本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種用于基因治療和疫苗載體的重組腺病毒載體及其構(gòu)建方法。

背景技術(shù)：

腺病毒 （adenovirus, Ad）作為基因表達(dá)載體的研制起始于20世紀(jì)60年代初，當(dāng)時病毒學(xué)家觀察到腺病毒基因組可與猴類病毒 40（SV40）基因組雜交，說明腺病毒基因組可承載異源性基因。此后腺病毒逐步發(fā)展成一種重要的載體系統(tǒng)。

目前，已經(jīng)鑒別了57種不同的腺病毒血清型，重組腺病毒載體在基因治療和疫苗載體方面得到了很多的應(yīng)用，尤其是人血清5型腺病毒，它也是當(dāng)前腫瘤基因治療和人類免疫缺陷病毒（HIV）疫苗的研究的主要病毒載體。另外，諸如乙肝病毒、瘧疾、結(jié)核等病原體的疫苗研制也都十分重視5型腺病毒載體的應(yīng)用。

然而，由于人體內(nèi)普遍存在抗Ad5腺病毒本身的免疫反應(yīng)，這種預(yù)存的免疫反應(yīng)包括抗腺病毒中和抗體和針對腺病毒的殺傷性T細(xì)胞，從而抑制其進(jìn)入機(jī)體細(xì)胞而其所攜帶的目的基因就得不到預(yù)期水平的表達(dá)甚至是完全不表達(dá)，此外具有交叉性的針對腺病毒載體的CTL反應(yīng)會殺死已經(jīng)感染了腺病毒載體的靶細(xì)胞從而阻斷外源基因的持續(xù)表達(dá)?？傊A(yù)存免疫反應(yīng)會大大降低基于腺病毒載體的疫苗免疫或者基因治療的效果。

為了克服預(yù)存免疫反應(yīng)對腺病毒載體的影響，研究者們嘗試了多種方法：（1）利用新方法運(yùn)載重組Ad5載體；（2）從其它人體腺病毒血清型甚至其他動物種屬中開發(fā)新的重組腺病毒載體；（3）對Ad5載體進(jìn)行基因工程改造，這一方法與其他方法相比更安全也更具有應(yīng)用性。該方法具體是以源于人體安全性較好的人體稀有血清型腺病毒如Ad35、Ad48以及Ad49等的抗原決定簇基因替換Ad5載體的相應(yīng)基因以期獲得既保留Ad5載體的免疫原性，又帶有稀有腺病毒亞型血清學(xué)性質(zhì)的嵌合載體。專利CN104419717A公開了一種構(gòu)建重組腺病毒的方法，所述方法包括以其他人腺病毒血清型的 HVR5、7 替換 RAd5 載體的 HVR5、7，其中所述其他人腺病毒血清型是 Ad43 或 Ad37，但該方法存在如下缺陷：（1）其只是替換HVR，不能完全逃避預(yù)存免疫；（2）在制備中使用了至少四個不同公司的載體，價格昂貴，操作不便。

因此，目前在該領(lǐng)域仍然需要通過基因工程技術(shù)進(jìn)一步改造腺病毒載體以獲得一種操作簡便、易于包裝、免疫水平較高且能很好的避免預(yù)存的重組腺病毒載體。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種重組腺病毒載體及其構(gòu)建方法，該重組腺病毒載體能很好的避免針對Ad5載體本身的預(yù)存免疫，同時既保留Ad5載體的強(qiáng)免疫原性，又帶有稀有血清型腺病毒血清學(xué)性質(zhì)，且操作簡便。

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題通過以下技術(shù)方案予以實現(xiàn)：

一種重組腺病毒載體，其是采用分子克隆的方法，將Ad5載體的骨架質(zhì)粒中的整個六鄰體（hexon）用人稀有腺病毒血清型Ad35的六鄰體替換，得到重組腺病毒載體RAd5-35-Hexon-Adbone。

本發(fā)明還提供一種重組腺病毒載體的構(gòu)建方法，包括如下步驟：

（一）中間載體改造，在Puc19載體的限制性酶切位點XbaI和BamHI間引入AscI和NruI，獲得中間載體Puc19-AscI-NruI；

（二）將原始Ad5骨架質(zhì)粒用AscI進(jìn)行單酶切，回收9620bp的片段，同時用AscI單酶切上述Puc19-AscI-NruI，回收2680bp的片段，將上述回收的兩部分片段連接，構(gòu)建質(zhì)粒9620-Puc19-AscI;

