本發(fā)明屬于藥物領(lǐng)域，具體涉及一種苯并五元雜環(huán)類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽、其制備方法、以及它們作為吲哚胺2，3-雙加氧酶1(IDO1)抑制劑的用途。

技術(shù)背景

色氨酸是人體細胞維持增殖和存活所必需的氨基酸，可用于蛋白質(zhì)、煙酸和5-羥色胺的生物合成。色氨酸一般從食物中攝取，超過95％色氨酸沿犬尿酸途徑代謝，余下的色氨酸在神經(jīng)系統(tǒng)和腸道中轉(zhuǎn)化5-羥色氨酸和5-羥色胺，或在松果體中合成褪黑素。吲哚胺2，3-雙加氧酶1(indoleamine 2，3-dioxygenase，IDO1)是人體肝臟外催化色氨酸沿犬尿氨酸途徑代謝的限速酶。IDO1在多種組織(如肺、腎、腦、胎盤、胸腺)以及多種細胞(如巨噬細胞和樹突狀細胞)中表達。IDO1通過氧化裂解色氨酸降低機體微環(huán)境中色氨酸的濃度，并且產(chǎn)生犬尿氨酸、3-羥基犬尿氨酸、2-氨基-3-羥基苯甲酸、喹啉酸等一系列代謝產(chǎn)物。細胞因子如IFN-γ、TNF-α、IL-1β和IL-6可誘導(dǎo)IDO1上調(diào)表達(Bernhardt R.Chem Rev，1996，96(1)：2841-2888)。

大量的證據(jù)表明，IDO1不僅可以催化色氨酸氧化代謝，而且還對機體的固有免疫和適應(yīng)性免疫具有重要的調(diào)節(jié)作用(Munn DH，et al.Trends Immunol，2013，34(3)：137-143)。IDO1主要是通過催化色氨酸代謝導(dǎo)致色氨酸耗竭及其代謝產(chǎn)物聚積來實現(xiàn)其對免疫系統(tǒng)的調(diào)控作用：一方面，色氨酸耗竭可通過激活GCN2通路誘導(dǎo)T細胞分裂周期滯留于G1期，從而抑制T細胞的增殖，同時還抑制初始CD4⁺T細胞分化成輔助性T細胞17(Th17)，進而產(chǎn)生免疫抑制(Munn DH，et al.Immunity，2005，22(5)：633-642)。另一方面，犬尿氨酸等色氨酸代謝產(chǎn)物具有細胞毒性，可以殺滅T細胞和自然殺傷(NK)細胞(Frumento G，et al.J Exp Med，2002，196(4)：459-468；Munn DH，et al.J Clin Invest，2004，114(2)：280-290)，而且這些代謝產(chǎn)物還可以通過激活芳香烴受體(AHR)來誘導(dǎo)CD4⁺T細胞分化成調(diào)節(jié)性T(Treg)細胞，并促進樹突狀細胞(DC)轉(zhuǎn)化成致耐受性DC(Mezrich JD，et al.J Immunol，2010，185(6)：3190-3198；Mezrich JD，et al.J Immunol，2008，181(8)：5396-5404)；此外，色氨酸代謝產(chǎn)物可通過下調(diào)NK細胞受體的表達來抑制NK細胞的功能，這些都可以進一步抑制機體的免疫反應(yīng)(Della Chiesa M，et al.Blood，2006，108(13)：4118-4125)。

IDO1與很多生理病理過程有關(guān)。研究表明，IDO1在宿主免疫防御和母胎免疫耐受等生理過程中發(fā)揮重要的免疫調(diào)節(jié)作用。機體在正常狀態(tài)下，IDO1表達水平較低，但在胎盤發(fā)育和炎癥反應(yīng)等生理性應(yīng)激中，細胞因子如IFN-γ分泌顯著增加，從而誘導(dǎo)IDO1表達上調(diào)，導(dǎo)致色氨酸耗竭和犬尿氨酸等代謝產(chǎn)物聚積，從而抑制母體的T細胞反應(yīng)，誘導(dǎo)母胎免疫耐受，確保胎兒不被母體的免疫系統(tǒng)排斥；宿主微環(huán)境中的色氨酸耗竭使其不能為病原微生物復(fù)制提供所必需的色氨酸，從而導(dǎo)致病原微生物死亡；與此同時IDO1介導(dǎo)的免疫抑制可以避免機體免疫系統(tǒng)的過度激活(Mellor AL，et al.Nat Rev Immunol，2008，8(1)：74-80；Terness P，et al.Am J Reprod Immunol，2007，58(3)：238-254；Divanovic S，et al.J Infect Dis，2012，205(1)：152-161)。當(dāng)給妊娠小鼠施用IDO1抑制劑后，會引起T細胞介導(dǎo)的胚胎排斥反應(yīng)，導(dǎo)致小鼠流產(chǎn)，表明IDO1可以使胎兒免于母體的排斥(Munn DH，et al.Science，1998，281(5380)：1191-1193)。IDO1對移植組織在新宿主中的存活也發(fā)揮免疫抑制作用(Radu CA，et al.Plast Reconstr Surg，2007，119(7)：2023-2028)。這些研究結(jié)果說明IDO是一種免疫調(diào)節(jié)酶，參與機體的免疫耐受。

眾多研究表明，IDO1介導(dǎo)的免疫耐受與腫瘤免疫逃逸、病毒感染、神經(jīng)變性疾病、器官移植排斥、自身免疫性疾病、神經(jīng)精神疾病和白內(nèi)障等疾病的密切相關(guān)(Munn DH，et al.Trends Immunol，2013，34(3)：137-143；Nguyen NT，et al.Front Immunol，2014，5：551；Myint AM，et al.J Affect Disord，2007，98(1-2)：143-151；Mailankot M，et al.Lab Invest，2009，89(5)：498-512)。在這些疾病中，過度表達的IDO1所介導(dǎo)的色氨酸耗竭及其代謝產(chǎn)物的聚積可以抑制T細胞的激活，導(dǎo)致機體的免疫耐受。

在病毒感染的小鼠模型中，給予IDO1抑制劑可明顯促進CD8⁺T細胞的增殖，恢復(fù)T細胞的免疫應(yīng)答，抑制病毒感染宿主的單核巨噬細胞。在流感病毒感染時，過度表達的IDO1介導(dǎo)的免疫抑制作用易導(dǎo)致肺部發(fā)生二次感染(van der Sluijs KF，et al.J Infect Dis，2006，193(2)：214-222)。在HIV感染時，IDO1會被上調(diào)表達，促進Treg細胞的增殖，而抑制Th17細胞的增殖，造成Tregs/Th17細胞比例失調(diào)，導(dǎo)致患者的免疫抑制(Favre D，et al.Sci Transl Med，2010，2(32)：32ra36)。此外，IDO1介導(dǎo)的色氨酸耗竭及其代謝產(chǎn)物濃度升高還與寄生蟲感染有關(guān)(Knubel CP，et al.FASEB J，2010，24(8)：2689-2701)。

