本發(fā)明涉及細胞融合的方法，具體是一種基于復合脈沖電場誘導細胞融合的方法。

背景技術(shù)：

細胞融合能夠?qū)崿F(xiàn)遠源雜交，其意義在于打破了僅僅依賴有限雜交重組基因創(chuàng)造新種的界限，有可能形成有性雜交方式無法獲得的新型的雜交動物或植物細胞，擴大了遺傳物質(zhì)的重組范圍。

細胞融合是生物制備的基本途徑。細胞能否有效融合是決定生物制備是否可行的關鍵，甚至成為制約生物制備技術(shù)發(fā)展的瓶頸。因此，如何發(fā)展和改進現(xiàn)有的細胞融合方法、提升細胞融合的效果和效率，已成為國內(nèi)外生物制備領域的一個研究熱點。

根據(jù)電融合的基本原理，細胞膜上出現(xiàn)足夠數(shù)量和尺寸的孔洞(即細胞電穿孔)，是細胞融合的先決條件。而細胞要發(fā)生電穿孔，細胞的跨膜電壓必須大于其細胞膜穿孔所需的電壓閾值。傳統(tǒng)的微秒脈沖在細胞融合時存在一定的缺陷，電穿孔的理論研究表明，在微秒脈沖作用下，細胞跨膜電壓值與細胞半徑呈顯著正相關。因此，微秒脈沖對細胞膜的電穿孔效應與細胞尺寸有直接關系，當融合不同尺寸的細胞時，作用相同場強的脈沖，半徑較大的細胞會先發(fā)生穿孔，半徑小的細胞后發(fā)生穿孔，換言之，當小細胞發(fā)生穿孔的時候，大細胞可能已經(jīng)處于過度穿孔的死亡狀態(tài)?，F(xiàn)有技術(shù)中，當兩種細胞的半徑相差1.5～5倍時，細胞難以融合或融合率極低。

納秒脈沖電場以其獨特的“細胞內(nèi)電處理”效應在生物醫(yī)學領域得到越來越多的關注。所謂“細胞內(nèi)電處理”效應，是指在外加納秒脈沖(脈沖寬度為ns級，電場強度為MV/m級)的作用下，細胞出現(xiàn)一種與前述微秒脈沖電穿孔現(xiàn)象截然不同的生物學效應：細胞膜表面不會出現(xiàn)明顯的電穿孔現(xiàn)象(即膜表面保持完整)，但細胞內(nèi)部(如細胞核、線粒體等)卻出現(xiàn)一系列功能性改變，產(chǎn)生大量微核，同時誘導細胞發(fā)生程序性死亡(也稱之為“凋亡”)。

事實上，納秒脈沖在透過細胞外膜作用于胞內(nèi)細胞器并誘導“細胞內(nèi)電處理”效應的同時，也能作用在細胞外膜上并在其上產(chǎn)生大量納米級尺寸的微孔。仿真和實驗證明，納秒脈沖對細胞膜的電穿孔效應與細胞尺寸沒有關系，納秒脈沖能夠用于不同尺寸細胞的融合。但是納秒脈沖應用于細胞融合時存在一定的缺陷，納秒脈沖電壓作用于細胞后，雖然會在細胞膜表面產(chǎn)生穿孔，但是穿孔的孔徑很小，并且持續(xù)的時間很短，很可能導致細胞還未融合，細胞膜上的穿孔就已經(jīng)復原。

因此，單純利用納秒或者微秒脈沖進行細胞融合都具有一定的缺陷，如果能結(jié)合利用納秒脈沖與微秒脈沖的優(yōu)勢，采取復合脈沖電場的形式作用于細胞融合，對于細胞電融合領域具有十分重要的意義。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

目前國際上廣泛使用的將微秒脈沖作用細胞融合。本發(fā)明的目的是解決微秒脈沖作用不同尺寸細胞融合時，存在難融合和效率低的問題。微秒脈沖對細胞膜的電穿孔效應與細胞尺寸有直接關系，當小細胞發(fā)生穿孔的時候，大細胞可能已經(jīng)處于過度穿孔的死亡狀態(tài)，針對這種缺陷,提出一種基于復合脈沖電場誘導細胞融合的方法。