（三）質(zhì)粒9620-Puc19-AscI用HindIII單酶切，回收7000bp的片段，同時用HindIII單酶切載體Puc19，回收2680bp的片段，將回收的兩部分片段連接，構(gòu)建質(zhì)粒7000-Puc19-HindIII；

（四）基于質(zhì)粒：7000-Puc19-HindIII，在Ad5骨架質(zhì)粒的Hexon 5’端插入酶切位點ClaI，PCR擴(kuò)增Hexon 5’端A和B兩段，在片段A和B連接處插入單酶切位點ClaI，引物設(shè)計如下：

片段A

上游：5’-TCTAGACTGGTGACGCAAATAGACGA-3’

下游：5’-TCTATCGATGGGGTAGCCATAAGCTT-3’

片段B

上游：5’-TCTAGACCCATCGATGATGCCGCA-3’

下游：5’-CTTGCTCGTCTACTTCGTCTAAGCTT-3’

（五）將片段A和B分別連接至Puc19載體，用ClaI和HindIII雙酶切質(zhì)粒Puc19-A和Puc19-B，分別回收3100bp和500bp的片段，將回收的兩部分片段連接，構(gòu)建質(zhì)粒Puc19-A+B；

（六）用XbaI和HindIII雙酶切質(zhì)粒Puc19-A+B，回收1000bp的片段，同時

用DraIII-HF和RsrII雙酶切質(zhì)粒7000-Puc19-HindIII，回收9800bp的片段，將回收的兩部分片段用天根的EsayGeno快速重組克隆試劑盒連接，即構(gòu)建質(zhì)粒7000-Puc19-ClaI；

（七）PCR擴(kuò)增Ad35hexon，引物設(shè)計如下：

上游：5’-ATGGCCACCCCATCGATGCTGCC-3’

下游：5’-TACGTGGTAGCGTTGCCGGCCGAGA-3’

回收Ad35hexon的2800bp片段；

（八）ClaI和NaeI雙酶切質(zhì)粒7000-Puc19-ClaI，回收7000bp的片段，同時ClaI和NaeI雙酶切PCR回收的Ad35hexon，回收2800bp的片段，將回收的兩部分片段連接，構(gòu)建質(zhì)粒：7000-Puc19-Ad35；

（九）HindIII單酶切7000-Puc19-Ad35，回收7000bp的片段，同時用HindIII單酶切質(zhì)粒9620-Puc19-AscI，回收5400bp的片段，將回收的兩部分片段連接，構(gòu)建質(zhì)粒：9620-Puc19-Ad35；

（十）AscI單酶切原始Ad5骨架質(zhì)粒pBHGlox(delta)E1,3Cre，回收25000bp的片段，同時用AscI單酶切質(zhì)粒9620-Puc19-Ad35，回收9620bp的片段，將回收的兩部分片段連接，構(gòu)建質(zhì)粒：RAd5-35-Hexon-Adbone。

進(jìn)一步地，步驟（一）中改造Puc19載體的步驟包括：

A.酶切：酶切反應(yīng)體系為：2μg Puc19載體、1μL XbaI、1μL BamHI、5μL Cusmart buffer以及適量滅菌水，總體積為50μL；反應(yīng)條件為：37℃，3h，酶切回收2680bp片段。

B.制備上下游的反應(yīng)片段：混合物為：100mmol/L的上游引物、100mmol/L的下游引物以及8μL滅菌水，總體積為10μL，其中上游引物：5’-CTAGATA GGCGCGCCTACCTCGCGAGGAGGCGCGCCTTG-3’；下游引物：5’-GATCC AAGGCGCGCCTCCTCGCGAGGTAGGCGCGCCTAT-3；反應(yīng)程序為：從95℃梯度降溫至4℃，每5min降5℃。

C.構(gòu)建質(zhì)粒Puc19-AscI-NruI：將回收的2680bp片段和上下游的反應(yīng)片段連接，連接體系為：10×buffer 1μL、T4DNA連接酶1μL、回收的2680bp片段 1μL、上下游的反應(yīng)片段5μL以及滅菌水2μL，總體積為10μL。

