本發(fā)明涉及花生光敏色素AhphyB及其表達(dá)基因與應(yīng)用，屬于基因工程
技術(shù)領(lǐng)域：
。
背景技術(shù)：
：花生是我國重要的油料作物?；ㄉa(chǎn)對保障我國糧油安全具有重大意義。然而，我國花生生產(chǎn)、出口、加工面臨著黃曲霉毒素污染超標(biāo)、油脂品質(zhì)低等問題，已經(jīng)嚴(yán)重影響了我國花生在國際市場上的競爭優(yōu)勢。目前，花生重要農(nóng)藝性狀形成的分子機(jī)理研究較少，花生的分子生物學(xué)技術(shù)也遠(yuǎn)落后于其他農(nóng)作物，以現(xiàn)有的品種資源和常規(guī)育種技術(shù)對花生品種進(jìn)行改良很難突破目前存在的問題。因此，加快花生分子生物學(xué)研究進(jìn)程，揭示花生產(chǎn)量、品質(zhì)形成的分子機(jī)理，對利用現(xiàn)代生物技術(shù)手段結(jié)合傳統(tǒng)育種方式培育花生高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)和抗病品種具有重要意義。莢果是花生的收獲器官，其正常生長發(fā)育直接影響到花生種子的產(chǎn)量和品質(zhì)?；ㄉ那v果發(fā)育有其特殊性，即花的形成以及受粉是在地上完成的，受精卵在地上經(jīng)過少數(shù)幾次分裂便停止進(jìn)一步發(fā)育，但子房卻不斷伸長，并向地生長。伸長的子房形成針狀結(jié)構(gòu)，稱為“果針”。隨著果針的生長，位于果針頂端的胚珠被推入土中，在黑暗條件下胚胎恢復(fù)發(fā)育形成莢果。如果人為的阻止花生果針入土，那么果針在光照條件下不能膨大形成莢果。可見，光在花生莢果發(fā)育中起著非常關(guān)鍵的作用。植物中光敏色素以兩種形態(tài)存在，在紅光下，以具有生物活性的遠(yuǎn)紅光吸收態(tài)(Pfr)存在，Pfr能夠被黑暗緩慢地誘導(dǎo)或者吸收遠(yuǎn)紅光后迅速轉(zhuǎn)化成失活的紅光吸收態(tài)(Pr)(Fankhauser,2001)。接受紅光信號后，Pfr形式的光敏色素轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中，與核內(nèi)的其它蛋白質(zhì)相互作用，如光敏色素相互作用因子(phytochrome-interactingfactors,PIFs)等，從而調(diào)控光形態(tài)建成，如種子萌發(fā)、幼苗去黃化、避蔭反應(yīng)、光周期開花和育性等(Quail,2002；Rockwelletal.,2006；Kevieetal.,2007；FranklinandQuail,2010)。光敏色素的作用模式有3種：即低輻照度響應(yīng)(low-fluenceresponses,LFRs)、極低輻照度響應(yīng)(very-low-fluenceresponses,VLFRs)和高輻照度響應(yīng)(highirradianceresponses,HIR)。研究表明，在高輻照度反應(yīng)中，透射光和反射光在紅光范圍的加強(qiáng)能夠引起phyB信號通路的增強(qiáng)，導(dǎo)致各種延長生長的抑制以對抗避蔭反應(yīng)的發(fā)生。在高R:FR比率條件下，對于避蔭反應(yīng)的抑制作用主要是由phyB調(diào)控的。中國專利文獻(xiàn)CN103232534A(申請?zhí)?01310147865.6)公開了花生光敏色素AhphyA編碼基因及其應(yīng)用。一種花生光敏色素AhphyA，氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。本發(fā)明還提供了編碼該光敏色素AhphyA的基因及應(yīng)用。該文獻(xiàn)所述光敏色素基因phyA在遠(yuǎn)紅光下對種子萌發(fā)、去黃化和下胚軸伸長抑制方面起非常重要的作用。但本領(lǐng)域技術(shù)人員均知道，花生莢果發(fā)育是一個(gè)復(fù)雜的生物學(xué)過程，除可能受到光敏色素phyA的調(diào)控外，還受到很多其他方面如光敏色素phyB的調(diào)控。對花生光敏色素phyB的克隆鑒定，可以進(jìn)一步闡明光影響花生莢果發(fā)育的分子機(jī)理，本研究為利用生物技術(shù)降低玉米花生間作條件下花生對避蔭反應(yīng)的響應(yīng)，從而提高花生產(chǎn)量提供技術(shù)支撐。而目前由于花生莢果發(fā)育的特殊性，導(dǎo)致該研究無法借鑒相關(guān)成熟模型植物如擬南芥等，這也是該研究的主要技術(shù)難點(diǎn)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供花生光敏色素AhphyB及其表達(dá)基因與應(yīng)用。本發(fā)明技術(shù)方案如下：一種花生光敏色素AhphyB，氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。花生光敏色素AhphyB為花生中的光信號受體。編碼花生光敏色素AhphyB的表達(dá)基因AhphyB，核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。一種重組載體，插入了核苷酸序列如SEQIDNO.2所示的表達(dá)基因AhphyB。上述載體可購買市售的載體，經(jīng)過常規(guī)手段，將目的基因SEQIDNO.2導(dǎo)入載體，即可獲得含有SEQIDNO.2所示核苷酸序列的載體。