本發(fā)明涉及一種凈化伏馬毒素b1、黃曲霉毒素、赭曲霉毒素a、玉米赤霉烯酮免疫吸附劑及復(fù)合親和柱。
背景技術(shù)：
伏馬毒素是由鐮刀菌屬在一定的溫度和濕度下產(chǎn)生的水溶性代謝產(chǎn)物，是一類(lèi)由不同的多氫醇和丙三羧酸組成結(jié)構(gòu)類(lèi)似的雙酯化合物。伏馬毒素能在較低的濃度范圍內(nèi)干擾植物正常生理功能，是對(duì)植物代謝有毒害作用的非酶類(lèi)化合物，屬于真菌毒素和非寄主專(zhuān)化型毒素。主要分布在以玉米、高粱、小麥為主的農(nóng)作物上，可造成秧苗枯萎，根、莖、種子腐爛等農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)損失。伏馬毒素對(duì)畜禽和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物可引起各種具有特異性的毒理作用，如馬、兔的腦白質(zhì)軟化癥，其表現(xiàn)為:神經(jīng)性中毒，意識(shí)障礙、失明和運(yùn)動(dòng)失調(diào)等癥狀，嚴(yán)重者甚至造成死亡。還可造成豬的肺水腫和水胸，肝臟和食道損傷"伏馬毒素還可引起靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物的動(dòng)脈粥樣硬化，鼠、羔羊、小牛的肝細(xì)胞凋亡和腎毒性，還有肝毒性和致癌效應(yīng)，給畜牧業(yè)帶來(lái)嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。
黃曲霉毒素(aft)是一類(lèi)化學(xué)結(jié)構(gòu)類(lèi)似的化合物，均為二氫呋喃香豆素的衍生物。根據(jù)在紫外照射下熒光發(fā)生的不同，天然產(chǎn)生的黃曲霉毒素分為兩大類(lèi)，即b族(熒光為藍(lán)色，blue)和g族(熒光為綠色，green)，b族包括黃曲霉毒素b1(afb1)和黃曲霉毒素b2(afb2)，主要由黃曲霉菌和寄生曲霉菌產(chǎn)生，g族包括黃曲霉毒素g1(afg1)和黃曲霉毒素g2(afg2)，主要由黃曲霉菌產(chǎn)生。黃曲霉毒素廣泛存在于糧食谷物和飼料及其加工品中,具有誘導(dǎo)突變、抑制免疫和致癌的作用。而黃曲霉毒素b1(afb1)的毒性和致癌性最強(qiáng)，其作用的靶器官主要是肝臟，被公認(rèn)為致肝癌物質(zhì)，長(zhǎng)期食用含有低水平黃曲霉毒素食物的人其肝臟也將受到損害。國(guó)際癌癥中心將其定為一類(lèi)致癌劑。
赭曲霉毒素是由赭曲霉和純綠青霉產(chǎn)生的一種霉菌腎毒素，可分為a和b兩種類(lèi)型，a的毒性較大。赭曲霉毒素在4℃的低溫下赭曲霉即可產(chǎn)生具有毒害作用濃度的赭曲霉毒素。動(dòng)物攝入1ppm體重劑量的赭曲霉毒素a可在5～6天致死。常見(jiàn)的病變是腎小管上皮損傷和腸道淋巴腺體壞死。飼喂含1ppm濃度赭曲霉毒素的日糧3個(gè)月可引起動(dòng)物煩渴、尿頻、生長(zhǎng)遲緩和飼料利用率降低；飼喂含量低至200ppb的日糧數(shù)周可檢測(cè)到腎損傷。其他的臨床癥狀還有腹瀉、厭食和脫水。有時(shí)臨床癥狀不明顯，而在赭曲霉毒素中毒呈地方流行病的地區(qū)，動(dòng)物在屠宰時(shí)惟一可觀察到的病變是腎蒼白、堅(jiān)硬。
玉米赤霉烯酮又稱(chēng)f-2毒素,它首先從有赤霉病的玉米中分離得到.玉米赤霉烯酮其產(chǎn)毒菌主要是鐮刀菌屬的菌侏,如禾谷鐮刀菌和三線鐮刀菌.玉米赤霉烯酮主要污染玉米,小麥,大米,大麥,小米和燕麥等谷物,其中玉米的陽(yáng)性檢出率為45％,最高含毒量可達(dá)到2909mg/kg；小麥的檢出率為20％,含毒量為0.364～11.05mg/kg.玉米赤霉烯酮的耐熱性較強(qiáng),110℃下處理1h才被完全破壞.玉米赤霉烯酮具有雌激素作用,主要作用于生殖系統(tǒng),可使家畜,家禽和實(shí)驗(yàn)小鼠產(chǎn)生雌性激素亢進(jìn)癥.妊娠期的動(dòng)物(包括人)食用含玉米赤霉烯酮的食物可引起流產(chǎn),死胎和畸胎.食用含赤霉病麥面粉制作的各種面食也可引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)的中毒癥狀,如惡心,發(fā)冷,頭痛,神智抑郁和共濟(jì)失調(diào)等。
目前，伏馬毒素b1、黃曲霉毒素、赭曲霉毒素a和玉米赤霉烯酮等這些真菌毒素檢測(cè)方法主要有薄層層析法，酶聯(lián)免疫法(elisa)，免疫親和層析-液相色譜法，免疫親和層析-熒光光度法等。薄層層析法要接觸大量的標(biāo)準(zhǔn)品，不利于實(shí)驗(yàn)者的健康，而且靈敏度很低。酶聯(lián)免疫法只適用于定性檢測(cè)，很容易出現(xiàn)假陽(yáng)性和假陰性的現(xiàn)象。免疫親和層析-液相色譜法可以定量地檢測(cè)許多商品中的伏馬毒素b1、黃曲霉毒素、赭曲霉毒素a和玉米赤霉烯酮的含量。由于采用了先進(jìn)的生物技術(shù)，該方法可以檢測(cè)出伏馬毒素b1、黃曲霉毒素、赭曲霉毒素a和玉米赤霉烯酮的含量，而不使用有毒的溶劑如氯仿和二氯甲烷。因此，當(dāng)務(wù)之急，要制備出性能穩(wěn)定的免疫親和柱，并建立一種經(jīng)濟(jì)，快捷，精確，安全的試驗(yàn)方法。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
為了解決現(xiàn)有技術(shù)中檢測(cè)伏馬毒素b1、黃曲霉毒素、赭曲霉毒素a、玉米赤霉烯酮亟需性能穩(wěn)定的免疫親和柱的問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種凈化伏馬毒素b1、黃曲霉毒素、赭曲霉毒素a、玉米赤霉烯酮復(fù)合親和柱及其制備方法與應(yīng)用。
