGGCC -3'。

引物2：5'-CTACAGAGCGGGTGACAAAGC -3'。

核酸探針：5'NH₃-TTTTTTTTTTTTACACGGGTGGGGAGGTTGGACCCAGGA -3'。

其中，在引物1的5'端標(biāo)記有熒光報(bào)告基團(tuán)Hex；在核酸探針的5'端連接氨基，將核酸探針進(jìn)行氨基化處理。

實(shí)施例4：基因芯片的制備。

將實(shí)施例3中氨基化的核酸探針按一定濃度點(diǎn)在醛基片基上，室溫放置過夜，先后用洗脫液I(5×SSC，1%SDS)、洗脫液II(0.25×SSC，1%SDS)各洗脫5min，將沒有固定上的探針洗脫掉，然后離心甩干，制備成基因芯片備用。

實(shí)施例5：待測真菌的PCR擴(kuò)增及熒光標(biāo)記鑒定。

取待測真菌，用SIGMA真菌基因組提取試劑盒提取真菌的總DNA，提取方法及步驟詳見說明書。

以實(shí)施例3設(shè)計(jì)的帶有熒光標(biāo)記的專用引物對上述提取的總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增體系如下。

PCR擴(kuò)增程序如下：95℃預(yù)熱5min；36個(gè)循環(huán)：95℃ 20s，58℃ 20s，72℃ 40s；最后72℃延伸5min。

將上述擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物與實(shí)施例4制備的基因芯片進(jìn)行原位雜交，在42℃下保持40min，用洗脫液I(5×SSC，1%SDS)、洗脫液II(0.25×SSC，1%SDS)各洗脫5min，洗去未雜交的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，用激光共聚焦掃描儀檢測基因芯片雜交結(jié)果。核酸探針檢測位點(diǎn)顯綠色熒光，證明雜交結(jié)果為陽性，待測真菌中含有青霉菌。核酸探針檢測位點(diǎn)無熒光亮點(diǎn)則雜交結(jié)果為陰性，待測真菌中不含有青霉菌。

實(shí)施例6：核酸探針對青霉菌的特異性檢測驗(yàn)證。

為證明本發(fā)明核酸探針對青霉菌的特異性響應(yīng)，選取6種沒有感染青霉菌的常見食用菌：亞歷山大杯傘、煙色垂膜菇、微黃木瑚菌、條柄铦囊蘑、鱗蓋口蘑、荷葉離褶傘，以及食用菌中另一種常見的內(nèi)生菌柱孢菌，與青霉菌一同提取總DNA并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以本發(fā)明核酸探針進(jìn)行原位雜交，檢測結(jié)果如圖1所示。

結(jié)果顯示沒有感染青霉菌的食用菌以及柱孢菌均沒有被檢測，只有青霉菌檢測位點(diǎn)顯色，證明本發(fā)明設(shè)計(jì)的靶序列及對應(yīng)的核酸探針和專用引物可以特異性的檢測出青霉菌。

繼而收集了多份不同的青霉菌樣本提取總DNA，以本發(fā)明專用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，與核酸探針原位雜交，檢測結(jié)果顯示所有青霉菌樣本的雜交結(jié)果均呈陽性，證明具有專屬性。

實(shí)施例7：核酸探針的檢測特異性。

為進(jìn)一步驗(yàn)證本發(fā)明核酸探針的可靠性和分辨率，選取另外7種不同的核酸探針，與本發(fā)明所述核酸探針共同對青霉菌總DNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行原位雜交。其中核酸探針1為本發(fā)明采用的核酸探針。

核酸探針1：5'NH₃-TTTTTTTTTTTTACACGGGTGGGGAGGTTGGACCCAGGA-3'。

核酸探針2：5'NH₃-TTTTTTTTTTTTGAAAAGATAGACCAGAAATATAAGAGA-3'。

核酸探針3：5'NH₃-TTTTTTTTTTTTACCTCGGAAAATAGAATCCAGGTCTA-3'。

核酸探針4：5'NH₃-TTTTTTTTTTTTAAGTGTATATGGACAAAGGCGAGGGGCG-3'。

核酸探針5：5'NH₃-TTTTTTTTTTTTAGGCGTGCACATACATGCTCCGAAGGAG-3'。

核酸探針6：5'NH₃-TTTTTTTTTTTTCTCAAGGACTGAATTACATTCATTACA-3'。

核酸探針7：5'NH₃-TTTTTTTTTTTTCAACCCCCACATCCAAACCTAACCAAAC-3'。

核酸探針8：5'NH₃-TTTTTTTTTTTTGACGGCGGGCGCGCGGCTCCCGGAGGTG-3'。

鑒別試驗(yàn)過程同實(shí)施例5。檢測結(jié)果顯示，只有核酸探針1對青霉菌呈陽性顯示，其他核酸探針均為陰性顯示，說明本發(fā)明核酸探針對青霉菌具有非常高的特異性，能將青霉菌與其他真菌區(qū)分開。

SEQUENCE LISTING

〈110〉 山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所

〈120〉 一種青霉菌鑒別用分子標(biāo)記及引物和探針

〈160〉 4

〈170〉 Patentin version 3.2

〈210〉 1

〈211〉 546

〈212〉 DNA

〈213〉 青霉菌 Penicillium (P.species)

〈400〉 1

GATCTTTCCT GAGTGAGGGC CCTTCCTGGG TCCAACCTCC CCACCCGTGT TTATTGTACC 60

TTGTTGCTTC GGTGCGCCCG CCTCACGGCC GCCGGGGGGC TTCTGCCCCC GGGCCCGCGC 120

CCACCGAAGA CACCATTGAA CTCTGTCTGA AGATTGCAGT CTGAGCATAA ACTAAATAAG 180

TTAAAACTTT CAACAACGGA TCTCTTGGTT CCGGCATCGA TGAAGAACGC AGCGAAATGC 240

GATAACTAAT GTGAATTGCA GAATTCAGTG AATCATCGAG TCTTTGAACG CACATTGCGC 300

CCCCTGGTAT TCCGGGGGGC ATGCCTGTCC GAGCGTCATT GCTGCCCTCA AGCACGGCTT 360

GTGTGTTGGG CTCCGTCCCC CCGGGGACGG GCCCGAAAGG CAGCGGCGGC ACCGAGTCCG 420

GTCCTCGAGC GTATGGGGCT TTGTCACCCG CTCTGTAGGC CCGGCCGGCG CCAGCCGACA 480

ACCCATCATC CTTTTCAGGT TGACCTCGGA TCAGGTAGGG ATACCCGCTG AACTTAAGCA 540

TATCAA 546

〈210〉 2

〈211〉 21

〈212〉 DNA

〈213〉 正向引物

〈400〉 2

GATCTTTCCT GAGTGAGGGC C 21

〈210〉 3

〈211〉 21

〈212〉 DNA

〈213〉 反向引物

〈400〉 3

CTACAGAGCG GGTGACAAAG C 21

〈210〉 4

〈211〉 39

〈212〉 DNA

〈213〉 探針

〈400〉 4

TTTTTTTTTT TTACACGGGT GGGGAGGTTG GACCCAGGA 39