研究表明，IDO1催化的色氨酸代謝產(chǎn)物如犬尿氨酸和喹啉酸等具有神經(jīng)毒性，并且這些代謝產(chǎn)物與神經(jīng)變性疾病如記憶障礙癥、阿爾茨海默病(AD)、認知障礙癥、老年癡呆癥、帕金森病、帕金森綜合癥和運動障礙性疾病的發(fā)生密切相關(guān)(Malpass K.Nat Rev Neurol，2011，7(8)：417；Maddison DC，et al.Semin Cell Dev Biol，2015，40：134-141)。在AD患者大腦中IDO1表達和喹啉酸濃度均高于正常人，其中在老年斑周圍的小膠質(zhì)細胞和星形細胞中含量最高。此外，在AD患者血液中的色氨酸濃度低于正常人，而犬尿氨酸濃度則高于正常人，而且兩者的比例高低與患者的認識缺陷程度密切相關(guān)(Guillemin GJ，et al.Neuropathol Appl Neurobiol，2005，31(4)：395-404；Widner B，et al.Adv Exp Med Biol，1999，467：133-138)。神經(jīng)精神疾病如抑郁癥、精神分裂癥、焦慮癥也與IDO1過度表達和犬尿氨酸等代謝產(chǎn)物水平升高有關(guān)。IDO1的過度表達造成色氨酸耗竭，從而減少用于合成神經(jīng)遞質(zhì)5-羥色胺的色氨酸的量，導(dǎo)致5-羥色胺缺乏，再加上具有神經(jīng)毒性的犬尿氨酸和喹啉酸等代謝產(chǎn)物的聚積，共同促進神經(jīng)精神疾病的發(fā)生，而且是多種心境障礙的因素(Myint AM.FEBS J，2012，279(8)：1375-1385)。因此，抑制IDO1是神經(jīng)變性疾病和神經(jīng)精神疾病患者的重要治療策略。

IDO1高表達所介導(dǎo)的色氨酸過度代謝也存在于各種自身免疫性疾病中(Nguyen NT，et al.Front Immunol，2014，5：551)。在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者滑膜關(guān)節(jié)組織的DCs高表達IDO1，患者血清中色氨酸濃度降低，而犬尿氨酸濃度升高(Zhu L，et al.J Immunol，2006，177(11)：8226-8233；Ozkan Y.et al.Clin Rheumatol，2012，31(1)：29-34)。在系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者中也存在IDO1過度表達和色氨酸代謝增強的現(xiàn)象?；颊哐逯械纳彼釢舛冉档停x產(chǎn)物犬尿酸濃度和犬尿氨酸和色氨酸比值均明顯升高(Widner B，et al.Immunobiology，2000，201(5)：621-630)。因此，抑制IDO1也是自身免疫性疾病患者重要的治療策略。

大量的研究表明，IDO1誘導(dǎo)的免疫抑制在腫瘤免疫逃逸中起重要的作用。IDO1過度表達于各類腫瘤細胞及其微環(huán)境中的細胞如DC和基質(zhì)細胞，導(dǎo)致腫瘤局部色氨酸耗竭和色氨酸代謝產(chǎn)物聚積，從而誘導(dǎo)腫瘤免疫逃逸，幫助腫瘤細胞逃避機體免疫系統(tǒng)的攻擊(Munn DH，et al.Trends Immunol，2016，37(3)：193-207)。Uyttenhove小組利用免疫組織化學(xué)標記方法在黑色素瘤、肺癌、乳腺癌、胃癌、結(jié)腸癌、膀胱癌、胰腺癌、淋巴癌、前列腺癌、腎癌、腦癌、頭頸癌、卵巢癌、宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌、間皮瘤、甲狀腺癌、食管癌和肝癌等24種人類腫瘤細胞中檢測到了IDO1的表達(Uyttenhove C，et al.Nat Med，2003，9(10)：1269-1274)。隨后在卵巢癌、黑色素瘤、肺癌、白血病等腫瘤組織中進一步得到證實，并且發(fā)現(xiàn)腫瘤組織內(nèi)IDO1的表達量與腫瘤的惡性程度關(guān)系密切，并且影響腫瘤患者的預(yù)后(Théate I，et al.Cancer Immunol Res，2015，3(2)：161-172；Curti A，et al.Blood，2007，109(7)：2871-2877；de Jong RA，et al.Int J Gynecol Cancer，2011，21(7)：1320-1327；Okamoto A，et al.Clin Cancer Res，2005，11(16)：6030-6039；Ino K，et al.Br J Cancer，2006，95(11)：1555-1561；Speeckaert R，et al.Eur.J.Cancer，2012，48(13)：2004-2011)。IDO1抑制劑可以激活T細胞，克服由IDO1介導(dǎo)的腫瘤免疫逃逸，而且還可以提高其它腫瘤治療劑的療法(Koblish HK，et al.Mol Cancer Ther，2010，9(2)：489-498；Wainwright DA，et al.Clin Cancer Res，2014，20(20)：5290-5301)。

多項臨床前和臨床研究表明，IDO1抑制劑可以降低色氨酸代謝和犬尿氨酸等代謝產(chǎn)物的聚積，從而逆轉(zhuǎn)IDO1介導(dǎo)的免疫抑制，恢復(fù)T細胞和NK細胞的增殖和功能，抑制Treg細胞的增殖，從而增強機體的免疫應(yīng)答，因此IDO1抑制劑可用于治療由IDO1介導(dǎo)的免疫抑制所引起的上述相關(guān)疾病，包括癌癥、病毒感染、神經(jīng)變性疾病、白內(nèi)障、器官移植排斥、抑郁癥和自身免疫性疾病。此外，IDO1抑制劑還可以和其它化療劑、靶向抗腫瘤藥物、免疫檢查點治療劑、抗腫瘤疫苗、抗病毒劑、抗病毒疫苗、細胞因子療法、過繼性細胞免疫治療和放射治療聯(lián)合作用，起到協(xié)同或增強療法的作用(Vacchelli E，et al.Oncoimmunology，2014，3(10)：e957994；Jochems C，et al.Oncotarget，2016，7(25)：37762-37772；Liu X，et al.Blood，2010，115(17)：3520-3530；Zamarin D，et al.Pharmacol Ther，2015，150：23-32)。