為了實(shí)現(xiàn)上述目的本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：
伏馬毒素b1、黃曲霉毒素、赭曲霉毒素a、玉米赤霉烯酮抗體免疫吸附劑，所述的免疫吸附劑包括固相載體和與該固相載體上偶聯(lián)的伏馬毒素b1單克隆抗體、黃曲霉毒素單克隆抗體、赭曲霉毒素a單克隆抗體、玉米赤霉烯酮單克隆抗體，所述的伏馬毒素抗體為由保藏編號(hào)為cctccno.c201636的雜交瘤細(xì)胞株fm7a11分泌產(chǎn)生的單克隆抗體，所述的雜交瘤細(xì)胞株fm7a11已于2016年3月29日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址是，中國(guó)，武漢，武漢大學(xué)，保藏編號(hào)為cctccno.c201636。
按上述方案，所述固相載體為瓊脂糖凝膠。
裝載有伏馬毒素b1、黃曲霉毒素、赭曲霉毒素a、玉米赤霉烯酮抗體免疫吸附劑的凈化伏馬毒素b1、黃曲霉毒素、赭曲霉毒素a、玉米赤霉烯酮復(fù)合親和柱。
凈化伏馬毒素b1、黃曲霉毒素、赭曲霉毒素a、玉米赤霉烯酮復(fù)合親和柱的制備，包括：
a)基質(zhì)制備
將cnbr活化的瓊脂糖凝膠基質(zhì)粉末在ph2-3的條件下用hcl洗滌除雜；cnbr活化的瓊脂糖凝膠是以?xún)龈尚问教峁Ｔ谂c目的配體偶聯(lián)前在低ph(ph2-3)條件下用hcl洗滌予以洗去這些添加劑。
b)配體偶聯(lián)
使用偶聯(lián)緩沖液溶解待偶聯(lián)的伏馬毒素b1單克隆抗體、黃曲霉毒素b1單克隆抗體、赭曲霉毒素a單克隆抗體、玉米赤霉烯酮單克隆抗體，獲得抗體溶液，迅速將步驟a)活化的瓊脂糖凝膠基質(zhì)轉(zhuǎn)移到上述抗體溶液中，室溫條件(20-25℃)下充分混勻上述混和物2-4h；
c)配體封閉
封閉所有殘留的活性基團(tuán)；
d)除去偶聯(lián)后未偶聯(lián)上的多余的配體；
e)裝柱。
按上述方案，所述步驟a)中洗滌用hcl濃度為1mmol/l，洗滌時(shí)間為15min。
按上述方案，步驟b)中的偶聯(lián)緩沖液為0.2mol/lna2hco3，ph8.3，每個(gè)抗體溶液濃度為10-15mg/ml。
按上述方案，步驟c)的配體封閉過(guò)程為：轉(zhuǎn)移經(jīng)步驟b)處理的瓊脂糖凝膠基質(zhì)至0.1mol/ltris-hcl緩沖液中，室溫條件下靜置2-4h。
按上述方案，步驟d)為：依次用ph值為4和ph值為8的緩沖液對(duì)經(jīng)步驟c)處理后的瓊脂糖凝膠基質(zhì)進(jìn)行洗滌，至少洗滌3個(gè)循環(huán)；ph值為4和ph值為8的緩沖液分別可選0.1mol/l醋酸/醋酸鈉緩沖液和0.1mol/ltris-hcl緩沖液。
按上述方案，步驟e)為用5倍所述瓊脂糖凝膠體積的0.01％nan3-pbs洗滌，并使用0.01％nan3-pbs保存，然后裝柱。
上述赭曲霉毒素a抗體可選由保藏編號(hào)為cctccno.c201329的雜交瘤細(xì)胞株1h2分泌產(chǎn)生的單克隆抗體。玉米赤霉烯酮抗體可選由保藏編號(hào)為為cctccno.c201328的雜交瘤細(xì)胞株2d3分泌產(chǎn)生的單克隆抗體。所述的伏馬毒素抗體可選由保藏編號(hào)為cctccno.c201636的雜交瘤細(xì)胞株fm7a11分泌產(chǎn)生的單克隆抗體；上述黃曲霉毒素抗體可選黃曲霉毒素通用單克隆抗體，如為由保藏編號(hào)為cctccno.c201013的雜交瘤細(xì)胞株1c11分泌產(chǎn)生的黃曲霉毒素通用單克隆抗體。
在此基礎(chǔ)上本發(fā)明建立了免疫親和柱凈化-液質(zhì)聯(lián)用法檢測(cè)伏馬毒素b1、黃曲霉毒素、赭曲霉毒素a和玉米赤霉烯酮含量的方法，當(dāng)含有伏馬毒素b1、黃曲霉毒素、赭曲霉毒素a和玉米赤霉烯酮的樣品通過(guò)免疫親和柱時(shí)，免疫吸附劑會(huì)特異性的吸附伏馬毒素b1、黃曲霉毒素、赭曲霉毒素a和玉米赤霉烯酮，其他的雜質(zhì)則流出免疫親和柱，然后用色譜級(jí)甲醇洗脫親和柱，洗脫流速1ml/min～2ml/min，將伏馬毒素b1、黃曲霉毒素、赭曲霉毒素a和玉米赤霉烯酮從柱子中洗脫下來(lái)，樣品即得到了很好的凈化，由此收集的洗脫液供高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測(cè)用；
基于上述復(fù)合親和柱檢測(cè)伏馬毒素b1、黃曲霉毒素、赭曲霉毒素a和玉米赤霉烯酮含量的方法，將含有伏馬毒素b1、黃曲霉毒素、赭曲霉毒素a和玉米赤霉烯酮的樣品通過(guò)免疫親和柱時(shí)，免疫吸附劑會(huì)特異性的吸附伏馬毒素b1、黃曲霉毒素、赭曲霉毒素a和玉米赤霉烯酮，其他的雜質(zhì)則流出免疫親和柱，然后用色譜級(jí)甲醇洗脫親和柱，收集洗脫液即凈化濃縮后的樣品供高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測(cè)，得各毒素含量；
高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀條件：
a流動(dòng)相：a，0.05％甲酸/水溶液；b，0.05％甲酸/乙腈溶液；
b梯度洗脫：0-3min,15％-50％b；4-5min,50％-70％b；6.5-8min,70％-100％b；8-10min,100％-50％b；10-11min,50％-15％b；11-15min,15％b.