具體是將納秒脈沖引入細胞電融合，使細胞膜先在納秒脈沖的作用下產(chǎn)生微小的“孔洞”，然后再將微秒脈沖作用細胞，使“孔洞”進一步增大，從而一定程度上提高電融合的成功率。本方法不僅可以用于相同尺寸的細胞電融合，而且可以用于融合不同尺寸的細胞。

為實現(xiàn)本發(fā)明目的而采用的技術(shù)方案是這樣的，基于復合脈沖電場誘導細胞融合的方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)將不同尺寸的細胞和融合液置于細胞培養(yǎng)槽內(nèi)；

融合槽極板的間距無要求，不同間距的融合槽只需要改變所施加脈沖的電壓即可保證得到相應的場強。

2)將正弦交流電壓施加于細胞培養(yǎng)槽的兩極，細胞將排隊且彼此緊貼；

3)通過開關切換，將培養(yǎng)槽兩極上所施加的正弦電壓切換為納秒脈沖電壓，槽內(nèi)細胞發(fā)生微小電穿孔；

4)繼續(xù)通過開關切換，將納秒脈沖電壓切換為微秒脈沖電壓，作用于已經(jīng)處于穿孔狀態(tài)的槽內(nèi)細胞，已處于開孔狀態(tài)的細胞上的孔進一步增大，彼此緊貼的兩個細胞的外膜彼此連接，兩細胞內(nèi)遺傳物質(zhì)互相融合，最終形成一個完整的融合細胞。

進一步，所述步驟1)中不同尺寸的細胞包括大細胞或小細胞，所述大細胞的半徑范圍為5～15μm，所述大細胞的半徑是小細胞半徑的2～7倍；

所述大細胞的密度為2×10⁷～5×10⁷個/L，所述小細胞的密度是大細胞密度的五倍；

所述步驟1)中的細胞為植物細胞或動物細胞；如選擇的細胞為植物細胞，融合前需對植物細胞進行去壁處理再進行融合。

進一步，所述步驟1)中的融合液包括體積比為(1～3)︰(1～3)︰(2～4)的PM緩沖液、酶液和CPW鹽溶液；

所述PM緩存液由MgCl₂、CaCl₂、山梨醇和三蒸水配制而成；所述MgCl₂的濃度為0.05～0.4mmol/L，CaCl₂的濃度為0.05～0.5mmol/L，山梨醇的濃度為200～500mmol；

所述酶液由Cellulase OnzukaR-10、Mecerozyme R-10和甘露醇配制而成；所述Cellulase OnzukaR-10的濃度為0.5％～3％，Mecerozyme R-10的濃度為0.5％～2％，甘露醇的濃度為10％～30％；

所述CPW鹽溶液：KH₂P0₄、KN0₃、CaCl₂·2H₂0、MgS0₄·7H₂0、KI和CuS0₄·5H₂0配制而成；所述KH₂P0₄的濃度為15～30mg/L，KN0₃的濃度為80.0～110.0mg/L，CaCl₂·2H₂0的濃度為1200.0～1600.0mg/L，MgS0₄·7H₂0的濃度為210.0～260.0mg/L，KI的濃度為O.1～O.5mg/L，CuS0₄·5H₂0的濃度為0.025～0.1mg/L。

進一步，所述步驟2)中正弦交流電壓參數(shù)范圍：0～100V，頻率0～1MHz，持續(xù)時間：0～100s。

進一步，所述步驟3)中的納秒脈沖是通過電容充放電實現(xiàn)的。

進一步，所述步驟3)中納秒脈沖參數(shù)：0～5000V(場強0～15kV/cm)作用個數(shù)1～1000個，脈沖間隔0.1S～10S(頻率0.1Hz～10Hz)，波形為脈沖方波，脈沖寬度50ns～500ns。

進一步，所述步驟4)中的微秒脈沖參數(shù)：0～3000V(場強0～9kV/cm)，作用個數(shù)1～1000個，脈沖間隔0.1S～10S(頻率0.1Hz～10Hz)，波形為脈沖方波，脈沖寬度15μs～400μs。