目前正在開發(fā)IDO1小分子抑制劑用來治療或預(yù)防上述與IDO1相關(guān)的疾病。例如，在CN102164902B中報道了噁二唑類IDO1抑制劑，涉及通過施用IDO1抑制劑或與其它治療劑聯(lián)合使用來治療癌癥、病毒感染、神經(jīng)變性疾病、創(chuàng)傷、年齡相關(guān)的白內(nèi)障、器官移植排斥或自身免疫性疾病患者。

基于IDO1與癌癥、病毒感染、神經(jīng)變性疾病、白內(nèi)障、器官移植排斥、自身免疫性疾病和抑郁癥等多種疾病的發(fā)病機制密切相關(guān)，因此可以采用IDO1抑制劑來抑制IDO1的活性，從而降低色氨酸代謝以及犬尿氨酸等代謝產(chǎn)物的聚積，恢復(fù)機體的免疫功能，進而達到治療上述疾病的目的。本發(fā)明所述的化合物具有IDO1抑制活性，可以用于治療IDO1介導(dǎo)的免疫抑制所引起的相關(guān)疾病，包括癌癥、病毒感染、神經(jīng)變性疾病、白內(nèi)障、器官移植排斥、自身免疫性疾病和抑郁癥。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供了一種苯并五元雜環(huán)類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽、其制備方法、藥物組合物及應(yīng)用。本發(fā)明的化合物具有良好的IDO1抑制活性，可以用于治療和/或預(yù)防IDO1介導(dǎo)的免疫抑制所引起的各種相關(guān)疾病。

本發(fā)明提供了通式(I)所示的苯并五元雜環(huán)化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽：

其中：

α和β代表一個單鍵或雙鍵；當(dāng)α為單鍵時，β為雙鍵；當(dāng)α為雙鍵時，β為單鍵；

A代表C、O、S、NH或N；

B代表O、S或NH₂；

R₁代表氫、鹵素、硝基、羥基、氰基、氨基或C₁-C₁₀烷基；

R₂代表氫、C₁-C₄烷基、C₁-C₁₀烷基C(O)R₃、-C(O)NR₄R₅、-C(O)R₃、C₆-C₁₀芳基、(C₁-C₅)烷基(C₆-C₁₀)芳基、C₁-C₁₀芳雜環(huán)基或-(C₁-C₅)烷基(C₁-C₁₀)芳雜環(huán)基；其中所述的芳雜環(huán)基團可任選地包含一個或多個選自O(shè)、S或N的其它雜原子；所述的烷基、芳基或芳雜環(huán)基可任選地被下述相同或不相同的取代基單取代至五取代，所述的取代基選自：氫、鹵素、羥基、甲氧基或R₃；

R₃、R₄、R₅可以相同或不同，代表氫、C₁-C₈烷基、C₃-C₆環(huán)烷基、C₆-C₁₀芳基、-(C₁-C₅)烷基(C₆-C₁₀)芳基、C₁-C₁₀芳雜環(huán)基或(C₁-C₅)烷基(C₁-C₁₀)芳雜環(huán)基；其中所述的芳雜環(huán)基團可任選地包含一個或多個選自O(shè)、S或N的其它雜原子；所述的烷基、芳基或芳雜環(huán)基可任選地被下述相同或不相同的取代基單取代至五取代，所述的取代基選自：氫、鹵素、羥基或甲氧基。

進一步地，具有通式(I)所示的苯并五元雜環(huán)類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，其特征在于：

α和β代表一個單鍵或雙鍵；當(dāng)α為單鍵時，β為雙鍵；當(dāng)α為雙鍵時，β為單鍵；

A代表O、NH或N；

B代表O或NH₂；

R₁代表氫、鹵素、硝基、羥基或氨基；

R₂代表氫、C₁-C₄烷基、C₁-C₁₀烷基C(O)R₃、-C(O)NR₄R₅、-C(O)R₃、C₆-C₁₀芳基、-(C₁-C₅)烷基(C₆-C₁₀)芳基、C₁-C₁₀芳雜環(huán)基或-(C₁-C₅)烷基(C₁-C₁₀)芳雜環(huán)基；其中所述的芳雜環(huán)基團可任選地包含一個或多個選自O(shè)、S或N的其它雜原子；所述的烷基、芳基或芳雜環(huán)基可任選地被下述相同或不相同的取代基單取代至五取代，所述的取代基選自：氫、鹵素、羥基、甲氧基或R₃；

R₃、R₄、R₅可以相同或不同，代表氫、C₁-C₈烷基、C₃-C₆環(huán)烷基、C₆-C₁₀芳基、(C₁-C₅)烷基(C₆-C₁₀)芳基、C₁-C₁₀芳雜環(huán)基或(C₁-C₅)烷基(C₁-C₁₀)芳雜環(huán)基；其中所述的芳雜環(huán)基團可任選地包含一個或多個選自O(shè)、S或N的其它雜原子；所述的烷基、芳基或芳雜環(huán)基可任選地被下述相同或不相同的取代基單取代至五取代，所述的取代基選自：氫、鹵素、羥基或甲氧基。

進一步地，具有通式(I)所示的苯并五元雜環(huán)類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，其特征在于：

α和β代表一個單鍵或雙鍵；當(dāng)α為單鍵時，β為雙鍵；當(dāng)α為雙鍵時，β為單鍵；

A代表O、NH或N；

B代表O或NH₂；

R₁代表氫、氯、氟、硝基或氨基；

R₂任選自：

具體來說，通式(I)所示的苯并五元雜環(huán)類化合物優(yōu)選自下列化合物：

下面藥理實驗中涉及的化合物代號等同于此處代號所對應(yīng)的化合物。

本發(fā)明還提供了通式(I)所示化合物的制備方法，其特征在于：

a)當(dāng)A為O，B為O時，通式(I)所示化合物的制備方法為：不同取代的鄰氨基苯酚與CDI發(fā)生縮合反應(yīng)制得中間體1，1與不同取代的α-氯代苯乙酮反應(yīng)制得2a-f，2a-f經(jīng)硼氫化鈉還原制得3a-f；1與不同取代的芳烷基氯反應(yīng)制得4a-j，4i被還原制得5；1與不同的酰氯反應(yīng)制得6a-c；1與不同胺類化合物反應(yīng)制得7a-c；其合成路線如下：

其中，R₁和R₂的定義如前所述；

b)當(dāng)A為NH，B為O時，通式(I)所示化合物的制備方法為：2-苯并咪唑酮與α-氯代-4′-氟苯乙酮反應(yīng)制得8，8經(jīng)硼氫化鈉還原制得9；其合成路線如下：