c色譜柱：c-18柱；
d流速：200μl/min；
各種毒素檢測(cè)的質(zhì)譜掃描參數(shù)如表1所示
表1各種毒素的掃描參數(shù)
具體定量方法可采用如下方式：用進(jìn)樣器吸取不同濃度的伏馬毒素b1、黃曲霉毒素b1、黃曲霉毒素b2、黃曲霉毒素g1、黃曲霉毒素g2、赭曲霉毒素a和玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)工作液注入高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，在上述條件下測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰面積，繪制各種毒素的標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后利用外標(biāo)法標(biāo)算出各毒素的含量。
按上述方案，所述的洗脫流速1ml/min～2ml/min，
本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明制備的親和柱可以用于伏馬毒素b1、黃曲霉毒素、赭曲霉毒素a和玉米赤霉烯酮的高效液相色譜-質(zhì)譜檢測(cè)，其性能穩(wěn)定。通過(guò)使用本親和柱建立了一種經(jīng)濟(jì)，快捷，精確，安全的檢測(cè)方法，可同時(shí)用于這幾種毒素樣品的凈化，七種之間無(wú)相互干涉影響。
附圖說(shuō)明
圖1為伏馬毒素b1、黃曲霉毒素、赭曲霉毒素a和玉米赤霉烯酮的質(zhì)譜色譜圖；(從上到下依次是：玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素a、伏馬毒素b1、黃曲霉毒素g2、黃曲霉毒素g1、黃曲霉毒素b2、黃曲霉毒素b1。
具體實(shí)施方式
實(shí)例一：
實(shí)施例1黃曲霉毒素通用單克隆抗體的獲得
黃曲霉毒素通用單克隆抗體由保藏編號(hào)為cctccno.c201013的雜交瘤細(xì)胞株1c11分泌產(chǎn)生，具體根據(jù)授權(quán)號(hào)為zl201010245095.5的專(zhuān)利中報(bào)道的方法預(yù)先制得，制備方法為：將獲得的雜交瘤細(xì)胞株1c11注射預(yù)先用福氏不完全佐劑處理過(guò)的balb/c小鼠，收集小鼠的腹水，純化處理后獲得黃曲霉毒素通用b單克隆抗體。其中，純化方法為辛酸-硫酸銨法，具體操作為：用雙層濾紙過(guò)濾小鼠腹水，過(guò)濾后的腹水于4℃，12000r/min離心15min以上，吸取上清，將上清與4倍體積的醋酸鹽緩沖液混合，邊攪拌邊緩慢加入正辛酸，每毫升腹水所需的正辛酸體積為30-35μl，室溫混合30-60min，4℃靜置2h以上，然后4℃，12000r/min離心30min以上，棄沉淀，將得到的上清液用雙層濾紙過(guò)濾后，加入1/10濾液體積的摩爾濃度為0.1mol/l和ph值7.4的磷酸鹽緩沖液，用2mol/l的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)該混合液的ph值至7.4，4℃預(yù)冷，緩慢加入硫酸銨至硫酸銨終濃度為0.277g/ml，4℃靜置2h以上，然后4℃，12000r/min離心30min以上，棄上清，將所得沉淀用原腹水體積1/10的0.01mol/l磷酸鹽緩沖液重懸，裝入透析袋，用純水透析，將充分透析好的蛋白溶液置-70℃冰箱冷凍，然后用冷凍真空干燥機(jī)凍干，收集凍干粉，即得純化好的黃曲霉毒素通用單克隆抗體，將抗體置-20℃冰箱中備用；
所述的醋酸鹽緩沖液為0.29g醋酸鈉，0.141ml醋酸加水定容至100ml所得；所述的0.1mol/l的磷酸鹽緩沖液為0.8g氯化鈉，0.29g十二水磷酸氫二鈉，0.02g氯化鉀，磷酸二氫鉀0.02g，加水定容至100ml所得；
實(shí)施例2赭曲霉毒素a單克隆抗體的獲得；
赭曲霉毒素a單克隆抗體由保藏編號(hào)為cctccno.c201329的雜交瘤細(xì)胞株1h2分泌產(chǎn)生，具體根據(jù)申請(qǐng)?zhí)枮?01310115921.8的專(zhuān)利中報(bào)道的方法預(yù)先制得，制備方法為：將雜交瘤細(xì)胞株1h2注射到預(yù)先用福氏不完全佐劑處理過(guò)的balb/c小鼠的腹部，收集小鼠的腹水，純化即得赭曲霉毒素a單克隆抗體。所述的純化方法為辛酸-硫酸銨法，具體步驟為：用雙層濾紙過(guò)濾小鼠腹水，4℃，12000r/min離心15min以上，吸取上清，將所得腹水上清與4倍體積的醋酸鹽緩沖液混合，攪拌下緩慢加入正辛酸，每毫升腹水所需的正辛酸體積為30-35μl，室溫混合30-60min，4℃靜置2h以上，然后4℃，12000r/min離心30min以上，棄沉淀，將得到的上清液用雙層濾紙過(guò)濾后，加入1/10濾液體積的摩爾濃度為0.1mol/l和ph值為7.4的磷酸鹽緩沖液，用2mol/l的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)該混合液的ph值至7.4，4℃預(yù)冷，緩慢加入硫酸銨至硫酸銨終濃度為0.277g/ml，4℃靜置2h以上，然后4℃，12000r/min離心30min以上，棄上清，將所得沉淀用原腹水體積1/10的0.01mol/l、ph值為7.4的磷酸鹽緩沖液重懸，裝入透析袋，用純水透析，將充分透析好的蛋白溶液置-70℃冰箱冷凍，之后用冷凍干燥機(jī)凍干，收集凍干粉，即得純化好的赭曲霉毒素a單克隆抗體，將抗體置-20℃冰箱中備用；
所述的醋酸鹽緩沖液為0.29g醋酸鈉，0.141ml醋酸加水定容到100ml所得；所述的0.01mol/l的磷酸鹽緩沖液為0.8g氯化鈉，0.29g十二水磷酸氫二鈉，0.02g氯化鉀，磷酸二氫鉀0.02g，加水定容到100ml所得；所述的0.1mol/l的磷酸鹽緩沖液為8g氯化鈉，2.9g十二水磷酸氫二鈉，0.2g氯化鉀，磷酸二氫鉀0.2g，加水定容到100ml所得；
實(shí)施例3玉米赤霉烯酮單克隆抗體的獲得