一種重組細(xì)胞，含有上述表達(dá)基因AhphyB或上述重組載體。上述表達(dá)基因AhphyB、重組載體和/或重組細(xì)胞在改良花生或其他經(jīng)濟(jì)作物中的應(yīng)用。有益效果本發(fā)明首次公開了調(diào)控高輻照度反應(yīng)的花生光敏色素AhphyB及其編碼基因，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，透射光和反射光在紅光范圍的加強(qiáng)能夠引起phyB信號通路的增強(qiáng)，導(dǎo)致各種延長生長的抑制以對抗避蔭反應(yīng)的發(fā)生。在高R:FR比率條件下，對于避蔭反應(yīng)的抑制作用主要是由phyB調(diào)控的，從而為闡明光調(diào)控花生莢果發(fā)育的分子機(jī)理提供了重要的理論依據(jù)，并且為在玉米、花生間作模式下培育高產(chǎn)花生新品種提供了技術(shù)支撐。附圖說明圖1編碼花生光敏色素AhphyB的表達(dá)基因AhphyB在不同組織中的表達(dá)量柱狀圖；其中：1、幼根，2、幼莖，3、幼葉，4、成年莖，5、成年葉，6、花，7、果針入土0天，8、果針入土3天，9、果針入土9天，10、種子；圖2AhphyB正義表達(dá)載體構(gòu)建過程示意圖；圖3擬南芥下胚軸在黑暗、紅光、遠(yuǎn)紅光、白光的光質(zhì)條件下處理后的檢測結(jié)果照片；圖4擬南芥下胚軸在黑暗、紅光、遠(yuǎn)紅光、白光的光質(zhì)條件下處理后的檢測結(jié)果柱狀圖；具體實(shí)施方式下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步闡述，但本發(fā)明所保護(hù)范圍不限于此。以下實(shí)驗(yàn)步驟及涉及的培養(yǎng)基均為本領(lǐng)域常規(guī)培養(yǎng)基，試劑均為市售產(chǎn)品。實(shí)施例1：花生光敏色素基因phyB的克隆通過分析花生果針和莢果發(fā)育早期轉(zhuǎn)錄組高通量測序的信息，將短片段拼接成較長的基因片段，獲得Uni-EST，通過5’和3’Race獲得phyB基因全長開放讀碼框(ORF)。該基因長度3456bp，核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，編碼產(chǎn)物花生光敏色素phyB，有1151個(gè)氨基酸殘基，氨基酸序列如SEQIDNO.1所示?；ㄉ饷羯豴hyB主要由兩個(gè)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成：一個(gè)是分子量為69kDa位于N末端的光感受區(qū)域，另一個(gè)是57kDa的C末端光調(diào)節(jié)區(qū)域。光感受區(qū)域和光調(diào)節(jié)區(qū)域通過鉸鏈區(qū)連接在一起。光感受區(qū)域包括后色膽素裂解酶亞結(jié)構(gòu)域(bilinlyasedomain,BLD)和光敏色素亞結(jié)構(gòu)域(phytochromedomain,PHY)。光調(diào)節(jié)區(qū)域含有2個(gè)PAS(Per/Arnt/Sim)同源重復(fù)序列組成的PRD結(jié)構(gòu)域和1個(gè)組氨酸激酶類作用區(qū)(histidinekinaserelateddomain,HKRD)，這一結(jié)構(gòu)在光信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮著重要作用?；蚩寺〉木唧w步驟如下：1.1植物中RNA的提取(1)參照CTAB-LiCl法，稱取0.2g新鮮花生葉片組織或-70℃保存的樣品，在液氮中充分研磨至粉末狀，研磨中不斷緩慢加入液氮，防止材料解凍；(2)將研好的組織迅速轉(zhuǎn)移至預(yù)熱至65℃的含有600微升CTAB提取液的EP管中，立即劇烈渦旋振蕩30s,使其混勻；(3)65℃水浴2～5min，期間劇烈渦旋振蕩3～5次；(4)稍微冷卻后加入等體積氯仿/異戊醇渦旋振蕩1min混勻；4℃，12000rpm離心15min；(5)將上清轉(zhuǎn)移到一新的Ep管中，加入2μlDNaseI，37℃水浴15min；(6)在加入等體積的氯仿/異戊醇渦旋振蕩1min，混勻，4℃，12000rpm離心15min；(7)將上清轉(zhuǎn)移到新的Ep管中，加1/3體積的8MLiCl，使其終濃度為2M，4℃過夜；(8)4℃，12000rpm離心20min，棄上清；分別用70％乙醇，無水乙醇洗沉淀，晾干，加30～50μlDEPC-H2O，溶解沉淀。1.2RNA的純化(1)在微量離心管中反應(yīng)37℃反應(yīng)1h；(2)加入350μlDEPC-H2O；(3)加入等量(400μl)的苯酚/氯仿/異戊醇(體積比25:24:1)，充分混勻；(4)離心，取上層水相到新離心管中；(5)加入等量(400μl)的氯仿，充分混勻；(6)離心取上清(水相)到新的離心管；(7)加入1/10體積(40μl)的3MNaOAC(pH5.2)；(8)加入2.5倍(1ml)的冷無水乙醇(或1倍體積的異丙醇)，-20℃過夜；(9)離心回收沉淀，用70％的乙醇清洗，干燥；(10)溶解，電泳。1.3反轉(zhuǎn)錄PCR在0.5mlEP管中加入以下試劑，混勻，離心：TotalRNA5μg以下OligadTprimer(50μM)1μldNTPMixture(10mMeach)1μlRNasefreewaterupto10μl(1)PCR儀上65℃，反應(yīng)5min，轉(zhuǎn)移到冰上。