其中，R₁和R₂的定義如前所述；

c)當(dāng)A為N，B為NH₂時，通式(I)所示化合物的制備方法為：1H-2-氨基苯并咪唑經(jīng)Boc保護制得10，10與酰氯反應(yīng)制得11，11脫去Boc取代基制得12；其合成路線如下：

其中，R₁和R₂的定義如前所述。

所述通式(I)化合物的藥學(xué)上可接受的鹽可通過一般的化學(xué)方法合成。

一般情況下，鹽的制備可以通過游離堿或酸與等化學(xué)當(dāng)量或過量酸(無機酸或有機酸)或堿(無機堿或有機堿)在合適的溶劑或溶劑組合物中反應(yīng)制得。

本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，其由治療上有效量的活性組分和藥學(xué)上可接受的輔料組成；所述的活性組分包括通式(I)化合物和其藥學(xué)上可接受的鹽中的一種或多種。所述藥物組合物中，所述的輔料包括藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑和/或賦形劑。

根據(jù)治療目的可將藥物組合物制成各種類型的給藥單位劑型，如片劑、丸劑、粉劑、液體、懸浮液、乳液、顆粒劑、膠囊、栓劑和針劑(溶液和懸浮液)等，優(yōu)選片劑、膠囊、液體、懸浮液、和針劑(溶液和懸浮液)。

為了使片劑、丸劑或栓劑形式的藥物組合物成形，可使用本領(lǐng)域任何已知并廣泛使用的賦形劑。

為了制備針劑形式的藥物組合物，可將溶液或懸浮液消毒后(最好加入適量的氯化鈉，葡萄糖或甘油)，制成與血液等滲壓的針劑。在制備針劑時，也可以使用本領(lǐng)域內(nèi)任何常用的載體。例如：水、乙醇、丙二醇、乙氧基化的異硬脂醇、聚氧基化的異硬脂醇和聚乙烯脫水山梨醇的脂肪酸酯等。此外，還可以加入通常溶解劑和緩沖劑等。

本發(fā)明所述的組合物在藥物組合物中的含量無特殊限制，可在很寬的范圍內(nèi)進行選擇，通?？蔀橘|(zhì)量百分比的5～95％，優(yōu)先為質(zhì)量百分比的30～85％。

本發(fā)明所述的藥物組合物的給藥方法沒有特殊限制?？筛鶕?jù)患者年齡、性別和其它條件及癥狀，選擇各種劑型的制劑給藥。

本發(fā)明另外提供了所述通式(I)化合物、其藥學(xué)上可接受的鹽或所述藥物組合物在制備吲哚胺2，3-雙加氧酶1(IDO1)抑制劑中的應(yīng)用。所述的IDO1抑制劑用于治療IDO1介導(dǎo)的免疫抑制的相關(guān)疾病患者，所述的相關(guān)疾病包括癌癥、病毒感染、神經(jīng)變性疾病、白內(nèi)障、器官移植排斥、抑郁癥和自身免疫性疾病。

本發(fā)明還提供了所述通式(I)化合物、其藥學(xué)上可接受的鹽或所述藥物組合物在制備藥物中的用途，所述藥物用于治療患者的癌癥、病毒感染、神經(jīng)變性疾病、白內(nèi)障、器官移植排斥、抑郁癥或自身免疫性疾病。

所述的癌癥包括但不限于：惡性黑色素瘤、肺癌、乳腺癌、胃癌、結(jié)腸癌、膀胱癌、胰腺癌、淋巴癌、白血病、前列腺癌、睪丸癌、腎癌、腦癌、頭頸癌、卵巢癌、宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌、間皮瘤、甲狀腺癌、肝癌和食管癌中的一種或多種。

所述的病毒感染包括但不限于：由人類免疫缺陷病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、流感病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、巨細胞病毒、柯薩奇病毒、人類乳頭狀瘤病毒、愛潑斯坦-巴爾病毒和水痘-帶狀皰疹病毒中的一種或多種引起的感染。

所述的神經(jīng)變性疾病包括但不限于：記憶障礙癥、阿爾茨海默病、認知障礙癥、老年癡呆癥、帕金森病、帕金森綜合癥和運動障礙性疾病中的一種或多種。

所述的自身免疫性疾病包括但不限于：類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、皮肌炎、硬皮病、結(jié)節(jié)性脈管炎、多發(fā)性硬化癥、腎病、重癥肌無力、混合性結(jié)締組織病、銀屑病、肝病、內(nèi)分泌相關(guān)疾病和由于感染引起的自身免疫反應(yīng)中的一種或多種。

本發(fā)明還提供了所述通式(I)化合物、其藥學(xué)上可接受的鹽或所述藥物組合物可以和一種或多種其它種類的治療劑和/或治療方法聯(lián)合用于治療由IDO1介導(dǎo)的相關(guān)疾病。

所述其它種類的治療劑和/或治療方法包括但不限于：化療劑、靶向抗腫瘤藥物、免疫檢查點共抑制分子的抑制劑、免疫檢查點共刺激分子的激動劑、抗腫瘤疫苗、抗病毒劑、抗病毒疫苗、細胞因子療法、過繼性細胞免疫治療或放射治療。

所述的化療劑包括但不限于：烷化劑、微管蛋白抑制劑、拓撲酶抑制劑、鉑類藥物、抗代謝類藥物或激素類抗腫瘤藥物。

所述的靶向抗腫瘤藥物包括但不限于：蛋白激酶抑制劑、蛋白酶體抑制劑、異檸檬酸脫氫酶抑制劑、基于表觀遺傳學(xué)的抗腫瘤藥物或細胞周期信號通路抑制劑。

所述的免疫檢查點抑制劑包括但不限于：CTLA-4抑制劑、PD-1抑制劑、PD-L1抑制劑、PD-L2抑制劑、TIM-3抑制劑、VISTA抑制劑、LAG3抑制劑、TIGIT抑制劑、A2AR抑制劑或VTCN1抑制劑。

所述的免疫檢查點激動劑包括但不限于：STING激動劑、4-1BB激動劑、OX40激動劑、RORγ激動劑或ICOS激動劑。

具體實施方式

為了進一步闡明本發(fā)明，下面給出一系列實施例，這些實施例完全是例證性的，它們僅用來對本發(fā)明具體描述，不應(yīng)當(dāng)理解為對本發(fā)明的限制。

實施例1

2-苯并惡唑啉酮(1a)的合成

將鄰氨基苯酚(1.00g，9.16mmol)和CDI(1.78g，10.99mmol)用30mL無水DMF溶解，氮氣保護，80℃下反應(yīng)5h，降至室溫，加水(10mL)淬滅反應(yīng)，乙酸乙酯(3×7mL)萃取，分別用飽和氯化銨和飽和食鹽水洗滌有機層，無水硫酸鎂干燥，柱層析分離(石油醚∶乙酸乙酯＝7∶1)，得淡紅色固體1.10g，收率89％，mp 137-141℃。¹H NMR(300MHz，Chloroform-d)δ9.81(s，1H)，8.00-6.85(m，4H).