玉米赤霉烯酮單克隆抗體由保藏編號(hào)為cctccno.c201328的雜交瘤細(xì)胞株2d3分泌產(chǎn)生，具體根據(jù)申請(qǐng)?zhí)枮?01310115825.3的專(zhuān)利中報(bào)道的方法預(yù)先制得，制備方法為：將雜交瘤細(xì)胞株2d3注射到預(yù)先用福氏不完全佐劑處理過(guò)的balb/c小鼠的腹部，收集小鼠的腹水，純化即得玉米赤霉烯酮單克隆抗體；所述的純化方法為辛酸-硫酸銨法，具體步驟為：用雙層濾紙過(guò)濾小鼠腹水，4℃，12000r/min離心15min以上，吸取上清，將所得腹水上清與4倍體積的醋酸鹽緩沖液混合，攪拌下緩慢加入正辛酸，每毫升腹水所需的正辛酸體積為30-35μl，室溫混合30-60min，4℃靜置2h以上，然后4℃，12000r/min離心30min以上，棄沉淀，將得到的上清液用雙層濾紙過(guò)濾后，加入1/10濾液體積的摩爾濃度為0.1mol/l、ph值為7.4的磷酸鹽緩沖液，用2mol/l的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)該混合液的ph值至7.4，4℃預(yù)冷，緩慢加入硫酸銨至硫酸銨終濃度為0.277g/ml，4℃靜置2h以上，然后4℃，12000r/min離心30min以上，棄上清，將所得沉淀用原腹水體積1/10的0.01mol/l、ph值為7.4的磷酸鹽緩沖液重懸，裝入透析袋，用純水透析，將充分透析好的蛋白溶液置-70℃冰箱冷凍，之后用冷凍干燥機(jī)凍干，收集凍干粉，即得純化好的玉米赤霉烯酮單克隆抗體，將抗體置-20℃冰箱中備用；
所述的醋酸鹽緩沖液為0.29g醋酸鈉，0.141ml醋酸加水定容到100ml所得；所述的0.01mol/l的磷酸鹽緩沖液為0.8g氯化鈉，0.29g十二水磷酸氫二鈉，0.02g氯化鉀，磷酸二氫鉀0.02g，加水定容到100ml所得；所述的0.1mol/l的磷酸鹽緩沖液為8g氯化鈉，2.9g十二水磷酸氫二鈉，0.2g氯化鉀，磷酸二氫鉀0.2g，加水定容到100ml所得；
實(shí)施例4雜色曲霉毒素單克隆抗體的獲得
雜色曲霉毒素單克隆抗體由保藏編號(hào)為cctccno.c2013187的雜交瘤細(xì)胞株st03分泌產(chǎn)生，具體根據(jù)申請(qǐng)?zhí)枮?01410115952.8的專(zhuān)利中報(bào)道的方法預(yù)先制得，制備方法為：將獲得的雜交瘤細(xì)胞株st03注射到預(yù)先用福氏不完全佐劑處理過(guò)的balb/c小鼠的腹部，收集小鼠的腹水，純化后得到雜色曲霉毒素單克隆抗體。所述的純化為辛酸-硫酸銨純化法，具體操作為：用雙層濾紙過(guò)濾小鼠腹水，4℃，12000r/min離心15min以上，吸取上清，將所得腹水上清與4倍體積的醋酸鹽緩沖液混合，攪拌下緩慢加入正辛酸，每毫升腹水所需的正辛酸體積為33μl，室溫混合30-60min，4℃靜置2h以上，然后4℃，12000r/min離心30min以上，棄沉淀，將得到的上清液用雙層濾紙過(guò)濾后，加入1/10濾液體積的摩爾濃度為0.1mol/l和ph值為7.4的磷酸鹽緩沖液，用2mol/l的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)該混合液的ph值至7.4，4℃預(yù)冷，緩慢加入硫酸銨至硫酸銨終濃度為0.277g/ml，4℃靜置2h以上，然后4℃，12000r/min離心30min以上，棄上清，將所得沉淀用原腹水體積1/10的0.01mol/l磷酸鹽緩沖液重懸，裝入透析袋，用純水透析，將充分透析好的蛋白溶液置-70℃冰箱冷凍，之后用冷凍干燥機(jī)凍干，收集凍干粉，即得純化好的雜色曲霉毒素單克隆抗體，將抗體置-20℃冰箱中備用；
所述的醋酸鹽緩沖液為0.29g醋酸鈉，0.141ml醋酸加水定容到100ml所得；所述的0.1mol/l的磷酸鹽緩沖液為0.8g氯化鈉，0.29g十二水磷酸氫二鈉，0.02g氯化鉀，磷酸二氫鉀0.02g，加水定容到100ml所得。
實(shí)施例5伏馬毒素b1單克隆抗體的獲得
雜交瘤細(xì)胞株fm7a11的篩選
1.抗原合成及動(dòng)物免疫
購(gòu)買(mǎi)市售的伏馬毒素b1標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行完全抗原合成，具體合成步驟如下:將2mg的fb1標(biāo)準(zhǔn)品粉末與2mg的edc分別溶于500μl的0.01mol/lpbs溶液，得到edc溶液和fb1溶液，將4mg/ml(溶液為0.01mol/lpbs)的edc溶液逐滴加入溶解好的fb1溶液中，室溫下輕輕攪拌10分鐘。將5mg/ml(溶液為0.01mol/lpbs)的bsa溶液逐滴加入到上述混合液中，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)4小時(shí)。透析3天。最后進(jìn)行常規(guī)紫外掃描法鑒定，鑒定結(jié)果表明fb1-bsa完全抗原制備成功。
購(gòu)買(mǎi)6周齡balb/c小鼠6只，免疫實(shí)驗(yàn)室合成的伏馬毒素完全抗原fb1-bsa。第一次免疫將伏馬毒素完全抗原與等體積的弗氏完全佐劑乳化后，于小鼠頸背部皮下多點(diǎn)注射。第二次免疫于3周后進(jìn)行，采用弗氏不完全佐劑與等體積的伏馬毒素完全抗原乳化，于小鼠頸背部皮下多點(diǎn)注射。第三次與第四次免疫分別與上一次免疫間隔兩周，免疫方式與第二次相同。四次免疫劑量相同，僅為100μg/只。第三次免疫后第7天，小鼠尾靜脈采血，分離血清，采用間接elisa法監(jiān)測(cè)小鼠血清效價(jià)，并用間接競(jìng)爭(zhēng)elisa法測(cè)定小鼠血清靈敏度，選擇效價(jià)、靈敏度均相對(duì)較高的血清對(duì)應(yīng)的小鼠進(jìn)行最后一次加強(qiáng)免疫，免疫劑量為之前量的2倍。
2.細(xì)胞融合