進一步，所述步驟4)中得到的融合細胞除不同尺寸細胞融合而成外，還能夠是相同尺寸細胞融合而成。

值得說明的是：

1)正弦交流電壓作用的終止條件：觀察到細胞排隊；正弦交流電壓到微秒脈沖電壓的切換時間在5μs內(nèi)。

2)納秒脈沖作用的終止條件：通過施加納秒脈沖的個數(shù)來控制；

例如：預計施加5個納秒脈沖，當施加到5個納秒脈沖后，就立即切換到微秒脈沖)。

3)微秒脈沖作用的終止條件：通過施加微秒脈沖的個數(shù)來控制；

例如：預計施加5個微秒脈沖，當施加到5個微秒脈沖后，就立馬停止施加脈沖)。

本發(fā)明的技術(shù)效果是十分顯著的，本發(fā)明具有以下優(yōu)點：

1)傳統(tǒng)的細胞電融合采取的是微秒脈沖電融合，但是微秒脈沖具有一定的缺陷，對于融合不同尺寸的細胞時，大細胞會比小細胞先產(chǎn)生穿孔，因此作用相同強度的電場的情況下，當小細胞發(fā)生穿孔的時候，大細胞可能早已處于過度穿孔的死亡狀態(tài)。而本發(fā)明中的方案使用的復合脈沖作用細胞電融合，利用了納秒脈沖不具有“細胞尺寸敏感性”的優(yōu)勢，能很好的融合不同尺寸的細胞。

2)雖然納秒脈沖作用下細胞膜的電穿孔效應與細胞尺寸沒有關系，納秒脈沖能夠用于不同尺寸細胞的融合。但是納秒脈沖應用于細胞融合時存在一定的缺陷，納秒脈沖電壓作用于細胞后，雖然會在細胞膜表面產(chǎn)生穿孔，但是穿孔的孔徑很小，并且持續(xù)的時間很短，很可能導致細胞還未融合，細胞膜上的穿孔就已經(jīng)復原。而本發(fā)明中的方案使用的復合脈沖作用細胞電融合，利用了微秒脈沖使細胞在納秒脈沖作用下產(chǎn)生的“孔洞”繼續(xù)維持并且進一步擴大，能夠很好的提高細胞融合的成功率。

3)基于復合脈沖電融合的方法，相比于傳統(tǒng)的微秒脈沖細胞電融合，能夠提高細胞融合的成功率。

附圖說明

圖1為ns脈沖電融合示意圖；

圖2為μs脈沖電融合示意圖；

圖3為ns/μs復合脈沖電場示意圖；

圖4和為本發(fā)明的工作流程圖；

圖5為細胞在正弦電壓作用下發(fā)生的雙向電泳排隊示意圖；

圖6為本發(fā)明的融合過程示意圖；

圖6中：(a)為經(jīng)過細胞排隊，細胞彼此接觸的示意圖；

(b)為由納秒脈沖作用使細胞連接部位產(chǎn)生穿孔，彼此粘接的示意圖；

(c)為經(jīng)過微秒脈沖使細胞連接部位的穿孔進一步增大的示意圖；

(d)為兩個細胞彼此融合成一個細胞的示意圖。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步說明，但不應該理解為本發(fā)明上述主題范圍僅限于下述實施例。在不脫離本發(fā)明上述技術(shù)思想的情況下，根據(jù)本領域普通技術(shù)知識和慣用手段，做出各種替換和變更，均應包括在本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。

實施例1：

基于復合脈沖電場誘導細胞融合的方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)將不同尺寸的細胞和融合液置于細胞培養(yǎng)槽內(nèi)；

1.1)所述不同尺寸的細胞包括大細胞或小細胞，所述大細胞的半徑范圍為5～15μm，所述大細胞的半徑是小細胞半徑的2～7倍；

所述大細胞的密度為2×10⁷～5×10⁷個/L，所述小細胞的密度是大細胞密度的五倍；

1.2)所述細胞為植物細胞或動物細胞；如選擇的細胞為植物細胞，融合前需對植物細胞進行去壁處理再進行融合過程。

1.3)所述融合液包括體積比為(1～3)︰(1～3)︰(2～4)的PM緩沖液、酶液和CPW鹽溶液；

所述PM緩存液由MgCl₂、CaCl₂、山梨醇和三蒸水配制而成；所述MgCl₂的濃度為0.05～0.4mmol/L，CaCl₂的濃度為0.05～0.5mmol/L，山梨醇的濃度為200～500mmol；