3-(4-氟苯乙酮基)-2-苯并惡唑啉酮(2a)的合成

將2-苯并惡唑啉酮(0.10g，0.74mmol)和碳酸鉀(0.31g，2.22mmol)用10mL DMF混合，80℃下反應(yīng)1h，隨后將溫度降至60℃，加入α-氯代-4′-氟苯乙酮(0.38g，2.22mmol)，反應(yīng)3h，降至室溫，加入飽和氯化銨溶液(10mL)淬滅反應(yīng)，乙酸乙酯萃取(3×7mL)，飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鎂干燥，柱層析分離(石油醚∶乙酸乙酯＝10∶1)，得淡黃色固體0.17g，收率83％，mp 148-150℃。ESI-MS：294.1[M+Na]⁺；¹H NMR(300MHz，Chloroform-d)δ8.08(ddd，J＝9.0，5.2，2.1Hz，2H)，7.39-6.96(m，5H)，6.85(dq，J＝4.8，3.3，2.1Hz，1H)，5.22(d，J＝2.0Hz，2H).IR(KBr)：3074，1763，1694，1601，1487，1232cm^-1.

實施例2

3-(4-氯苯乙酮基)-2-苯并惡唑啉酮(2b)的合成

參照目標化合物2a的合成方法，以2-苯并惡唑啉酮與α-氯代-4′-氯苯乙酮為原料制得，收率85％，mp 193-195℃。ESI-MS：288.6[M+H]⁺；¹H NMR(300MHz，Chloroform-d)δ8.14-7.86(m，2H)，7.53(d，J＝8.0Hz，2H)，7.40-7.05(m，3H)，6.86(s，1H)，5.23(d，J＝3.1Hz，2H).IR(KBr)：3065，1763，1691，1587，1487，1246cm^-1.

實施例3

3-(3-氯苯乙酮基)-2-苯并惡唑啉酮(2c)的合成

參照目標化合物2a的合成方法，以2-苯并惡唑啉酮與α-氯代-3′-氯苯乙酮為原料制得，收率85％，mp 150-152℃。ESI-MS：288.6[M+H]⁺；¹H NMR(300MHz，Chloroform-d)δ8.34-7.84(m，2H)，7.83-7.43(m，2H)，7.42-7.07(m，3H)，7.02-6.76(m，1H)，5.23(qd，J＝8.4，4.9，4.3Hz，2H).IR(KBr)：3071，1722，1683，1601，1512，1229cm^-1.

實施例4

5-氯-2-苯并惡唑啉酮(1b)的合成

參照1a的合成方法，以4-氯-2-氨基苯酚為原料制得，收率87％，mp 189-193℃。¹H NMR(300MHz，Chloroform-d)δ8.87(s，1H)，7.28(d，J＝1.8Hz，1H)，7.13(dp，J＝8.0，2.1Hz，2H).

5-氯-3-(4-氟苯乙酮基)-2-苯并惡唑啉酮(2d)的合成

參照目標化合物2a的合成方法，以1b與α-氯代-4′-氟苯乙酮為原料制得，收率89％，mp 153-155℃。ESI-MS：306.7[M+H]⁺；¹H NMR(300MHz，Chloroform-d)δ8.08(d，J＝7.4Hz，2H)，7.20(dd，J＝30.4，9.8Hz，4H)，6.85(s，1H)，5.20(s，2H).IR(KBr)：3076，1771，1690，1599，1487，1232cm^-1.

實施例5

5-氯-3-(4-氯苯乙酮基)-2-苯并惡唑啉酮(2e)的合成

參照目標化合物2a的合成方法，以1b與α-氯代-4′-氯苯乙酮為原料制得，收率87％，mp 167-169℃。ESI-MS：323.1[M+H]⁺；¹H NMR(300MHz，Chloroform-d)δ8.05-7.93(m，2H)，7.60-7.50(m，2H)，7.24-7.12(m，2H)，6.85(d，J＝2.0Hz，1H)，5.21(s，2H).IR(KBr)：3067，1772，1719，1589，1485，1246cm^-1.

實施例6

5-氯-3-(3-氯苯乙酮基)-2-苯并惡唑啉酮(2f)的合成

參照目標化合物2a的合成方法，以1b與α-氯代-3′-氯苯乙酮為原料制得，收率87％，mp 134-136℃。ESI-MS：323.1[M+H]⁺；¹H NMR(300MHz，Chloroform-d)δ7.97(d，J＝27.1Hz，2H)，7.68(s，1H)，7.54(s，1H)，7.17(d，J＝10.9Hz，2H)，6.84(s，1H)，5.22(s，2H).IR(KBr)：3067，1778，1703，1614，1487，1223cm^-1.

實施例7

3-(2-(4-氟苯基)-2-羥基)乙基-2-苯并惡唑啉酮(3a)的合成

將目標化合物2a(0.10g，0.37mmol)用10mL無水四氫呋喃溶解，冰浴下加入硼氫化鈉(0.04g，1.11mmol)，冰浴下反應(yīng)1h，加入10mL飽和氯化銨淬滅，乙酸乙酯萃取(3×7mL)，無水硫酸鎂干燥，柱層析純化(石油醚∶乙酸乙酯＝5∶1)，得白色固體0.10g，收率99％，mp 111-113℃。ESI-MS：274.3[M+H]⁺；¹H NMR(300MHz，Chloroform-d)δ7.89(s，1H)，7.53-7.37(m，2H)，7.26-6.86(m，5H)，5.79(t，1H)，4.41(t，1H)，4.10(t，1H).IR(KBr)：3645，3071，1722，1601，1512，1229，1103cm^-1.

實施例8

3-(2-(4-氯苯基)-2-羥基)乙基-2-苯并惡唑啉酮(3b)的合成

參照目標化合物3a合成方法，以2b為原料制得，收率99％，mp 140-142℃。ESI-MS：290.7[M+H]⁺；¹H NMR(300MHz，Chloroform-d)δ7.36(q，J＝7.5，6.4Hz，4H)，7.15(dq，J＝14.1，6.9Hz，3H)，6.99(d，J＝7.0Hz，1H)，5.14(s，1H)，3.95(d，J＝10.8Hz，2H)，3.06(s，1H).IR(KBr)：3645，3063，1748，1593，1485，1240，1090cm^-1.