于最后一次加強(qiáng)免疫3天后，采用50％(重量百分?jǐn)?shù))的聚乙二醇即peg(分子量為1450)作融合劑，按常規(guī)方法進(jìn)行細(xì)胞融合，具體步驟：無(wú)菌條件下脫頸處死待融合小鼠，分離脾細(xì)胞，與鼠源骨髓瘤細(xì)胞sp2/0以5：1的個(gè)數(shù)比混合，用rpmi-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液洗混合細(xì)胞，1200rpm，離心5min。棄去上清，控干，加入1mlpeg，融合1分鐘，緩慢加入rpmi-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液，離心，棄上清，沉淀即為融合細(xì)胞，用20ml完全培養(yǎng)基重懸，將懸起的細(xì)胞加入到80ml半固體培養(yǎng)基中，混勻后加到6孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，2ml/孔，置于37℃二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
所述的含1％hat的細(xì)胞完全培養(yǎng)基含有20％(體積百分?jǐn)?shù))胎牛血清，75％(體積百分?jǐn)?shù))rpmi-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液，1％(重量百分?jǐn)?shù))l-谷氨酰胺，1％(體積百分?jǐn)?shù))hepes，1％(體積百分?jǐn)?shù))雙抗(10000單位每毫升青霉素和10000微克每毫升鏈霉素)，2％(體積百分?jǐn)?shù))生長(zhǎng)因子(hfcs)和1％(重量百分?jǐn)?shù))次黃嘌呤-氨基蝶嶺-胸腺嘧啶核苷即hat和甲基纖維素購(gòu)于sigma-aldrich公司。
3.細(xì)胞株的篩選及克隆
待細(xì)胞融合后2-3周，細(xì)胞集落長(zhǎng)至肉眼可見(jiàn)時(shí)，用微量移液器將克隆從培養(yǎng)基中挑出，轉(zhuǎn)移至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板采用hat液體培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)至2/3孔底時(shí)，吸取培養(yǎng)上清進(jìn)行檢測(cè)。采用兩步篩選法，第一步采用間接elisa方法，篩選出抗伏馬毒素而不抗載體蛋白bsa的陽(yáng)性孔；第二步采用間接競(jìng)爭(zhēng)elisa法對(duì)第一步篩選出的陽(yáng)性孔進(jìn)行檢測(cè)，用伏馬毒素b1作為競(jìng)爭(zhēng)原，選擇吸光值和靈敏度均較高的孔(吸光值較高指競(jìng)爭(zhēng)原為0的孔即陽(yáng)性對(duì)照孔的最終測(cè)定值較高，靈敏度較高指抑制率為50％時(shí)的競(jìng)爭(zhēng)原濃度亦ic50值較小)，采用有限稀釋法進(jìn)行亞克隆，亞克隆后采用同樣的兩步法進(jìn)行檢測(cè)，如此重復(fù)亞克隆4-5次后，獲得雜交瘤細(xì)胞株fm7a11。
抗伏馬毒素b1單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株fm7a11抗體可變區(qū)序列測(cè)定
(1)提取總rna：采用天根公司的總rna提取試劑盒并按照說(shuō)明書(shū)提取可產(chǎn)生雜交瘤細(xì)胞株fm7a11的總rna；
(2)合成cdna：以步驟1獲得的總rna為模板，oligo(dt)15為引物，按照superscripttm-2ii反轉(zhuǎn)錄酶說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成cdna第一鏈；引物oligo(dt)15由invitrogen購(gòu)得；
(3)pcr法克隆可變區(qū)基因：根據(jù)genbank中小鼠抗體基因序列的保守位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，以cdna為模版擴(kuò)增抗體重鏈、輕鏈可變區(qū)基因。pcr程序?yàn)椋?4℃30s、58℃45s、72℃1min，擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min。pcr產(chǎn)物經(jīng)過(guò)1％(重量百分?jǐn)?shù))的瓊脂糖凝膠電泳分離后，用試劑盒純化回收dna片段，連接在載體pmd18-t中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌dh5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽(yáng)性克隆，送至上海桑尼生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。其中引物的序列分別為：重鏈可變區(qū)引物為5’-caggtsmarctgmaggagtcwg-3’(22mer)和5’-caggggccagtggatagacagatggggg-3’(28mer),其中s、m、r和w為兼并堿基，m＝a/c，r＝a/g，s＝g/c，w＝a/t，輕鏈可變區(qū)引物為5’-gacatcaagatgacccagtctcca-3’(24mer)和5’-ccgttttatttccagcttggtccc-3’(24mer)。
得到的基因序列結(jié)果：重鏈可變區(qū)編碼基因序列長(zhǎng)379bp，序列如seqidno:1所示，根據(jù)所獲得的基因序列推導(dǎo)出該基因序列所編碼的重鏈可變區(qū)由126個(gè)氨基酸組成，序列如seqidno:3所示。輕鏈可變區(qū)編碼基因序列長(zhǎng)348bp,序列如seqidno:2所示，根據(jù)所獲得的基因序列推導(dǎo)出該基因序列所編碼的輕鏈可變區(qū)由116個(gè)氨基酸組成，序列如seqidno:4所示。
5.抗伏馬毒素b1單克隆抗體的制備純化、亞型和特性鑒定