D. 轉(zhuǎn)化、挑取細(xì)菌克隆并小提質(zhì)粒，獲得載體Puc19-AscI-NruI。

本發(fā)明還提供該重組腺病毒載體用于制備疫苗或基因治療藥物的用途。

本發(fā)明具有如下有益效果

（1）Ad5特異的中和抗體主要針對的是腺病毒六鄰體，且腺病毒的免疫是血清型特異的，使用人體稀有血清型腺病毒六鄰體來替換Ad5，可以逃避Ad5的預(yù)存免疫；而HVR只是六鄰體中的一些小片段，本發(fā)明替換整個六鄰體，相比于替換HVR，能逃避體內(nèi)預(yù)存免疫的幾率更大。

（2）替換六鄰體的難點在于：Ad5載體的骨架質(zhì)粒pBHGlox(delta)E1,3Cre約34kb，基本包括了現(xiàn)有的所以酶切位點，無法通過簡單的酶切完成整個六鄰體的替換；本發(fā)明利用Ad5載體骨架質(zhì)粒上特殊的酶切位點，將含有六鄰體的片段連接至Puc19載體上，減小質(zhì)粒片段，增加了更多的酶切位點，更加方便操作。

（3）本發(fā)明僅僅使用分子克隆的方法通過酶切，連接完成整個載體的構(gòu)建，只使用外源的經(jīng)典克隆載體Puc19，不需要特殊的試劑和其他克隆載體，也不需要特殊的感受態(tài)，方法簡單，可行性強(qiáng)，避免了同源重組等其他的方法操作大片段質(zhì)粒的不確定性。

（4）為了保證能包裝出重組的腺病毒，在替換六鄰體的過程中，六鄰體以外的堿基不發(fā)生突變；本發(fā)明酶切腺病毒骨架質(zhì)粒，將包含hexon的一段連接于Puc19載體上，雖在hexon的5’端插入單酶切位點ClaI，改變了堿基，但編碼的氨基酸并沒有改變，利于病毒的包裝。

（5）本發(fā)明的載體既保留RAd5載體的強(qiáng)免疫原性，又帶有稀有血清型腺病毒血清學(xué)性質(zhì)。

附圖說明：

圖1為重組腺病毒載體結(jié)構(gòu)示意圖；

圖2為嵌合RAd5骨架質(zhì)粒的構(gòu)建流程圖；

圖3為病毒載體包裝示意圖；

圖4為構(gòu)建質(zhì)粒9620-puc19-AscI的鑒定電泳圖，其中泳道1為質(zhì)粒：未酶切9620-puc19-AscI，泳道2為Adbone，泳道3為9620-puc19-AscI正確克隆，泳道4為puc19-AscI，泳道5為Maker；

圖5為構(gòu)建質(zhì)粒7000-puc19-HindIII的鑒定電泳圖，其中泳道1為Maker，泳道2-5分別為不同的7000-puc19-HindIII克隆，泳道2是正確的7000-puc19-HindIII克隆；

圖6為構(gòu)建質(zhì)粒7000-puc19-Ad35的鑒定電泳圖，其中泳道1-6分別為不同的7000-puc19-Ad35克隆，泳道2，4，5有正確條帶，測序均正確，泳道7為Maker；

圖7為構(gòu)建質(zhì)粒9620-puc19-Ad35的鑒定電泳圖，其中泳道1為質(zhì)粒：9620-puc19-Ad35，泳道2為Maker；

圖8為構(gòu)建質(zhì)粒RAd5-35-Hexon-Adbone的鑒定電泳圖，其中泳道1-10分別為質(zhì)粒RAd5-35-Hexon-Adbone的不同克隆，僅泳道6有正確條帶，泳道M為maker，泳道+為 pBHGlox(delta)E1,3Cre質(zhì)粒；

圖9為穿梭質(zhì)粒pDC315-GFP轉(zhuǎn)染細(xì)胞工作效能圖；

圖10為重組腺病毒工作效能圖，其中A: Ad5-35-hexon-Adbone包裝病毒第七天；B: Ad5-35-hexon-Adbone包裝病毒第十六天；C：rAd5重組腺病毒包裝病毒第八天；

圖11為包裝重組腺病毒上清感染293A細(xì)胞圖，其中A．rAd5病毒上清感染293A細(xì)胞第三天；B. Ad5-35-hexon-Adbone病毒上清感染293A細(xì)胞第十天；

圖12為 PCR擴(kuò)增鑒定rAd5-35-hexon-Adbone包裝病毒中的hexon，其中泳道1為PCR擴(kuò)增的Ad35 hexon，泳道2為 maker。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的說明，實施例僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，不是對本發(fā)明的限定。實施例中未注明具體技術(shù)或條件者，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件或者按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。Ad35 hexon 序列：GenBank: AB330116.1