實施例9

3-(2-(3-氯苯基)-2-羥基)乙基-2-苯并惡唑啉酮(3c)的合成

參照目標化合物3a合成方法，以2c為原料制得，收率99％，mp 113-115℃。ESI-MS：290.7[M+H]⁺；¹H NMR(300MHz，Chloroform-d)δ7.52-7.42(m，1H)，7.28(d，J＝2.2Hz，3H)，7.20-7.05(m，3H)，7.01(dd，J＝7.9，1.7Hz，1H)，5.11(dd，J＝8.2，4.0Hz，1H)，4.13-3.83(m，3H)，3.54(s，1H).IR(KBr)：3646，3063，1759，1599，1485，1240，1103cm^-1.

實施例10

5-氯-3-(2-(4-氟苯基)-2-羥基)乙基-2-苯并惡唑啉酮(3d)的合成

參照目標化合物3a合成方法，以2d為原料制得，收率99％，mp 142-144℃。ESI-MS：308.7[M+H]⁺；¹H NMR(300MHz，Chloroform-d)δ7.42(dd，J＝8.4，5.3Hz，2H)，7.18-6.87(m，5H)，5.14(dd，J＝8.4，3.7Hz，1H)，4.17-3.79(m，2H)，2.94(s，1H).IR(KBr)：3646，3089，1771，1607，1485，1223，1096cm^-1.

實施例11

5-氯-3-(2-(4-氯苯基)-2-羥基)乙基-2-苯并惡唑啉酮(3e)的合成

參照目標化合物3a合成方法，以2e為原料制得，收率99％，mp 127-129℃。ESI-MS：325.1[M+H]⁺；¹H NMR(300MHz，Chloroform-d)δ7.42-7.32(m，4H)，7.09(d，J＝1.1Hz，1H)，7.08(s，1H)，7.03(dd，J＝1.8，0.8Hz，1H)，5.12(dd，J＝8.3，3.6Hz，1H)，3.99(dd，J＝14.6，3.6Hz，1H)，3.87(dd，J＝14.5，8.3Hz，1H)，2.97(s，1H).IR(KBr)：3626，3063，1767，1614，1485，1252，1092cm^-1.

實施例12

5-氯-3-(2-(3-氯苯基)-2-羥基)乙基-2-苯并惡唑啉酮(3f)的合成

參照目標化合物3a合成方法，以2f為原料制得，收率99％，mp 157-159℃。ESI-MS：325.1[M+H]⁺；¹H NMR(300MHz，Chloroform-d)δ7.45(dq，J＝1.6，0.9Hz，1H)，7.43-7.37(m，2H)，7.37-7.31(m，1H)，7.16-7.05(m，2H)，6.95(d，J＝8.5Hz，1H)，5.74(t，J＝8.3Hz，1H)，4.38(t，J＝8.9Hz，1H)，4.01(dd，J＝9.1，7.9Hz，1H).IR(KBr)：3647，3078，1728，1599，1506，1261，1099cm^-1.

實施例13

3-苯乙基-2-苯并惡唑啉酮(4a)的合成

將2-苯并惡唑啉酮(0.10g，0.74mmol)和碳酸鉀(0.31g，2.22mmol)用10mL DMF混合，80℃下反應(yīng)1h，隨后將溫度降至60℃，加入β-溴代苯乙烷(0.41g，2.22mmol)，反應(yīng)6h，降至室溫，加入10mL飽和氯化銨溶液淬滅反應(yīng)，乙酸乙酯萃取(3×7mL)，飽和食鹽水洗有機層，無水硫酸鎂干燥，柱層析(石油醚∶乙酸乙酯＝10∶1)，得白色固體0.15g，收率86％，mp 116-118℃。ESI-MS：240.3[M+H]⁺；¹H NMR(300MHz，Chloroform-d)δ7.29(d，J＝7.7Hz，3H)，7.20(s，3H)，7.10(t，J＝5.9Hz，2H)，6.79(d，J＝7.1Hz，1H)，4.06(t，J＝7.4Hz，2H)，3.08(t，J＝7.2Hz，2H).IR(KBr)：3061，1767，1614，1489，1258cm^-1.

實施例14

3-(3-氟芐基)-2-苯并惡唑啉酮(4b)的合成

參照目標化合物4a合成方法，以1a和3-氟氯芐制得，收率88％，mp 119-121℃。ESI-MS：244.2[M+H]⁺；¹H NMR(300MHz，DMSO-d₆)δ7.48-7.31(m，2H)，7.30-6.86(m，6H)，5.12-4.86(m，2H).IR(KBr)：3042，1757，1589，1487，1252cm^-1.

實施例15

3-(4-氯芐基)-2-苯并惡唑啉酮(4c)的合成

參照目標化合物4a合成方法，以1a和4-氯氯芐制得，收率87％，mp 145-147℃。ESI-MS：260.7[M+H]⁺；¹H NMR(300MHz，Chloroform-d)δ7.57-7.25(m，4H)，7.23(s，1H)，7.18-7.01(m，2H)，6.95-6.74(m，1H)，5.26-4.79(m，2H).IR(KBr)：3005，1771，1597，1485，1275cm^-1.

實施例16

5-氯-3-苯乙基-2-苯并惡唑啉酮(4d)的合成

參照目標化合物4a合成方法，以1b和β-溴代苯乙烷制得，收率88％，mp 102-104℃。ESI-MS：274.7[M+H]⁺；¹H NMR(300MHz，Chloroform-d)δ7.36-7.24(m，3H)，7.24-7.15(m，2H)，7.14-6.99(m，2H)，6.67(d，J＝2.0Hz，1H)，4.03(t，J＝7.3Hz，2H)，3.06(t，J＝7.3Hz，2H).IR(KBr)：3057，1759，1610，1485，1246cm^-1.

實施例17

5-氯-3-(3-氟芐基)-2-苯并惡唑啉酮(4e)的合成

參照目標化合物4a合成方法，以1b和3-氟氯芐制得，收率92％，mp 134-136℃。ESI-MS：278.7[M+H]⁺；¹H NMR(300MHz，Chloroform-d)δ7.36(q，J＝11.9，9.7Hz，1H)，7.22-6.92(m，5H)，6.81(d，J＝14.5Hz，1H)，4.96(d，J＝9.4Hz，2H).IR(KBr)：3065，1772，1589，1506，1256cm^-1.