將實(shí)施例1獲得的抗伏馬毒素b1單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株fm7a11注射預(yù)先用弗氏不完全佐劑處理過(guò)的balb/c小鼠，收集該小鼠的腹水，采用辛酸-硫酸銨法純化抗體，具體操作為：用雙層濾紙過(guò)濾小鼠腹水，4℃，12000r/min離心15min以上，吸取上清，將所得腹水上清與4倍體積的醋酸鹽緩沖液混合，攪拌下緩慢加入正辛酸，每毫升腹水所需的正辛酸體積為30-35μl，室溫混合30-60min，4℃靜置2h以上。12000r/min，4℃離心30min以上，棄沉淀，將得到的上清液用雙層濾紙過(guò)濾后，加入1/10濾液體積的摩爾濃度為0.1mol/l和ph為7.4的磷酸鹽緩沖液，用2mol/l的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)該混合液的ph至7.4，冰浴中緩慢加入硫酸銨至硫酸銨終濃度為0.277g/ml，4℃靜置2h以上，然后12000r/min，4℃離心30min以上，棄上清，將所得沉淀用原腹水體積1/10體積的摩爾濃度為0.01mol/l、ph為7.4的磷酸鹽緩沖液重懸，裝入透析袋，用0.01mol/lpbs透析兩天，再改用pb透析兩天，將透析袋中蛋白溶液取出，離心，收集上清，棄沉淀，放入-70℃預(yù)凍后放入凍干機(jī)中凍干。收集凍干粉，即為純化好的抗伏馬毒素b1單克隆抗體；
所述的醋酸鹽緩沖液為0.29g醋酸鈉，0.141ml醋酸加水定容到100ml所得；所述的0.01mol/l的磷酸鹽緩沖液為0.8g氯化鈉，0.29g十二水磷酸氫二鈉，0.02g氯化鉀，0.02g磷酸二氫鉀，加水定容到100ml所得；所述的0.1mol/l的磷酸鹽緩沖液為8g氯化鈉，2.9g十二水磷酸氫二鈉，0.2g氯化鉀，0.2g磷酸二氫鉀，加水定容到100ml所得。
用市售亞型鑒定試劑盒鑒定雜交瘤細(xì)胞株fm7a11分泌的抗伏馬毒素b1單克隆抗體的亞型為igg2b。
用常規(guī)非競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附法(elisa)測(cè)得小鼠腹水純化得到的抗體效價(jià)可達(dá)到3.2×105，即抗體稀釋3.2×105倍時(shí)溶液測(cè)定結(jié)果為陽(yáng)性。用常規(guī)間接競(jìng)爭(zhēng)elisa測(cè)定其對(duì)伏馬毒素b1靈敏度為0.32ng/ml。對(duì)伏馬毒素b2、b3的交叉反應(yīng)率為4.3％和12.8％。與黃曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、t-2毒素、赭曲霉毒素、嘔吐毒素的交叉反應(yīng)率均小于0.1％。
實(shí)例二：
伏馬毒素b1、黃曲霉毒素、赭曲霉毒素a和玉米赤霉烯酮復(fù)合免疫親和柱的制備
1.基質(zhì)制備
稱(chēng)取所需1gcnbr活化的瓊脂糖凝膠(sepharose)凍干基質(zhì)粉末(每克凍干基質(zhì)粉末可形成3.5ml終體積的溶脹基質(zhì))，溶于1mmol/lhcl中?；|(zhì)將會(huì)立即溶脹，然后置于燒結(jié)玻璃過(guò)濾器中使用1mmol/lhcl洗滌15min。
2.配體(抗體)偶聯(lián)
a使用偶聯(lián)緩沖液0.2mol/lnahco3ph8.3溶解待偶聯(lián)的上述伏馬毒素b1抗體、黃曲霉毒素抗體、赭曲霉毒素a抗體和玉米赤霉烯酮抗體，抗體濃度為12.5mg/ml，溶解的抗體置于冰浴中暫存。在一個(gè)帶蓋的可完全密封的容器中加入上述含有抗體的偶聯(lián)緩沖液。迅速將cnbr活化的sepharose轉(zhuǎn)移到抗體溶液中。室溫條件(20-25℃)下充分混勻上述的混和物2-4h。
b偶聯(lián)率的計(jì)算：2,000rpm離心，將sepharose離心至管底，將上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，測(cè)定上清液的蛋白質(zhì)含量值。計(jì)算偶聯(lián)率為98.5％(說(shuō)明偶聯(lián)很成功)。取離心至管底的sepharose，使用偶聯(lián)緩沖液進(jìn)行洗滌，除去多余的配體。
c封閉：轉(zhuǎn)移基質(zhì)至0.1mol/ltris-hcl緩沖液中。室溫條件下靜置2-4h，封閉所有殘留的活性基團(tuán)。
d為除去偶聯(lián)后未偶聯(lián)上的多余的配體，依次用ph值為4和8的緩沖液即0.1mol/l醋酸/醋酸鈉緩沖液和0.1mol/ltris-hcl緩沖液對(duì)基質(zhì)進(jìn)行洗滌，至少洗滌3個(gè)循環(huán)，每種緩沖液的使用量至少5倍基質(zhì)體積。每個(gè)洗滌循環(huán)步驟：先用0.1mol/l醋酸/醋酸鈉緩沖液洗滌，接著再用0.1mol/ltris-hcl緩沖液進(jìn)行洗滌。
e用5倍膠體積的0.01％nan3-pbs洗滌，并使用0.01％nan3-pbs保存。
3.裝柱使用結(jié)合緩沖液制備漿液，以75％沉降基質(zhì)和25％磷酸鹽緩沖液(ph7.0)的比例進(jìn)行混合。以連續(xù)性的操作向柱內(nèi)傾入漿液。使用一個(gè)斜靠在柱內(nèi)壁上的玻璃棒進(jìn)行填柱操作，將有助于減少氣泡的產(chǎn)生。填柱后，關(guān)閉親和柱下端的開(kāi)口，并取下親和柱的頂端部件。仔細(xì)操作，使用ph7.0的pbs緩沖液加入充填親和柱的余下部分，以在親和柱的頂端形成一個(gè)向上的彎液面。將頂端篩板以一定的角度插入到親和柱中，確保在篩板的下方?jīng)]有空氣。將篩板鎖定在基質(zhì)表面適當(dāng)?shù)奈恢蒙?，打開(kāi)親和柱下方的開(kāi)口，用5倍柱床體積的無(wú)菌過(guò)濾的0.01％nan3-pbs過(guò)柱，并使用0.01％nan3-pbs保存，至此伏馬毒素b1、黃曲霉毒素、赭曲霉毒素a和玉米赤霉烯酮親和柱已裝填并平衡完畢，可直接供使用。
實(shí)例三：大米中的伏馬毒素b1、黃曲霉毒素、赭曲霉毒素a和玉米赤霉烯酮的檢測(cè)
1.0大米中的伏馬毒素b1、黃曲霉毒素、赭曲霉毒素a和玉米赤霉烯酮的檢測(cè)。
大米添加回收實(shí)驗(yàn)，分別添加500μg/kg，1000μg/kg，2000μg/kg三個(gè)濃度梯度的伏馬毒素b1和10μg/kg，20μg/kg，50μg/kg三個(gè)濃度梯度的黃曲霉毒素b1、黃曲霉毒素b2、黃曲霉毒素g1、黃曲霉毒素g2、赭曲霉毒素a和玉米赤霉烯酮。每個(gè)實(shí)驗(yàn)做五組平行試驗(yàn)。