實施例1

RAd5載體和表達(dá)綠色熒光蛋白（GFP）基因的穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建方法，包括

1.嵌合Ad5骨架質(zhì)粒的構(gòu)建

第一步：中間載體改造：在Puc19載體的限制性酶切位點XbaI和BamHI間引入AscI和NruI，獲得中間載體Puc19-AscI-NruI。

A.酶切：酶切反應(yīng)體系為：2μg Puc19載體、1μL XbaI、1μL BamHI、5μL Cusmart buffer以及適量滅菌水，總體積為50μL；反應(yīng)條件為：37℃，3h，酶切回收2680bp片段。

B.制備上下游的反應(yīng)片段：混合物為：100mmol/L的上游引物、100mmol/L的下游引物以及8μL滅菌水，總體積為10μL，其中上游引物：5’-CTAGATA GGCGCGCCTACCTCGCGAGGAGGCGCGCCTTG-3’（SEQ ID NO：1）；下游引物：5’-GATCCAAGGCGCGCCTCCTCGCGAGGTAGGCGCGCCTAT-3’（SEQ ID NO：2）；反應(yīng)程序為：從95℃梯度降溫至4℃，每5min降5℃。

注：下劃線為限制性酶切位點

C.構(gòu)建質(zhì)粒Puc19-AscI-NruI：將回收的2680bp片段和上下游的反應(yīng)片段連接，連接體系為：10×buffer 1μL、T4DNA連接酶1μL、回收的2680bp片段 1μL、上下游的反應(yīng)片段5μL以及滅菌水2μL，總體積為10μL。

D. 轉(zhuǎn)化、挑取細(xì)菌克隆并小提質(zhì)粒，獲得載體Puc19-AscI-NruI。

第二步：病毒載體構(gòu)建：通過多步克隆構(gòu)建載體RAd5-35-Hexon-Adbone，其六鄰體被35型腺病毒六鄰體替換。

A.原始RAd5骨架質(zhì)粒即AdMax系統(tǒng)的pBHGlox(delta)E1,3Cre質(zhì)粒，用AscI單酶切，回收9620bp的片段，同時AscI酶切載體Puc19-AscI-NruI，回收2680bp的片段，將兩部分片段連接，構(gòu)建質(zhì)粒9620-Puc19-AscI；

B.質(zhì)粒9620-Puc19-AscI用HindIII單酶切，回收7000bp的片段，同時HindIII單酶切載體Puc19，回收2680bp的片段，將回收的兩部分片段連接，構(gòu)建質(zhì)粒7000-Puc19-HindIII；

C.基于質(zhì)粒7000-Puc19-HindIII，在RAd5骨架質(zhì)粒的Hexon 5’端插入酶切位點ClaI，PCR擴(kuò)增Hexon 5’端A和B兩段，在片段A和B連接處插入單酶切位點ClaI，引物設(shè)計如下：

片段A

上游：5’-CTGGTGACGCAAATAGACGA-3’ （SEQ ID NO：3）

下游：5’-TCTATCGATGGGGTAGCCAT-3’ （SEQ ID NO：4）

片段B

上游：5’-CCCATCGATGATGCCGCA-3’（SEQ ID NO：5）

下游：5’-CTTGCTCGTCTACTTCGTCT-3’ （SEQ ID NO：6）；

注：下劃線為限制性酶切位點

D. 將片段A連接至Puc19載體，用ClaI和HindIII雙酶切質(zhì)粒Puc19-A，回收3100bp的片段；將片段B連接至Puc19載體，用ClaI和HindIII雙酶切質(zhì)粒Puc19-B，回收500bp的片段；將回收的兩部分片段連接，構(gòu)建質(zhì)粒Puc19-A+B；

E.用XbaI和HindIII酶切質(zhì)粒Puc19-A+B，回收1000bp的片段，同時用DraIII-HF和RsrII酶切質(zhì)粒7000-Puc19-HindIII，回收9800bp的片段，將回收的兩部分片段用天根的EsayGeno快速重組克隆試劑盒連接，即構(gòu)建質(zhì)粒7000-Puc19-ClaI；