實施例18

5-氯-3-(4-氯芐基)-2-苯并惡唑啉酮(4f)的合成

參照目標化合物4a合成方法，以1b和4-氯氯芐制得，收率91％，mp 122-124℃。ESI-MS：295.1[M+H]⁺；¹H NMR(300MHz，Chloroform-d)δ7.32(q，J＝8.1Hz，4H)，7.23-6.97(m，3H)，6.90-6.73(m，1H)，4.95(s，2H).IR(KBr)：3067，1767，1601，1483，1252cm-1.

實施例19

5-氟-2-苯并惡唑啉酮(1c)的合成

參照1a的合成方法，由4-氟-2-氨基苯酚為原料制得，收率90％，mp 174-176℃。¹H NMR(300MHz，Chloroform-d)δ9.60(s，1H)，7.13(dd，J＝8.7，4.2Hz，1H)，6.93-6.68(m，2H).

5-氟-3-(3-氟芐基)-2-苯并惡唑啉酮(4g)的合成

參照目標化合物4a合成方法，以1c與3-氟氯芐制得，收率88％，mp 156-158℃。¹H NMR(300MHz，Chloroform-d)δ(ppm)7.37(td，J＝8.3，5.6Hz，1H)，7.23-7.11(m，2H)，7.06(dd，J＝10.2，4.0Hz，2H)，6.83(td，J＝9.2，2.6Hz，1H)，6.59(dd，J＝7.7，2.6Hz，1H)，5.00(s，2H).MS(EI)m/z 262.1[M+H]+.IR(KBr)：3063，1765，1591，1487，1250cm^-1.

實施例20

5-氟-3-(4-氯芐基)-2-苯并惡唑啉酮(4h)的合成

參照目標化合物4a合成方法，以1c與4-氯氯芐制得，收率82％，mp 103-105℃。¹H NMR(300MHz，Chloroform-d)δ(ppm)7.46-7.21(m，4H)，7.13(dd，J＝8.8，4.2Hz，1H)，6.79(td，J＝9.2，2.6Hz，1H)，6.57(dd，J＝7.6，2.6Hz，1H)，4.94(s，2H).MS(EI)m/z 278.2[M+H]⁺.IR(KBr)：3061，1778，1614，1489，1250cm^-1.

實施例21

5-硝基-3-(3-氟芐基)-2-苯并惡唑啉酮(4i)的合成

參照目標化合物4a合成方法，以5-硝基-2-苯并惡唑啉酮與3-氟氯芐制得，收率81％，mp 116-118℃。¹H NMR(300MHz，Chloroform-d)δ(ppm)8.42(d，J＝1.8Hz，1H)，8.10(dd，J＝7.5，2.0Hz，1H)，7.40(d，J＝7.5Hz，1H)，7.35-7.25(m，2H)，7.19(dt，J＝8.7，1.8Hz，1H)，6.97(ddt，J＝8.9，6.8，2.3Hz，1H)，5.56(d，J＝1.3Hz，2H).MS(EI)m/z 289.1[M+H]⁺.IR(KBr)：3065，1792，1614，1506，1261cm^-1.

實施例22

5-硝基-3-(4-氯芐基)-2-苯并惡唑啉酮(4j)的合成

參照目標化合物4a合成方法，以5-硝基-2-苯并惡唑啉酮與4-氯氯芐制得，收率77％，mp 165-167℃。¹H NMR(300MHz，Chloroform-d)δ(ppm)8.14(dd，J＝8.8，2.3Hz，1H)，7.76(d，J＝2.3Hz，1H)，7.48-7.29(m，5H)，5.05(s，2H).MS(EI)m/z 303.1[M-H]⁺.IR(KBr)：3080，1784，1595，1522，1260cm^-1.

實施例23

5-氨基-3-(3-氟芐基)-2-苯并惡唑啉酮(5)的合成

將4i(0.10g，0.35mmol)用10mL工業(yè)乙醇溶解，氯化銨(0.19g，3.47mmol)溶解于2mL水加入反應(yīng)體系。冰浴冷卻下緩慢加入鋅粉(0.23g，3.47mmol)，冰浴反應(yīng)1h恢復(fù)至室溫反應(yīng)2h，除去乙醇，乙酸乙酯萃取，無水硫酸鎂干燥，柱層析分離(石油醚∶乙酸乙酯＝5∶1)，得淡黃色固體0.70g，收率78％，mp 179-181℃。¹H NMR(300MHz，Chloroform-d)δ(ppm)7.29(d，J＝21.3Hz，2H)，7.10(d，J＝7.7Hz，1H)，7.03-6.96(m，2H)，6.37(dd，J＝8.5，2.4Hz，1H)，6.15(d，J＝2.2Hz，1H)，4.92(s，2H)，3.59(s，2H).MS(EI)m/z 257.1[M-H]⁺.IR(KBr)：3356，3048，1746，1591，1489，1254cm^-1.

實施例24

3-(2-(4-氟苯基)乙?；?-2-苯并惡唑啉酮(6a)的合成

將1a(0.10g，0.74mmol)用10mL無水四氫呋喃溶解，加入三乙胺(0.22g，2.22mmol)縛酸，冰浴下滴加對氟苯乙酰氯的無水四氫呋喃溶液(0.15g，0.89mmol)，滴畢將反應(yīng)液溫度升至室溫，再加熱至70℃，反應(yīng)6h，加10mL水淬滅反應(yīng)，乙酸乙酯萃取(3×7mL)。柱層析純化(石油醚∶乙酸乙酯＝10∶1)，得白色固體0.17g，收率86％，mp 180-182℃。ESI-MS：272.2[M+H]⁺；¹H NMR(300MHz，DMSO-d₆)δ7.98-7.89(m，1H)，7.50-7.41(m，1H)，7.41-7.28(m，4H)，7.24-7.14(m，2H)，4.41(s，2H).IR(KBr)：3067，1796，1721，1601，1514，1248cm^-1.

實施例25

3-苯甲酰基-2-苯并惡唑啉酮(6b)的合成

參照目標化合物6a的合成方法，以1a與苯甲酰氯為原料制得，收率89％，mp 185-187℃。ESI-MS：240.2[M+H]⁺；¹H NMR(300MHz，DMSO-d₆)δ7.95-7.85(m，2H)，7.84-7.75(m，1H)，7.67(t，J＝7.4Hz，1H)，7.53(t，J＝7.6Hz，2H)，7.49-7.42(m，1H)，7.40-7.26(m，2H).IR(KBr)：3069，1805，1697，1599，1481，1250cm^-1.