三個(gè)梯度：
第1個(gè)實(shí)驗(yàn)添加量：500μg/kg伏馬毒素b1、10μg/kg黃曲霉毒素b1、10μg/kg黃曲霉毒素b2、10μg/kg黃曲霉毒素g1、10μg/kg黃曲霉毒素g2、10μg/kg赭曲霉毒素a、10μg/kg玉米赤霉烯酮。
第2個(gè)實(shí)驗(yàn)添加量：1000μg/kg伏馬毒素b1、20μg/kg黃曲霉毒素b1、20μg/kg黃曲霉毒素b2、20μg/kg黃曲霉毒素g1、20μg/kg黃曲霉毒素g2、20μg/kg赭曲霉毒素a、20μg/kg玉米赤霉烯酮。
第3個(gè)實(shí)驗(yàn)添加量：2000μg/kg伏馬毒素b1、50μg/kg黃曲霉毒素b1、50μg/kg黃曲霉毒素b2、50μg/kg黃曲霉毒素g1、50μg/kg黃曲霉毒素g2、50μg/kg赭曲霉毒素a、50μg/kg玉米赤霉烯酮。
大米中伏馬毒素b1、黃曲霉毒素b1、黃曲霉毒素b2、黃曲霉毒素g1、黃曲霉毒素g2、赭曲霉毒素a和玉米赤霉烯酮的提取：
準(zhǔn)確稱(chēng)取經(jīng)過(guò)磨細(xì)(粒度小于2mm)的試樣20.0g于均質(zhì)機(jī)中，加入100ml乙腈/水/甲酸(80+18+2)，均質(zhì)高速攪拌提取2min。定量濾紙過(guò)濾，準(zhǔn)確移取5.0ml濾液并加入15.0mlph7.0pbs溶液稀釋?zhuān)貌ＡЮw維濾紙過(guò)濾1～2次，至濾液澄清。將復(fù)合免疫親和柱連接于10.0ml玻璃注射器下。準(zhǔn)確移取10.0ml樣品提取液注入玻璃注射器中，將空氣壓力泵與玻璃注射器連接，調(diào)節(jié)壓力使溶液以約6ml/min流速緩慢通過(guò)復(fù)合免疫親和柱，直至2～3ml空氣通過(guò)柱體。以10.0ml水淋洗柱子2次，棄去全部流出液，并使2ml～3ml空氣通過(guò)柱體。準(zhǔn)確加入1.0ml色譜級(jí)甲醇洗脫，流速為1ml/min～2ml/min，收集全部洗脫液于玻璃試管中，供檢測(cè)用。
2.0高效液相色譜-質(zhì)譜條件
a流動(dòng)相：a，0.05％甲酸/水溶液；b，0.05％甲酸/乙腈溶液
b梯度洗脫：0-3min,15％-50％b；4-5min,50％-70％b；6.5-8min,70％-100％b；8-10min,100％-50％b；10-11min,50％-15％b；11-15min,15％b.
c色譜柱：c-18柱(柱長(zhǎng)50mm，內(nèi)徑2.1mm，填料直徑1.7μm)
d流速：200μl/min
e各種毒素檢測(cè)的質(zhì)譜掃描參數(shù)如表1所示。
3.0定量
用進(jìn)樣器吸取不同濃度的伏馬毒素b1、黃曲霉毒素b1、黃曲霉毒素b2、黃曲霉毒素g1、黃曲霉毒素g2、赭曲霉毒素a和玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)工作液注入高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，在上述條件下測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰面積，繪制各種毒素的標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后利用外標(biāo)法標(biāo)算出各毒素的含量。
4.0結(jié)果
大米加標(biāo)回收率結(jié)果都在85-105％之間，rsd均小于10％。結(jié)果表明該方法完全滿足大米中伏馬毒素b1、黃曲霉毒素b1、黃曲霉毒素b2、黃曲霉毒素g1、黃曲霉毒素g2、赭曲霉毒素a和玉米赤霉烯酮檢測(cè)的分析要求。結(jié)果分別見(jiàn)表1-表7。
表1大米中伏馬毒素b1添加回收率結(jié)果
表2大米中黃曲霉毒素b1添加回收率結(jié)果
表3大米中黃曲霉毒素b2添加回收率結(jié)果
表4大米中黃曲霉毒素g1添加回收率結(jié)果
表5大米中黃曲霉毒素g2添加回收率結(jié)果
表6大米中赭曲霉毒素a添加回收率結(jié)果
表7大米中玉米赤霉烯酮添加回收率結(jié)果
實(shí)例四：食用油中的伏馬毒素b1、黃曲霉毒素b1、黃曲霉毒素b2、黃曲霉毒素g1、黃曲霉毒素g2、赭曲霉毒素a和玉米赤霉烯酮的檢測(cè)
1.0食用油中的伏馬毒素b1、黃曲霉毒素b1、黃曲霉毒素b2、黃曲霉毒素g1、黃曲霉毒素g2、赭曲霉毒素a和玉米赤霉烯酮的檢測(cè)
食用油加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，分別添加500μg/kg，1000μg/kg，2000μg/kg三個(gè)濃度梯度的伏馬毒素b1和10μg/kg，20μg/kg，50μg/kg三個(gè)濃度梯度的黃曲霉毒素b1、黃曲霉毒素b2、黃曲霉毒素g1、黃曲霉毒素g2、赭曲霉毒素a和玉米赤霉烯酮。每個(gè)實(shí)驗(yàn)做五組平行試驗(yàn)。
食用油中伏馬毒素b1、黃曲霉毒素b1、黃曲霉毒素b2、黃曲霉毒素g1、黃曲霉毒素g2、赭曲霉毒素a和玉米赤霉烯酮的提取：
植物油液態(tài)樣品提?。簻?zhǔn)確稱(chēng)取5.0g植物油試樣于50ml離心管中，加入15.0ml70％甲醇水溶液，漩渦混合器，振蕩混勻2min，5000r/min離心2min，移取10.0ml甲醇溶液層，用20.0ml水稀釋?zhuān)旌掀骰靹?，?jīng)玻璃纖維濾紙過(guò)濾，至濾液澄清。將復(fù)合免疫親和柱連接于10.0ml玻璃注射器下。準(zhǔn)確移取10.0ml樣品提取液注入玻璃注射器中，將空氣壓力泵與玻璃注射器連接，調(diào)節(jié)壓力使溶液以約6ml/min流速緩慢通過(guò)復(fù)合免疫親和柱，直至2～3ml空氣通過(guò)柱體。以10.0ml水淋洗柱子2次，棄去全部流出液，并使2ml～3ml空氣通過(guò)柱體。準(zhǔn)確加入1.0ml色譜級(jí)甲醇洗脫，流速為1ml/min～2ml/min，收集全部洗脫液于玻璃試管中，供檢測(cè)用。
2.0高效液相色譜-質(zhì)譜條件
a流動(dòng)相：a，0.05％甲酸/水溶液；b，0.05％甲酸/乙腈溶液