F.PCR擴(kuò)增Ad35 hexon，引入單酶切位點ClaI和NaeI，引物設(shè)計如下：

上游：5’-ATGGCCACCCCATCGATGCTGCC-3’ （SEQ ID NO：7）

下游：5’-TACGTGGTAGCGTTGCCGGCCGAGA-3’ （SEQ ID NO：8）

回收Ad35hexon的2800bp片段；

注：下劃線為限制性酶切位點

G.ClaI和NaeI酶切質(zhì)粒7000-Puc19-ClaI，回收7000bp的片段，同時ClaI和NaeI酶切PCR回收的Ad35hexon，回收約2800bp，將回收的兩部分片段連接，構(gòu)建質(zhì)粒7000-Puc19-Ad35；

H.HindIII酶切7000-Puc19-Ad35，回收7000bp的片段，同時用HindIII酶切質(zhì)粒9620-Puc19-AscI，回收5400bp的片段，將回收的兩部分片段連接，構(gòu)建質(zhì)粒9620-Puc19-Ad35；

I. AscI酶切質(zhì)粒pBHGlox(delta)E1,3Cre，回收25000bp的片段，同時用AscI酶切質(zhì)粒9620-Puc19-Ad35，回收9620bp的片段，將回收的兩部分片段連接，構(gòu)建質(zhì)粒RAd5-35-Hexon-Adbone。

第三步：重組腺病毒載體的驗證。由于骨架質(zhì)粒未經(jīng)回收純化，且是單酶切，可能導(dǎo)致骨架質(zhì)粒自連，或者目的片段連接出現(xiàn)反向結(jié)果，需要酶切電泳鑒定片段大小是否正確，同時測序鑒定。

A．電泳實驗：以原始Ad5骨架載體為陽性對照進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。

B. 測序鑒定：將構(gòu)建的質(zhì)粒RAd5-35-Hexon-Adbone送樣測序，測序引物為：

5’-GAGGAAGTACGGCGCCGCCA-3’ （SEQ ID NO：9）（鑒定以NruI連接的方向是否正確）

5’-GAGGACATGAACGATCATGCCATTC-3’ （SEQ ID NO：10）（鑒定以AscI連接的方向是否正確）

5’-ATCGTTGCGGCCCGTAGCCAGTG-3’ (鑒定Ad35hexon替換是否正確)

2.表達(dá)綠色熒光蛋白（GFP）基因的穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建和熒光顯微鏡拍照觀察細(xì)胞變化。

第一步，將PCR獲得的GFP基因克隆到真核表達(dá)載體pDC315。

A. 以pHAGE-CMV-MCS-GFP（實驗室保存的帶有GFP基因的質(zhì)粒，也可以選擇其他帶有GFP基因的質(zhì)粒）為模板，上游引物5’-CCGGAATCCGATGTCTAAAGGTGAAGAATTATTCA-3’ （SEQ ID NO：11）和下游引物5’-CGCGGATCCGCGTTATTTGTACAATTCATCCATACC-3’ （SEQ ID NO：12）進(jìn)行PCR擴(kuò)增GFP基因；

PCR的反應(yīng)體系為：10×buffer 5μL、DNTP 4μL、上游引物1μL、下游引物1μL、高保真酶1μL、模板1μL以及滅菌水適量，總體積為50μL。

PCR反應(yīng)程序為：98℃預(yù)變性2min，98℃變性30s，55℃退火30s，68℃延伸1min，共30個循環(huán)；最后68℃再延伸10min。

B. PCR獲得目的基因后，以EcoRI和BamHI雙酶切PCR產(chǎn)物和pDC315載體，回收目的片段；于16℃下過夜進(jìn)行連接反應(yīng)；然后轉(zhuǎn)化、提取質(zhì)粒pDC315-GFP。

C. EcoRI和BamHI雙酶切pDC315-GFP質(zhì)粒，切出700bp和3900bp兩條帶，經(jīng)測序鑒定正確的pDC315-GFP克隆。

第二步，克隆成功后瞬時轉(zhuǎn)染人胚腎（293A）細(xì)胞，熒光顯微鏡觀察GFP蛋白的表達(dá)。步驟、試劑、條件如下：

A. 將293A細(xì)胞以5×10⁵個/孔的密度鋪于6孔板內(nèi)，置于5%CO₂的細(xì)胞培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)，至細(xì)胞生長面積為孔板底面積的80%-90%，將3ug pDC315-GFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞，轉(zhuǎn)染試劑為X-tremeGENE (購自Roche)，轉(zhuǎn)染操作參見試劑說明書。