(2)在上述管中加入下列試劑配制反應(yīng)體系：上述變性后反應(yīng)液10μl5×PrimeScriptⅡbuffer4μlRNaseinhibitor(40U/μl)0.5μlPrimeScriptⅡRTase(200U/μl)1μlRNasefreewater4.5μl(4)混勻，PCR儀上，按42℃60min，95℃5min，冰上冷卻。(5)反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物直接用于后續(xù)試驗(yàn)，或-20℃保存。1.4PCR擴(kuò)增反應(yīng)和產(chǎn)物回收置PCR儀上按以下程序進(jìn)行擴(kuò)增：94℃預(yù)變性3min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸4min，30個(gè)循環(huán)；72℃終延伸10min。PCR反應(yīng)結(jié)束后，取20μLPCR反應(yīng)液進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，回收目的條帶，于-20℃保存。實(shí)施例2：花生光敏色素基因AhphyB在不同組織中的表達(dá)模式分析2.1植物中RNA的提取同實(shí)施例1中的1.1步驟2.2單鏈cDNA的獲得及表達(dá)模式分析以花生的幼根(15d)、幼莖(15d)、幼葉(15d)、成年莖(45d)、成年葉(45d)、花、果針入土0d，3d，9d以及種子的RNA為材料，利用PrimeScriptTM1stStrandcDNASynthesisKit(TaKaRa)試劑盒反轉(zhuǎn)錄成單鏈cDNA，用于之后的qRT-PCR。以Actin為體系內(nèi)標(biāo)，引物序列為：T63(F):5’-GCCCAACTAGCGAGTCGAAC-3’T63(R):5’-CAGAACCCAGAAGGCTCTCC-3’用于花生光敏色素基因AhphyB熒光定量的引物為：AhphyBqF：5’-CTTCAGCAAGCGGAGCAACAAAC-3’AhphyBqR：5’-CGTCTTCTGTGTACTGCGCTATG-3’熒光定量PCR反應(yīng)條件為：95℃10min；之后95℃15s，60℃1min，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。結(jié)果顯示：AhphyB在花生的根、莖、葉、花、果針和種子中均有表達(dá)，在入土9d的果針中表達(dá)量最高，成年葉中次之，幼年根、成年莖和種子中表達(dá)量最低，結(jié)果如圖1所示。實(shí)施例3：花生光敏色素基因AhphyB正義表達(dá)載體pROKⅡ-AhphyB的構(gòu)建花生光敏色素基因AhphyB正義表達(dá)載體pROKⅡ-AhphyB的構(gòu)建過程如圖2所示：3.1以限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和限制性內(nèi)切酶SacⅠ分別雙酶切質(zhì)粒pROKⅡ、質(zhì)粒pMD18-T-AhphyB，37℃酶切4h，限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、限制性內(nèi)切酶SacⅠ對質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切體系如下：3.2電泳后分別切取11kb的pROKⅡ質(zhì)粒和3456bp的AhphyB片段，用博大泰克公司的B型小量DNA片段快速膠回收試劑盒進(jìn)行回收，具體步驟如下：(1)將凝膠放在紫外燈下用干凈的刀片將條帶切下，裝入滅菌的離心管中，稱取膠的重量，每個(gè)管中膠的重量不能超過300mg；(2)按100mg膠加300μl溶膠液的比例，室溫溶膠(或50℃溶膠)，其間搖動(dòng)；裝柱，9000rpm，離心30s，去掉廢液；(3)500μl漂洗液漂洗，12000rpm離心30s，重復(fù)漂洗一次，倒掉廢液以后，再于12000rpm離心2min；(4)將柱子放入一新的1.5ml離心管中，在柱子膜中央加入合適體積的洗脫緩沖液(30～50μl)，室溫放置2～5min，12000rpm離心1min，離心管中的液體即為回收的DNA片段，其中質(zhì)粒pROKⅡ回收的DNA片段為pROKⅡ片段、質(zhì)粒pMD18-T-AhphyB回收的DNA片段為花生光敏色素基因AhphyB片段。3.3將兩個(gè)回收片段用T4連接酶連接，構(gòu)建成花生光敏色素基因AhphyB正義表達(dá)載體pROKⅡ-AhphyB。連接體系如下：將上述反應(yīng)物混勻，16℃反應(yīng)過夜，制得正義表達(dá)載體pROKⅡ-AhphyB，用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。