本發(fā)明屬于農(nóng)產(chǎn)品精深加工技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種利用蘑菇下腳料制備天然麥角硫因的方法。

背景技術(shù)：

麥角硫因(巰基組氨酸三甲基內(nèi)鹽，L-Ergothione，EGT)是1909年在麥角菌(Claviceps purpurea)中首次發(fā)現(xiàn)的一種天然稀有的手性氨基酸類強抗氧化劑，是生物體內(nèi)重要的生理活性物質(zhì)，具有抗氧化、防止紫外線輻射損傷、螯合金屬離子、清除自由基，參與細胞內(nèi)能量調(diào)節(jié)以及細胞生理保護劑等多種作用，在食品、化妝品及生物醫(yī)藥等行業(yè)具有廣闊的應(yīng)用前景；麥角硫因的結(jié)構(gòu)式如下：

目前，存在以下幾種制備麥角硫因的技術(shù)方案：

方案1：CN 201410008812.0發(fā)明公開了一種以蕈菌菌絲體發(fā)酵液制備麥角硫因的方法。工藝流程步驟是：熱水浸提；超濾；干燥；色譜純化；濃縮干燥，制成成品。其中，超濾選用截留分子量為1kDa～30kDa的超濾膜；色譜條件為：以HILIC為填料，體積比80:20～88:12的乙腈-水為流動相，麥角硫因進樣量為每100g填料0.01g～0.0323g。

方案2：Mitsubishi用丙酮或乙醇溶液萃取杯傘屬子實體的干燥粉末，再利用柱層析、薄層層析、離子交換層析及紙電泳技術(shù)進一步純化麥角硫因(Mitsubishi，Chem Ind.JP58057365-A)。

方案3：Harada E利用乙酸乙酯浸提茶樹菇子實體，再通過陽離子交換樹脂和硅膠色譜層析進一步分離提取，冷凍干燥后，經(jīng)葡聚糖凝膠過濾和反相高壓液相色譜純化得高純度的麥角硫因(Univ Nagoya，Iwade Kingaku Kenkyusho Kk，Daicel Chem.Method for producing ergothioneine[P].JP:JP2009161498A)。

方案4：Nukina M等從人工栽培的蘑菇子實體中提取麥角硫因，首先將蘑菇干燥粉碎，熱水浸提，過濾后再用乙醇溶解，使用陽離子交換樹脂、硅膠薄層層析分離提取，后經(jīng)高壓液相色譜和冷凍干燥制備高純度麥角硫因(Nukina M.Preparation of ergothioneine useful in pharmaceuticals，by fractionating mushroom extract containing ergothioneine，with solvent，separating the ergothioneine，and purifying the fraction liquid containing the ergothioneine[P].JP:JP2008110988-A)。

方案5：周念波等從雙孢菇菇柄中提取麥角硫因，先將菇柄粉碎，利用熱的NaOH溶液浸提，離心去除固形物，上清液減壓濃縮，再使用氧化鋁層析分離提取，麥角硫因回收率為91.2％，純度達25.6％。(周念波，李軼群，殷勤紅，氧化鋁柱層析從雙孢菇菇柄中提取麥角硫因[J].安徽農(nóng)業(yè)科學，2010，38(27)：14842～14843)。

麥角硫因由于其天然無毒的性能和顯著抗氧化性使其成為天然高效抗氧化劑的最適選擇。但合成的麥角硫因產(chǎn)品難以被人們所接受，而天然來源—蘑菇中含量相對較低，尚缺乏適于產(chǎn)業(yè)化的提取純化技術(shù)因而限制了其應(yīng)用。

公開的技術(shù)方案存在以下缺陷：

方案1：以蕈菌菌絲體發(fā)酵液為提取原料，原料成本高；采用超濾及制備液相，對儀器設(shè)備要求高；流動相為乙腈，具有較強的揮發(fā)性且具有中等毒性。

方案2：制備量小，不適合工業(yè)化生產(chǎn)。

方案3：浸提溶劑采用有機溶劑，進一步純化時必須去除額外添加的有機溶劑；利用高效液相色譜法(HPLC法)雖然能純化得到高純度的麥角硫因，但成本高，制備量小，僅能得毫克級產(chǎn)品，只限于實驗室研究應(yīng)用。