所述酶液由Cellulase OnzukaR-10、Mecerozyme R-10和甘露醇配制而成；所述Cellulase OnzukaR-10的濃度為0.5％～3％，Mecerozyme R-10的濃度為0.5％～2％，甘露醇的濃度為10％～30％；

所述CPW鹽溶液：KH₂P0₄、KN0₃、CaCl₂·2H₂0、MgS0₄·7H₂0、KI和CuS0₄·5H₂0配制而成；所述KH₂P0₄的濃度為15～30mg/L，KN0₃的濃度為80.0～110.0mg/L，CaCl₂·2H₂0的濃度為1200.0～1600.0mg/L，MgS0₄·7H₂0的濃度為210.0～260.0mg/L，KI的濃度為O.1～O.5mg/L，CuS0₄·5H₂0的濃度為0.025～0.1mg/L。

1.4)所述融合槽極板的間距無要求，不同間距的融合槽只需要改變施加的脈沖的電壓即可保證得到相應的場強。

2)將正弦交流電壓施加于細胞培養(yǎng)槽的兩極，細胞將排隊且彼此緊貼；

所述正弦交流電壓參數(shù)范圍：0～100V，頻率0～1MHz，持續(xù)時間：0～100s。

3)通過開關切換，將培養(yǎng)槽兩極上所施加的正弦電壓切換為納秒脈沖電壓，作用于已經(jīng)處于排隊狀態(tài)的細胞，槽內(nèi)細胞發(fā)生微小電穿孔；

所述納秒脈沖是通過電容充放電實現(xiàn)的。

所述納秒脈沖參數(shù)：0～5000V(場強0～15kV/cm)，作用個數(shù)1～1000個，脈沖間隔0.1S～10S(頻率0.1Hz～10Hz)，波形為脈沖方波，脈沖寬度50ns～500ns。

4)通過開關切換，將納秒脈沖電壓切換為微秒脈沖電壓，作用于已經(jīng)處于穿孔狀態(tài)的槽內(nèi)細胞，已處于開孔狀態(tài)的細胞上的孔進一步增大，彼此緊貼的兩個細胞的外膜彼此連接，兩細胞內(nèi)遺傳物質(zhì)互相融合，最終形成一個完整的融合細胞。

所述微秒脈沖參數(shù)：0～3000V(場強0～9kV/cm)，作用個數(shù)1～1000個，脈沖間隔0.1S～10S(頻率0.1Hz～10Hz)，波形為脈沖方波，脈沖寬度15μs～400μs。

本步驟得到的所述融合細胞除不同尺寸細胞融合而成外，還能夠是相同尺寸細胞融合而成。

實施例2：

基于復合脈沖電場誘導細胞融合的方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)將不同尺寸的細胞和融合液置于細胞培養(yǎng)槽內(nèi)；

1.1)選擇細胞

大細胞為：鼠源骨髓瘤細胞，半徑為7.75±0.25μm；

小細胞為：鼠源B淋巴細胞，半徑為3.85±0.35μm；

1.2)選擇融合液(培養(yǎng)液)

所述電融合的融合液主要成分是葡萄糖，鈣離子，鎂離子。所述步驟1)中的融合液包括體積比為1︰1︰2的PM緩沖液、酶液和CPW鹽溶液；

所述PM緩存液由MgCl₂、CaCl₂、山梨醇和三蒸水配制而成；所述MgCl₂的濃度為0.05mmol/L，CaCl₂的濃度為0.05mmol/L，山梨醇的濃度為200mmol/L；

所述酶液由Cellulase OnzukaR-10、Mecerozyme R-10和甘露醇配制而成；所述Cellulase OnzukaR-10的濃度為0.5％，Mecerozyme R-10的濃度為0.5％，甘露醇的濃度為10％；

所述CPW鹽溶液：KH₂P0₄、KN0₃、CaCl₂·2H₂0、MgS0₄·7H₂0、KI和CuS0₄·5H₂0配制而成；所述KH₂P0₄的濃度為15mg/L，KN0₃的濃度為80.0mg/L，CaCl₂·2H₂0的濃度為1200.0mg/L，MgS0₄·7H₂0的濃度為210.0mg/L，KI的濃度為O.1mg/L，CuS0₄·5H₂0的濃度為0.025mg/L。