b梯度洗脫：0-3min,15％-50％b；4-5min,50％-70％b；6.5-8min,70％-100％b；8-10min,100％-50％b；10-11min,50％-15％b；11-15min,15％b.
c色譜柱：c-18柱(柱長(zhǎng)50mm，內(nèi)徑2.1mm，填料直徑1.7μm)
d流速：200μl/min
e各種毒素檢測(cè)的質(zhì)譜掃描參數(shù)如表1所示。
3.0定量
用進(jìn)樣器吸取不同濃度的伏馬毒素b1、黃曲霉毒素b1、黃曲霉毒素b2、黃曲霉毒素g1、黃曲霉毒素g2、赭曲霉毒素a和玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)工作液注入高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，在上述條件下測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰面積，繪制各種毒素的標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后利用外標(biāo)法標(biāo)算出各毒素的含量。
4.0結(jié)果
植物油添加回收率結(jié)果都在85-105％之間，rsd均小于10％。結(jié)果表明該方法完全滿足大米中伏馬毒素b1、黃曲霉毒素b1、黃曲霉毒素b2、黃曲霉毒素g1、黃曲霉毒素g2、赭曲霉毒素a和玉米赤霉烯酮檢測(cè)的分析要求。結(jié)果分別見(jiàn)表8-表14。
表8植物油中伏馬毒素b1添加回收率結(jié)果
表9植物油中黃曲霉毒素b1添加回收率結(jié)果
表10植物油中黃曲霉毒素b2添加回收率結(jié)果
表11植物油中黃曲霉毒素g1添加回收率結(jié)果
表12植物油中黃曲霉毒素g2添加回收率結(jié)果
表13植物油中赭曲霉毒素a添加回收率結(jié)果
表14植物油中玉米赤霉烯酮添加回收率結(jié)果
序列表
＜110＞中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所
＜120＞凈化伏馬毒素b1、黃曲霉毒素、赭曲霉毒素a、玉米赤霉烯酮免疫吸附劑及復(fù)合親和柱
＜160＞4
＜210＞1
＜211＞379bp
＜212＞dna
＜213＞小鼠
＜400＞1
caggtgcagctgaaggagtcaggacctggcctggtggcgccctcacagag50
cctgtccatcacttgcactgtctctgggctttcattaaccagctatggtg100
tacactgggttcgtcaggccccaggaaagggtctggagtggctgggagta150
atttggggtggtggaaacacaaattataattcggctctcatgtccagact200
gagcatcagcaaagacaactccaggagccaagttttcttaagaatgaaca250
gtctgcaaattgatgacacagccatgtactattgtgccagaggcaggatg300
gactactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcgtcagccaaaacgac350
acccccatctgtctatccactggcccctg379
＜210＞1
＜211＞348bp
＜212＞dna
＜213＞小鼠
＜400＞2
gacatcaagatgacccagtctccatcttccatgtatgcatctctaggaga50
aagagtcactatcacttgcaaggcgagtcaggacattagtagctatttag100
gctggttacagcagaaaccagggaaatctcctaagaccctgatctatcgt150
gcaaacacattggtagaaggggtcccatccagattcagtggcagtggatc200
tggggaagattattctctcaccatcagcagcctggagtatgaagatatgg250
gaatttattattgtctacagtatgatgagtttccgtacacgttcggaggg300
gggaccaagctggaaataaaacgggctgatgctgcaccaactgtatcc348
＜210＞1
＜211＞126
＜212＞prt
＜213＞小鼠
＜400＞3
glnvalglnleulysgluserglyproglyleuvalalaproser15
glnserleuserilethrcysthrvalserglyleuserleuthr30
sertyrglyvalhistrpvalargglnalaproglylysglyleu45
glutrpleuglyvaliletrpglyglyglyasnthrasntyrasn60
seralaleumetserargleuserileserlysaspasnserarg75
serglnvalpheleuargmetasnserleuglnileaspaspthr90
alamettyrtyrcysalaargglyargmetasptyrtrpglygln105
glythrservalthrvalserseralalysthrthrproproser120
valtyrproleualapro126
＜210＞1
＜211＞116
＜212＞prt
＜213＞小鼠
＜400＞4
aspilelysmetthrglnserprosersermettyralaserleu15
glygluargvalthrilethrcyslysalaserglnaspileser30
sertyrleuglytrpleuglnglnlysproglylysserprolys45
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serserleuglutyrgluaspmetglyiletyrtyrcysleugln90
tyraspglupheprotyrthrpheglyglyglythrlysleuglu105
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