方案4：利用高效液相色譜法(HPLC法)雖然能純化得到高純度的麥角硫因，但成本高，制備量小，僅能得毫克級產(chǎn)品，只限于實驗室研究應(yīng)用。

方案5：浸提添加化學試劑，進一步純化時必須去除額外添加的試劑；且獲得的麥角硫因含量低。

我國是食用菌生產(chǎn)大國，位居世界之首，占全球總產(chǎn)量的70％以上。隨著人們對食用菌消費量的提高，食用菌的產(chǎn)銷量逐年上升。食用菌在采收和加工過程中，產(chǎn)生大量的菌柄、菌蓋、畸形菇、劣質(zhì)菇等下腳料。目前少數(shù)以低價進入市場或烤制成干菇，多數(shù)未經(jīng)處理而直接丟棄，而靠于基部的菌根由于其雜質(zhì)多，口感差被切下來直接被當作垃圾扔掉。一方面造成資源浪費，同時又污染環(huán)境。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，提供一種操作簡便、適合規(guī)?；a(chǎn)的麥角硫因制備方法。本發(fā)明制備的麥角硫因含量為50％～60％。

本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)：

一種利用蘑菇下腳料制備天然麥角硫因的方法，步驟如下：

(1)原料前處理：以蘑菇下腳料為原料，粉碎，待投料；

(2)提?。和读?，將蘑菇下腳料均勻分散，加入蘑菇下腳料(濕重)5～20倍的水，經(jīng)加熱回流提取或超聲輔助提取后，冷卻靜置，離心分離，取得上清液即為麥角硫因粗提液；對于多次提取的，合并浸提后的麥角硫因粗提液；

(3)濃縮：將提取液濃縮至原來體積的1/6～1/10，靜置，取上清液進一步純化；

(4)純化：采用柱層析法對步驟(3)獲得的上清液進行純化，以非極性大孔吸附樹脂為填料，上柱，先用純水洗脫至中性，再用氨水洗脫，收集洗脫液；

(5)濃縮，干燥，即得麥角硫因提取物。

作為優(yōu)選，所述步驟(2)中加熱回流提取溫度為95℃～100℃，提取時間為1～2h，提取次數(shù)2次；

作為優(yōu)選，所述步驟(2)中超聲輔助提取溫度40℃～70℃，超聲功率400～600W，提取時間20～60min，提取次數(shù)2～3次；

作為優(yōu)選，步驟(3)和步驟(5)中濃縮方法是減壓濃縮；

作為優(yōu)選，步驟(4)中柱層析填料采用HPD-100、HPD-300、D-101、H103等非極性大孔吸附樹脂；

作為優(yōu)選，步驟(4)中氨水濃度為0.8～1.5mol/L；

作為優(yōu)選，步驟(5)中干燥方法是冷凍干燥或噴霧干燥。

麥角硫因的檢測方法：

高效液相色譜法(HPLC)，色譜柱：Kromasil 100-5NH₂分析柱(250mm×4.60mm,5μm)；流動相：乙腈-5mmol/L醋酸銨(80:20)；流速：1.0mL/min；檢測波長：254nm；柱溫：30℃；進樣量：20μL。麥角硫因?qū)φ掌芳耙员景l(fā)明方法制備的麥角硫因提取物HPLC色譜圖如圖2所示。

本發(fā)明的優(yōu)勢在于：

(1)本發(fā)明以蘑菇下腳料為原料，原料來源廣，成本低廉，同時能夠緩解蘑菇種植及加工過程中產(chǎn)生大量廢棄物污染環(huán)境等問題；

(2)以純化水為提取溶劑，無需額外去除提取溶劑，操作簡便；

(3)采用大孔樹脂對麥角硫因粗提液進行純化，成本低廉，對設(shè)備要求低，且制備量大，適合工業(yè)化生產(chǎn)。

附圖說明

圖1是利用蘑菇下腳料制備麥角硫因的工藝流程圖

圖2是麥角硫因標準品(A)和麥角硫因提取物樣品(B)的HPLC圖譜。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明的實施方案作詳細的說明。應(yīng)當理解，本發(fā)明的實施并不局限于下面的實施例，對本發(fā)明所做的任何形式上的變通和/或改變都將落入本發(fā)明的保護范圍。

本發(fā)明實施例采用如下技術(shù)，如圖1所示：

(1)原料前處理：以蘑菇下腳料為原料，粉碎，待投料。

(2)提?。和读?，將蘑菇下腳料均勻分散，加入蘑菇下腳料(濕重)5～20倍的水，經(jīng)加熱回流提取或超聲輔助提取后，冷卻靜置，離心分離，取得上清液即為麥角硫因粗提液；對于多次提取的，合并浸提后的麥角硫因粗提液。

(3)濃縮：將提取液濃縮至原來體積的1/6～1/10，靜置，取上清液進一步純化。

(4)純化：采用柱層析法對步驟(3)獲得的上清液進行純化，以非極性大孔吸附樹脂為填料，上柱，先用純水洗脫至中性，再用氨水洗脫，收集洗脫液。

(5)濃縮，干燥，即得麥角硫因提取物。

所述步驟(2)中加熱回流提取溫度為95℃～100℃，提取時間為1.5～2h，提取次數(shù)2次；或超聲輔助提取溫度40℃～70℃，超聲功率400～600W，提取時間30～60min，提取次數(shù)2～3次；步驟(3)和步驟(5)中濃縮方法是減壓濃縮；步驟(4)中柱層析填料采用HPD-100、HPD-300、D-101、H103等非極性大孔吸附樹脂；氨水濃度為0.8～1.5mol/L；步驟(5)中干燥方法是冷凍干燥或噴霧干燥。

實施例1：

平菇下腳料500g，粉碎，加純化水10L，95℃加熱回流提取2h，靜置冷卻，離心得一次提取液；取沉淀，加純化水5L，95℃加熱回流提取，提取時間1h，靜置冷卻，離心得二次提取液，合并提取液。采用減壓濃縮法將提取液濃縮至原來的1/6，冷卻靜置，上清液上HPD-300大孔吸附樹脂，先以純水洗脫至中性，再以1.2mol/L氨水洗脫，收集濾液，減壓濃縮，冷凍干燥得麥角硫因提取物，取樣檢測。

實驗結(jié)果：

實施例2：

金針菇下腳料5kg，粉碎，加純化水50L，98℃加熱回流提取，提取時間2h，靜置冷卻，離心得一次提取液；取沉淀，加純化水40L，98℃加熱回流提取，提取時間1.5h，靜置冷卻，離心得二次提取液，合并提取液。采用減壓濃縮法將提取液濃縮至原來的1/8，冷卻靜置，上清液上PD-100大孔吸附樹脂，先以純水洗脫至中性，再以1.5mol/L氨水洗脫，收集濾液，減壓濃縮，冷凍干燥得麥角硫因提取物，取樣檢測。

實驗結(jié)果：

實施例3：

雙孢菇下腳料300Kg，粉碎，加8倍純化水，100℃加熱回流提取2h，靜置冷卻，離心得一次提取液。取沉淀，加6倍純化水，100℃加熱回流提取2h，靜置冷卻，離心得二次提取液，合并提取液。采用減壓濃縮法將提取液濃縮至原來的1/10，冷卻靜置，上清液上D-101大孔吸附樹脂，先以純水洗脫至中性，再以0.8mol/L氨水洗脫，收集濾液，減壓濃縮，噴霧干燥得麥角硫因提取物，取樣檢測。

實驗結(jié)果：

實施例4：

平菇下腳料500g，粉碎，加4L純化水，超聲輔助提取，提取溫度50℃，超聲功率500W，提取時間為40min，靜置冷卻，離心得一次提取液；取沉淀，加3L純化水，超聲輔助提取，提取溫度50℃，超聲功率500W，提取時間為30min，靜置冷卻，離心得二次提取液，合并提取液。采用減壓濃縮法將提取液濃縮至原來的1/6，冷卻靜置，上清液上D-101大孔吸附樹脂，先以純水洗脫至中性，再以1.0mol/L氨水洗脫，收集濾液，減壓濃縮，冷凍干燥得麥角硫因提取物，取樣檢測。

實驗結(jié)果：

實施例5：

雙孢菇下腳料5kg，粉碎，加50L純化水，超聲輔助提取，提取溫度70℃，超聲功率400W，提取時間為30min，靜置冷卻，離心得一次提取液；取沉淀，加40L純化水，超聲輔助提取，提取溫度60℃，超聲功率400W，提取時間為30min，靜置冷卻，離心得二次提取液；取沉淀，加30L純化水，超聲輔助提取，提取溫度60℃，超聲功率400W，提取時間為20min，靜置冷卻，離心得三次提取液，合并提取液。采用減壓濃縮法將提取液濃縮至原來的1/8，冷卻靜置，上清液上H103大孔吸附樹脂，先以純水洗脫至中性，再以1.5mol/L氨水洗脫，收集濾液，減壓濃縮，噴霧干燥得麥角硫因提取物，取樣檢測。實驗結(jié)果：

實施例6：

金針菇下腳料500kg，粉碎，加4000L純化水，超聲輔助提取，提取溫度40℃，超聲功率600W，提取時間為60min，靜置冷卻，離心得一次提取液；取沉淀，加3000L純化水，超聲輔助提取，提取溫度40℃，超聲功率500W，提取時間為30min，靜置冷卻，離心得二次提取液，合并提取液。采用減壓濃縮法將提取液濃縮至原來的1/10，冷卻靜置，上清液上HPD-100大孔吸附樹脂，先以純水洗脫至中性，再以0.8mol/L氨水洗脫，收集濾液，減壓濃縮，噴霧干燥得麥角硫因提取物，取樣檢測。

實驗結(jié)果：