3.4大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備(1)挑取E.coilDH5α(購自天根生化科技有限公司)單菌落接種到約5ml的LB液體培養(yǎng)基中，于37℃，250rpm震蕩培養(yǎng)過夜；LB液體培養(yǎng)基組分如下：稱取10g胰蛋白胨(Typtone)，5g酵母提取物(Yeastextract)，5gNaCl，用1MNaOH調(diào)pH值約7.0，加雙蒸水定容至1000mL，121℃滅菌20min；(2)次日將菌液以1％的接種量轉(zhuǎn)移至100ml的LB液體培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)至吸光度OD600＝0.4；(3)將菌液冰浴10min，在無菌條件下轉(zhuǎn)移至預(yù)先冰冷的50ml離心管中，4℃，5000rpm離心10min，收集菌體；(4)重懸于10ml預(yù)冷的0.1M的CaCl2中，冰浴10min，4℃，5000rpm離心10min，收集菌體；(5)重懸于2ml(含15％甘油)預(yù)冷的0.1M的CaCl2中，分裝成100μl/管，-70℃保存?zhèn)溆谩?.5轉(zhuǎn)化(1)從-70℃冰箱取出大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞置于冰上溶解；(2)將表達(dá)載體pROKⅡ-AhphyB5μl加至感受態(tài)細(xì)胞中，充分混勻，冰上放置30min；(3)42℃熱激90s，在此過程中不要晃動(dòng)離心管；(4)熱激完畢后，立即取出放于冰上2min；(5)加入890μl的LB液體培養(yǎng)基，37℃，200rpm孵育1h；(6)將菌液涂布在加卡那酶素的LB固體平板上，37℃培養(yǎng)12h；(7)將平板放入4℃保存。3.6陽性克隆的菌液PCR檢測(1)從平板上挑取白色菌落接種到LB液體培養(yǎng)基中，37℃，250rpm震蕩培養(yǎng)3～4h；(2)PCR反應(yīng)體系：Taq酶緩沖液(含有Mg2+)2.5μl，dNTP(2.5mM)1μl，AhphyB-OX-F引物、AhphyB-OX-R引物(10μM)各1μl，菌液2μl，Taq酶(博大泰克公司產(chǎn))0.3μl，加滅菌雙蒸水至25μl；上述引物序列如下：AhphyB-OX-F：5’-CCCGGATCCATGGCTTCAGCAAGCGG-3’；AhphyB-OX-R：5’-GCCGAGCTCCTAGTTAACGATTTTAGAGTAAG-3’；(3)PCR反應(yīng)程序：98℃10min，94℃45s，51℃45s，72℃1.5min，34循環(huán)，72℃10min，4℃保存；取10μl進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測到一條3456bp的條帶；3.7質(zhì)粒的提取(1)將PCR陽性的菌液于37℃，200rpm震蕩培養(yǎng)過夜；(2)將菌液轉(zhuǎn)移到離心管中，室溫10000rpm離心1min，收集菌體；(3)棄上清液，將離心管倒扣在吸水紙上，使殘余的液體流出；(4)加入100μl預(yù)冷的溶液Ⅰ，在渦旋振蕩器上劇烈震蕩重懸菌體，其中所述溶液Ⅰ配方為：50mM葡萄糖、25mMTris-HCl(pH8.0)、10mMEDTA(pH8.0)；(5)加入200μl新鮮配制的溶液Ⅱ，快速顛倒混勻10次，冰浴5min，其中所述溶液Ⅱ配方為：0.2MNaOH、1％十二烷基硫酸鈉(SDS)；(6)加入150μl預(yù)冷的溶液Ⅲ，溫和地顛倒10次，冰浴5min，4℃12000rpm離心10min，其中所述溶液Ⅲ配方為：5M乙酸鉀60ml、3M冰乙酸11.5ml、H2O28.5ml、pH5.2；(7)將上清轉(zhuǎn)移到另一干凈的離心管中，加入等體積的酚：氯仿：異戊醇(體積比25:24:1)，反復(fù)混勻，4℃12000rpm離心10min；(8)將上清轉(zhuǎn)移到另一干凈的離心管中，加入等體積的氯仿：異戊醇(體積比24:1)，反復(fù)混勻，4℃12000rpm離心10min；(9)將上清轉(zhuǎn)移到另一干凈的離心管中，加入等體積預(yù)冷(-20℃)的異丙醇，混勻后-20℃沉淀1h，4℃12000rpm離心10min；(10)倒掉上清，加入500μl70％的乙醇洗滌沉淀兩次，空氣中干燥；(11)加入適當(dāng)體積的TE溶液和2μlRNaseA，37℃消化0.5h，制得質(zhì)粒。3.8質(zhì)粒的酶切檢測(1)限制性內(nèi)切酶SmaⅠ、限制性內(nèi)切酶XhoⅠ對質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切體系：(4)37℃酶切2h，取10μl進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測結(jié)果，有一條3456bp的條帶和11kb左右的條帶。3.9序列測定以上步驟中獲得的陽性克隆pROKⅡ-AhphyB進(jìn)行測序驗(yàn)證。實(shí)施例4：pROKⅡ-AhphyB正義植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌4.1農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備(1)挑取單菌落(農(nóng)桿菌GV3101，購自天根生化科技有限公司)接種到約3ml的YEP液體培養(yǎng)基中，于28℃，220rpm震蕩培養(yǎng)至OD600＝0.5；YEP液體培養(yǎng)基組分如下：稱取10g胰蛋白胨，10g酵母提取物，5gNaCl，用1MNaOH調(diào)pH值約7.0，加雙蒸水定容至1000mL，121℃滅菌20min；(2)吸取1.5ml菌液于離心管中，冰浴10min；(3)5000rpm離心30s，棄去上清液；(4)沉淀用1.5ml0.5MNaCl懸浮，冰浴20min；(5)5000rpm離心30s，棄去上清液；(6)每管用100μl20mMCaCl2懸浮，用于轉(zhuǎn)化，-70℃保存?zhèn)溆谩?.2DNA直接轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌(1)50μl農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞中加入pROKⅡ-phyB表達(dá)載體質(zhì)粒DNA0.1～1μg(5～10μl)，之后冰浴30min；(2)放入液氮中1.5min，然后立即放入37℃水浴鍋中水浴5min；(3)取出離心管，加入0.5ml的YEP，于28℃，220rpm震蕩培養(yǎng)3～5h；(4)取出菌液于含有相應(yīng)抗生素的YEP平板上涂板，在培養(yǎng)箱中28℃條件下倒置培養(yǎng)，2d左右菌落可見。