B.熒光顯微鏡拍照觀察綠色熒光蛋白（GFP）的表達(dá)：轉(zhuǎn)染72小時后，在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白表達(dá)，并拍照，結(jié)果顯示在圖9中。

實施例2

重組腺病毒的包裝和感染力驗證

第一步：以實施例1中構(gòu)建好的重組腺病毒載體rAd5-35-Hexon-Adbone和原始腺病毒載體RAd5分別與實施例1中構(gòu)建的含有綠色熒光蛋白（GFP）基因的穿梭質(zhì)粒通過X-tremeGENE（購自Roche）共轉(zhuǎn)染至293A細(xì)胞，如圖3所示，使共轉(zhuǎn)染到293A細(xì)胞中的穿梭質(zhì)粒和腺病毒載體在重組酶的作用下包裝出重組腺病毒，得到的重組病毒是E1/E3缺失的復(fù)制缺陷型嵌合腺病毒。結(jié)果顯示構(gòu)建的重組腺病毒載體與原始腺病毒載體（即rAd5）均包裝成功初步獲得了病毒。實驗步驟、試劑、條件和操作方法如下：

在六孔板中每孔鋪3×10⁵個293A細(xì)胞，將攜帶綠色熒光蛋白的基因的腺病毒穿梭質(zhì)粒與腺病毒載體骨架質(zhì)粒各1.5ug，用X-tremeGENE （購自Roche）9μL共轉(zhuǎn)染293A細(xì)胞，隔2-3天換液1次，約16天左右出現(xiàn)細(xì)胞病變，即細(xì)胞變圓變大，脫落并成葡萄串珠狀聚集，結(jié)果顯示在圖10A和10B，陽性rAd5包裝病毒第八天左右即出現(xiàn)細(xì)胞病變，結(jié)果顯示在圖10C。

第二步：收集包裝出嵌合病毒，包裝病毒至14天，待細(xì)胞出現(xiàn)病變后，收集六孔板中包裝病毒細(xì)胞，經(jīng)-80℃--37℃水浴反復(fù)凍融3次后，4000rpm離心2分鐘去除細(xì)胞碎片，吸取含有病毒的細(xì)胞培養(yǎng)上清感染新的293A細(xì)胞。陽性的rAd5腺病毒感染293A細(xì)胞約4天左右能看到綠色熒光和細(xì)胞病變，結(jié)果顯示在圖11A，但rAd5-35-hexon-Adbone包裝的腺病毒感染293A約在10天之后才能看到綠色熒光和細(xì)胞病變，結(jié)果顯示在圖11B。

第三步：收集上一步中rAd5-35-hexon-Adbone包裝的腺病毒感染的293A細(xì)胞，經(jīng)-80℃--37℃反復(fù)凍融3次后，4000rpm離心2分鐘吸取上清。以病毒上清為模版，用引物F:5’-Atggccaccccatcgatgct-3’ （SEQ ID NO：13）和R:5’-TTACGTGGTAGCGTTACCG-3’ （SEQ ID NO：14）PCR擴(kuò)增Ad35hexon，測序鑒定rAd5的hexon被Ad35成功替換，結(jié)果顯示在圖12。

以上所述實施例僅表達(dá)了本發(fā)明的實施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能因此而理解為對本發(fā)明專利范圍的限制，但凡采用等同替換或等效變換的形式所獲得的技術(shù)方案，均應(yīng)落在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

序列表

<110> 南方醫(yī)科大學(xué)

<120> 一種重組腺病毒載體及其構(gòu)建方法

<130> 2016

<160> 14

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ctagataggc gcgcctacct cgcgaggagg cgcgccttg 39

<210> 2

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gatccaaggc gcgcctcctc gcgaggtagg cgcgcctat 39

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ctggtgacgc aaatagacga 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tctatcgatg gggtagccat 20

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

cccatcgatg atgccgca 18

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

cttgctcgtc tacttcgtct 20

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

atggccaccc catcgatgct gcc 23

<210> 8

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

tacgtggtag cgttgccggc cgaga 25

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

gaggaagtac ggcgccgcca 20

<210> 10

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

gaggacatga acgatcatgc cattc 25

<210> 11

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

ccggaatccg atgtctaaag gtgaagaatt attca 35

<210> 12

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

cgcggatccg cgttatttgt acaattcatc catacc 36

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

atggccaccc catcgatgct 20

<210> 14

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

ttacgtggta gcgttaccg 19