1.3)選擇培養(yǎng)槽

選擇長方體型培養(yǎng)槽，培養(yǎng)槽間距為3.81mm，容積為9mL；

培養(yǎng)槽內(nèi)：大細胞的細胞密度約2×10⁷～5×10⁷個/L，小細胞的密度是大細胞的五倍。

2)將正弦交流電壓作用于細胞培養(yǎng)槽的兩極，細胞將排隊且彼此緊貼；

所述正弦交流電壓的參數(shù)為：電壓50V，1MHz，持續(xù)時間20s。

如圖5所示，即為細胞在正弦交流電壓作用下發(fā)生的雙向電泳排隊示意圖。

正弦交流電壓作用的終止條件：觀察到細胞排隊，正弦排隊電壓到微秒脈沖電壓的切換時間在5μs內(nèi)。

3)通過開關切換，將培養(yǎng)槽兩極上所施加的正弦交流電壓切換為納秒脈沖電壓，槽內(nèi)細胞發(fā)生微小電穿孔；

所述納秒脈沖電壓的參數(shù)為：幅值4000V，個數(shù)20個，脈沖間隔0.1s，脈沖寬度100ns；

4)繼續(xù)通過開關切換，將納秒脈沖電壓切換為微秒脈沖電壓，作用于已經(jīng)處于穿孔狀態(tài)的槽內(nèi)細胞，已處于開孔狀態(tài)的細胞上的孔進一步增大，彼此緊貼的兩個細胞的外膜彼此連接，兩細胞內(nèi)遺傳物質(zhì)互相融合，最終形成一個完整的融合細胞；

所述微秒脈沖電壓的參數(shù)(頻率、幅值等)：電壓45V,脈沖寬度15μs，作用個數(shù)2個，脈沖間隔時間0.1s(即頻率10Hz)。

整個過程如圖6所示，其中，(a)為經(jīng)過細胞排隊，細胞彼此接觸的示意圖；(b)為由納秒脈沖作用使細胞連接部位產(chǎn)生開孔，彼此粘接的示意圖；(c)為經(jīng)過微秒脈沖使細胞連接部位的孔進一步增大的示意圖；(d)為兩個細胞彼此融合成一個細胞的示意圖。

對比例：

現(xiàn)有技術(shù)中，采用納秒脈沖的方法進行細胞融合；如圖1所示即為納秒脈沖單獨作用于細胞融合的孔密度圖；圖中深色部分表示細胞穿孔的部位，納秒脈沖作用兩個不同尺寸的細胞融合時，雖然大細胞與小細胞的穿孔基本都發(fā)生在細胞連接處，但是產(chǎn)生的孔徑很小，并且孔持續(xù)時間很短，很可能導致兩細胞還沒有融合，穿孔就已經(jīng)恢復了。

現(xiàn)有技術(shù)中，采用微秒脈沖的方法進行細胞融合；如圖2所示即為微秒脈沖單獨作用于細胞融合的孔密度圖，圖中深色部分表示細胞穿孔的部位，微秒脈沖作用兩個不同尺寸的細胞融合時，大細胞會先發(fā)生穿孔，當小細胞發(fā)生穿孔的時候，大細胞可能已經(jīng)死亡。

相對于如圖1和圖2的現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明中如圖3和圖4所示的本發(fā)明工作流程圖，采用了：首先脈沖寬度較小的納秒脈沖使細胞接觸區(qū)域產(chǎn)生微小的穿孔，繼而施加脈沖寬度相對較寬的微秒脈沖使細胞接觸區(qū)域的穿孔進一步增大，以便于細胞的直接融合。

經(jīng)過對比可以很明顯的發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明中結(jié)合了納秒脈沖和微秒脈沖的優(yōu)勢，利用納秒脈沖先產(chǎn)生穿孔再微秒脈沖使孔進一步增加，通過設置納秒和微秒的脈沖參數(shù)，可以有效的促使不同尺寸細胞間發(fā)生融合，提高不同尺寸細胞的融合效率。