4.3重組農(nóng)桿菌鑒定(1)挑取單菌落，接種于含有50mg/L的卡那霉素和50mg/L的利福平的YEP液體培養(yǎng)基中，28℃震蕩培養(yǎng)過夜；(2)菌液PCR鑒定步驟同實(shí)施例3中步驟3.6。實(shí)施例5：農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化擬南芥野生型(1)當(dāng)擬南芥開花，并且許多小的花序開花時(shí)，植物可以用來侵染；(2)搖農(nóng)桿菌過夜；(3)離心5000rpm10min，棄去上清；(4)加入等體積的侵染液(含5％蔗糖，0.02％silwet)重懸；(5)花序在農(nóng)桿菌中浸染45s；(6)弱光培養(yǎng)1d；(7)正常培養(yǎng)，收集種子，制得WT/AhphyB擬南芥種子；實(shí)施例6：不同光質(zhì)對擬南芥野生型，phyB-9突變體，WT/AhphyB下胚軸伸長的影響將過量表達(dá)花生光敏色素基因AhphyB的擬南芥純合株系(WT/AhphyB)、phyB突變體(購自美國擬南芥資源中心)以及野生型(Columbia，Col；購自美國擬南芥資源中心)擬南芥種子消毒，均勻鋪撒到1/2MS培養(yǎng)基(含蔗糖和瓊脂)(購自青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司)上，4℃春化3d，21℃光照1h后，分別轉(zhuǎn)移到紅光、遠(yuǎn)紅光、白光和黑暗條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)皿豎直放置，4d后統(tǒng)計(jì)下胚軸長度。使用ImageJ軟件測量擬南芥下胚軸，使用SPSS軟件進(jìn)行顯著性分析。結(jié)果如圖3、圖4所示，對不同光照處理下Col野生型擬南芥，phyB突變體(phyB-m)以及兩個(gè)AhphyB轉(zhuǎn)基因株系的下胚軸長度進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)。結(jié)果表明，黑暗條件下野生型Col和phyB-m下胚軸的長度相似，兩個(gè)過量表達(dá)AhphyB擬南芥株系的下胚軸長度略低于Col與phyB-m；在白光下，phyB-m的下胚軸長度顯著長于Col及兩個(gè)過量表達(dá)AhphyB轉(zhuǎn)基因株系的下胚軸。在紅光下，phyB-m的下胚軸長度顯著長于Col及兩個(gè)轉(zhuǎn)基因株系的下胚軸長度，同時(shí)略低于其在黑暗條件下的下胚軸長度，過量表達(dá)AhphyB的兩個(gè)擬南芥株系下胚軸長度在紅光下均顯著低于Col與phyB-m的下胚軸長度。這一結(jié)果說明與擬南芥phyB相似，在紅光和白光條件下，花生phyB也具有抑制下胚軸伸長的功能。前人研究發(fā)現(xiàn)，過量表達(dá)phyB能夠抑制幼苗在遠(yuǎn)紅光下的去黃化表型。phyB突變體的下胚軸在遠(yuǎn)紅光下比Col的下胚軸更短且達(dá)到顯著水平，但過量表達(dá)AhphyB的兩個(gè)轉(zhuǎn)基因株系并未在此條件下表現(xiàn)出更長的下胚軸表型。這一結(jié)果說明，AhphyB在響應(yīng)FR介導(dǎo)的幼苗去黃化過程中的功能可能與AtphyB不同。SEQUENCELISTING<110>山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心<120>花生光敏色素AhphyB及其表達(dá)基因與應(yīng)用<160>2<170>PatentInversion3.5<210>1<211>1151<212>PRT<213>ArachishypogaeaLinn.<400>1MetAlaSerAlaSerGlyAlaThrAsnArgValProHisHisGlnHis151015GlnAsnGlnHisGlnGlnGlnGlnGlnGlnGlnHisProThrAlaSer202530SerSerLysArgThrValValHisAsnThrAsnAspAlaSerIleSer354045LysAlaIleAlaGlnTyrThrGluAspAlaArgLeuHisAlaValPhe505560GluGlnSerGlyGluSerGlyLysSerPheAspTyrSerHisSerVal65707580ArgHisThrSerGluSerValProGluHisGlnIleIleAlaTyrLeu859095LeuLysIleGlnArgGlyGlyLeuIleGlnProPheGlyCysMetIle100105110AlaValAspGluProSerPheArgIleLeuGlyTyrSerGluAsnAla115120125ArgAspMetLeuGlyIleSerProGlnSerValProThrLeuGluArg130135140LeuProGlySerHisGluGluAlaLeuThrIleGlyThrAspValArg145150155160SerLeuPheThrAlaSerSerSerThrLeuLeuGluArgAlaPheGly165170175AlaArgGluIleThrLeuLeuAsnProIleTrpIleHisSerArgAsn180185190SerGlyLysProPheTyrGlyIleLeuHisArgIleAspValGlyIle195200205ValIleAspLeuGluProAlaArgThrGluAspProAlaLeuSerIle210215220AlaGlyAlaValGlnSerGlnLysLeuAlaValArgAlaIleSerGln225230235240LeuGlnSerLeuProGlyGlyAspValLysLeuLeuCysAspThrVal245250255ValGluSerValGlyGluLeuThrGlyTyrAspArgValMetValTyr260265270LysLeuHisGluAspGluHisGlyGluValValAlaGluSerLysArg275280285ProAspLeuGluProTyrIleGlyLeuHisTyrProAlaThrAspIle290295300ProGlnAlaSerArgPheLeuPheLysGlnAsnArgValArgMetIle305310315320ValAspCysAsnAlaSerProLeuArgValValGlnAspGluAlaLeu325330335ValGlnProLeuCysLeuValGlySerThrLeuArgAlaProHisGly340345350CysHisAlaGlnTyrMetAlaAsnMetGlySerIleAlaSerLeuVal355360365MetAlaValIleIleAsnAlaAsnAspGluGluAlaValGlyGlyArg370375380SerSerMetArgLeuTrpGlyLeuValValCysHisHisThrSerAla385390395400ArgCysIleProPheProLeuArgTyrAlaCysGluPheLeuMetGln405410415AlaPheGlyLeuGlnLeuAsnMetGluLeuGlnLeuAlaSerGlnSer420425430LeuGluLysArgValLeuArgThrGlnThrLeuLeuCysAspMetLeu435440445LeuArgAspSerProThrGlyIleValThrGlnSerProSerIleMet450455460AspLeuValArgCysAspGlyAlaAlaLeuTyrTyrLysGlyAsnTyr465470475480TyrProLeuGlyValThrProThrGluSerGlnIleArgAspIleIle485490495GluTrpLeuLeuAlaTyrHisGlyAspSerThrGlyLeuSerThrAsp500505510SerLeuGlyAspAlaGlyTyrProGlyAlaAlaSerLeuGlyAspAla515520525ValCysGlyMetAlaValAlaTyrIleThrGluGlyAspPheLeuPhe530535540TrpPheArgSerHisThrAlaLysGluIleLysTrpGlyGlyAlaLys545550555560HisHisProGluAspLysAspAspGlyGlnArgMetHisProArgSer565570575SerPheLysAlaPheLeuGluValValLysSerArgSerLeuProTrp580585590AspAsnAlaGluMetAspAlaIleHisSerLeuGlnLeuIleLeuArg595600605AspSerPheArgAspAlaGluHisSerAsnSerLysAlaValMetHis610615620SerHisLeuAlaAspPheGluLeuGlnGlyValAspGluLeuSerSer625630635640ValAlaArgGluMetValArgLeuIleGluThrAlaThrAlaProIle645650655PheAlaValAspValAspGlyArgIleAsnGlyTrpAsnAlaLysVal660665670AlaGluLeuThrGlyLeuProValAspGluAlaMetGlyLysSerLeu675680685ValHisAspLeuValTyrLysGluPheGluGluThrValAspLysLeu690695700LeuSerArgAlaLeuArgGlyGluGluAspLysAsnValGluIleLys705710715720LeuLysThrPheGlyProGlyAsnGlnAsnGlyAlaValPheValVal725730735ValAsnAlaCysSerSerLysAspTyrThrAsnAsnIleValGlyVal740745750CysPheValGlyGlnAspValThrGlyGlnLysValValMetAspLys755760765PheIleAsnIleGlnGlyAspTyrLysAlaIleValHisSerProAsn770775780ProLeuIleProProIlePheAlaSerAspAspAsnThrCysCysLeu785790795800GluTrpAsnAlaAlaMetGluLysLeuThrGlyTrpGlyArgAlaAsp805810815ValIleGlyLysMetLeuValGlyGluValPheGlySerCysCysGln820825830LeuLysGlySerAspAlaLeuThrLysPheMetIleValLeuHisAsn835840845SerLeuGlyGlyGlnAspThrAspLysPheProPheSerPheLeuAsp850855860ArgHisGlyLysTyrValGlnAlaPheLeuThrAlaAsnLysArgVal865870875880AsnMetAspGlyGlnIleIleGlyAlaPheCysPheLeuGlnIleAla885890895SerProAspLeuGlnGlnAlaLeuLysIleGlnLysGlnGlnGluLys900905910AsnCysTyrAlaArgMetLysGluLeuAlaTyrIleCysGlnGluIle915920925LysAsnProLeuSerGlyIleArgPheThrAsnSerLeuLeuGluAla930935940ThrGlyLeuThrAspGluGlnLysGlnPheLeuGluThrSerThrAla945950955960CysGluLysGlnMetSerLysIleIleGlnAspValAspLeuAlaSer965970975IleGluAspGlySerMetGluLeuGluLysGlyGluPheLeuLeuGly980985990AsnValIleAsnAlaValValSerGlnValMetLeuLeuLeuArgGlu99510001005ArgAsnLeuGlnLeuIleArgAspIleProGluGluIleLysThr101010151020LeuAlaValTyrGlyAspGlnLeuArgIleGlnGlnValLeuAla102510301035AspPheLeuLeuAsnMetValArgTyrAlaProSerProAspGly104010451050TrpValGluIleHisValHisProArgIleLysGlnIleSerAsp105510601065GlyLeuThrLeuLeuArgAlaGluPheArgMetValCysProGly107010751080GluGlyValProProGluLeuValGlnAspMetPheHisSerSer108510901095ArgTrpValThrGlnGluGlyLeuGlyLeuSerMetSerArgLys110011051110IleLeuLysLeuMetAsnGlyGluValGlnTyrIleArgGluAla111511201125GluArgCysTyrPhePheValLeuLeuGluLeuProValThrArg113011351140ArgThrTyrSerLysIleValAsn11451150<210>2<211>3456<212>DNA<213>ArachishypogaeaLinn.<400>2atggcttcagcaagcggagcaacaaacagagttccccaccaccaacaccaaaaccaacac60caacagcaacaacaacaacagcaccccacagcatcttcatcaaaacgcactgtcgtacac120aacacgaacgacgcgtcaataagcaaggccatagcgcagtacacagaagacgcccgcctc180cacgccgttttcgagcagtccggcgagtccggcaagtccttcgactactcccactccgtc240cgccacacctccgagtccgtaccggagcaccagatcatcgcttacctactgaagatccag300cgcggcggcctcatccagcctttcggctgtatgattgccgtcgacgagccgtccttccgc360atcctcggatactccgagaacgctcgggacatgctcggcatatcaccgcagtcagtccca420actctcgaacgtctccccggatcccacgaggaggcgctcacaattggtactgacgtgcgc480agtcttttcaccgcctccagcagcaccctgctagagagggcgtttggggcgcgcgagatc540acgctcctcaacccaatttggatccattcccggaattccggcaagcctttttatggaatc600ttgcaccgaatcgatgttggaatcgtcatcgatttggagcctgctaggactgaggaccct660gcactgtcaattgcaggggctgttcagtcccagaagctagctgttcgagctatttcgcag720cttcagtcgcttcccggaggcgatgtgaagcttctttgtgacactgttgtggagagtgtg780ggagaattgaccggttatgatagggtgatggtgtacaaacttcatgaggatgagcatggt840gaggttgttgctgagagtaagaggcctgatttggagccttatattggtttgcattaccct900gctactgatatacctcaggcttcgaggttcttgttcaagcagaatagagttaggatgatt960gtagattgcaatgcttcgccattgagggtggtgcaggatgaggcccttgtgcagcccttg1020tgtttggttggctccaccctgcgtgcaccacacggttgccacgctcagtatatggcgaat1080atggggtcgattgcttcgctggttatggcggttatcatcaatgctaatgatgaggaagct1140gttggcggccgcagctcaatgaggctgtggggattggttgtttgccaccacacttcggcc1200aggtgtataccttttcccttgaggtatgcttgtgaattcttgatgcaggcctttgggctg1260cagctgaatatggagcttcaattggcttctcagtcgttagagaagcgagttttgaggacg1320caaactctgttgtgtgacatgcttcttagggactcgcccactggcattgttactcagagt1380cctagtattatggatttggtgcggtgtgatggagcagctttgtactacaaaggaaactac1440tatccattgggtgtaacacctactgaatctcaaataagggatattatagagtggttgttg1500gcataccatggagattcgacgggtttgagtactgatagtctgggtgatgctgggtatcct1560ggtgctgcctcgcttggggatgctgtttgtgggatggctgttgcatatatcactgaaggg1620gattttcttttctggtttaggtctcacacagcaaaagagatcaaatggggtggtgcaaag1680catcatcctgaggataaggatgatgggcagagaatgcatcctcgttcttcatttaaggca1740tttttggaagtggtgaaaagccggagtttgccatgggataatgcagaaatggatgcgatt1800cactctttgcagcttattctgcgagactcatttagagatgccgagcatagcaactcaaag1860gctgttatgcattcgcatctggcggattttgagttgcaaggggtagatgagctaagttct1920gtggcgagagaaatggtcagattgatagaaactgccactgctcccatattcgctgttgac1980gttgatggccgcataaatgggtggaatgcaaaggttgcagaattgacagggcttccagtc2040gacgaggctatggggaagtcactggttcatgatcttgtgtacaaggagttcgaagaaact2100gtagacaagcttctctctcgcgctctaagaggtgaagaagataagaatgttgagataaaa2160ttgaagacatttggcccaggaaatcaaaatggtgcagtttttgtagtggtgaatgcttgc2220tccagcaaggattatacaaataatatagttggagtatgctttgttggtcaggacgttact2280ggtcagaaggttgtaatggacaaattcatcaacatacaaggtgactacaaggctattgta2340catagcccaaatccattgatccccccaatttttgcatcggatgataacacttgttgctta2400gagtggaatgcagccatggaaaagcttactggttgggggcgtgcagatgtaattggaaag2460atgttggttggagaggttttcggtagttgctgtcagttaaagggctcggatgctttaaca2520aagttcatgattgtgttgcacaattcccttggtggacaagataccgacaagttccctttt2580tcatttcttgaccggcatggaaaatatgtgcaagctttcttgacagcaaataagagggtt2640aacatggatggtcagattattggagctttttgctttttgcaaattgcgagtcctgatctt2700caacaggctctgaaaatacagaagcaacaagagaagaattgctatgctaggatgaaagag2760ttagcctatatttgtcaagaaataaagaatccactgagtggcatacgctttacaaactct2820cttttggaggctactggattgaccgatgaacaaaagcagtttcttgagactagtactgca2880tgtgagaagcaaatgtcaaaaataatacaggatgttgacttggcaagcattgaagatgga2940tcaatggagcttgaaaagggagaattcttgcttggaaacgtcatcaatgctgttgttagc3000caagtaatgttattactaagagagagaaatttacagttgattcgtgatatacctgaagaa3060atcaagacgttggctgtttatggtgatcagttgaggattcaacaagtcttggctgatttc3120ttattgaatatggtgcgctatgcgccttctccagatgggtgggtagagattcatgtacat3180ccaagaataaaacaaatctccgacgggcttactcttctccgtgctgaatttaggatggta3240tgtcctggtgaaggtgttcctcctgaattggttcaagacatgttccatagcagtcgttgg3300gtgactcaagaaggcttaggtctgagcatgagccggaagattctaaagttaatgaatggt3360gaagtccaatatatcagggaggcagaaagatgctatttcttcgttcttcttgaactacct3420gtaacacggagaacttactctaaaatcgttaactag3456當(dāng)前第1頁1 2 3