實施例26

5-氯-3-(2-(4-氟苯基)乙?；?-2-苯并惡唑啉酮(6c)的合成

參照目標化合物6a的合成方法，以1b與對氟苯乙酰氯為原料制得，收率87％，mp193-195℃。ESI-MS：306.7[M+H]⁺；¹H NMR(300MHz，Chloroform-d)δ7.99(d，J＝8.2Hz，2H)，7.56(d，J＝8.0Hz，2H)，7.35-6.99(m，2H)，6.85(s，1H)，3.51(s，2H).IR(KBr)：3063，1755，1715，1611，1485，1246cm^-1.

實施例27

3-(4-甲氧芐基)氨甲?；?2-苯并惡唑啉酮(7a)的合成

將固體光氣(0.22g，0.74mmol)用5mL無水二氯甲烷溶解，冰浴下滴加2-苯并惡唑啉酮(0.10g，0.74mmol)和三乙胺(0.30g，2.96mmol)的無水二氯甲烷溶液(5mL)，滴畢立即氮氣保護，室溫下攪拌1h后，冰浴下滴加對甲氧基芐胺(0.15g，1.11mmol)和三乙胺(0.11g，1.11mmol)的無水二氯甲烷溶液(5mL)，室溫下反應(yīng)3h，加10mL飽和氯化銨淬滅，二氯甲烷萃取(3×7mL)，無水硫酸鎂干燥，柱層析(石油醚∶乙酸乙酯＝7∶1)，得白色固體0.18g，收率83％，mp 82-84℃。ESI-MS：299.4[M+H]⁺；¹H NMR(300MHz，DMSO-d₆)δ8.56(s，1H)，7.89(d，1H)，7.43(s，1H)，7.41-7.25(m，4H)，6.90(d，2H)，4.45(d，2H)，3.73(s，3H).IR(KBr)：3266，3009，2951，2870，1761，1722，1612，1514，1275，1260，1034cm^-1.

實施例28

5-氯-3-(3-甲氧芐基)氨甲?；?2-苯并惡唑啉酮(7b)的合成

參照目標化合物7a的合成方法，以1b與固體光氣、鄰甲氧基芐胺為原料制得，收率90％，mp 120-122℃。ESI-MS：333.7[M+H]⁺；¹H NMR(300MHz，Chloroform-d)δ8.37(s，1H)，8.15(d，1H)，7.33-7.16(m，3H)，6.97-6.84(m，3H)，4，60(d，2H)，3.83(s，3H).IR(KBr)：3354，3048，1771，1724，1601，1477，1265，1252，1042cm^-1.

實施例29

5-氯-3-(4-甲氧苯基)氨甲?；?2-苯并惡唑啉酮(7c)的合成

參照目標化合物7a的合成方法，以1b與固體光氣、對甲氧基苯胺為原料制得，收率86％，mp 162-164℃。ESI-MS：319.7[M+H]⁺；¹H NMR(300MHz，DMSO-d₆)δ9.85(s，1H)，7.89(d，J＝2.3Hz，1H)，7.53(dd，J＝8.8，2.4Hz，3H)，7.41-7.28(m，2H)，7.22-7.07(m，2H)，7.03-6.79(m，3H)，3.77(s，3H)，3.35(s，1H).IR(KBr)：3291，3036，2957，2866，1784，1734，1609，1477，1246，1182，1034cm^-1.

實施例30

1-(2-(4-氟苯基)-2羰乙基)-1，3-二氫-2H-苯并[d]咪唑-2-酮(8)的合成

參照目標化合物2a合成方法，以2-苯并咪唑酮和α-氯代-4′-氟苯乙酮為原料制得，產(chǎn)率78％，mp 280-282℃.¹H NMR(300MHz，Chloroform-d)δ(ppm)8.22-8.03(m，2H)，7.43-7.31(dd，J＝7.9，1.5Hz，1H)，7.26-7.14(m，3H)，7.12-7.06(td，J＝7.6，1.5Hz，1H)，7.05-6.97(td，J＝7.6，1.5Hz，1H)，5.61(s，2H).MS(EI)m/z 273.3[M+H]⁺.IR(KBr)：3323，3018，1687，1520，1439cm^-1.

1-(2-(4-氟苯基)-2-羥乙基)-1，3-二氫-2H-苯并[d]咪唑-2-酮(9)的合成

參照目標化合物3a合成方法，以8為原料制得產(chǎn)率73％，mp 276-278℃.¹H NMR(300MHz，Chloroform-d)δ(ppm)7.49-7.43(m，2H)，7.39-7.35(m，1H)，7.13-7.07(m，3H)，7.06-7.01(td，J＝7.6，1.5Hz，1H)，7.00-6.96(dd，J＝7.8，1.5Hz，1H)，5.25-5.17(d，J＝6.4Hz，1H)，5.14-5.07(m，1H)，4.38-4.27(d，J＝4.9Hz，2H).MS(EI)m/z 273.3[M+H]⁺.IR(KBr)：3570，3343，3028，1670，1521，1449cm^-1.

實施例31

叔丁基(1H-苯并[d]咪唑-2-基)氨基甲酸酯(10)的合成

1H-2-氨基苯并咪唑(2.00g，15.02mmol)的THF(30mL)溶液中加入Boc₂O(3.61g，16.52mmol)和TEA(3.04g，30.04mmol)，然后在60℃下攪拌3h，冷卻至室溫，除去溶劑.石油醚洗滌得到白色固體粗產(chǎn)物10(3g，85.62％)，直接用于下一步反應(yīng)。

叔丁基(1-(2-(4-氟苯基)乙?；?-1H-苯并[d]咪唑-2-基)氨基甲酸酯(11)的合成

參照目標化合物6a合成方法，以10為原料制得，產(chǎn)率53％，mp 310-312℃.¹H NMR(300MHz，Chloroform-d)δ(ppm)8.53(s，1H)，7.92-7.80(m，1H)，7.76-7.64(dd，J＝7.7，1.4Hz，1H)，7.41-7.21(m，4H)，7.11-6.99(m，2H)，4.04-3.88(t，J＝1.0Hz，2H)，1.46(s，9H).MS(EI)m/z 370.4[M+H]⁺.IR(KBr)：3353，3038，1680，1531，1423，1370cm^-1.

1-(2-氨基-1H-苯并[d]咪唑-1-基)-2-(4-氟苯基)乙烷(12)的合成

冰浴下向含有11(0.5g，1.35mmol)的二氧六環(huán)(5mL)溶液中緩慢滴加HCl溶液(4M HCl，6.8mL)，室溫攪拌2h，將白色固體過濾，二氧六環(huán)洗滌得到鹽酸鹽，解離后得到12(0.26g，71.33％)，mp 237-239℃.¹H NMR(300MHz，Chloroform-d)δ(ppm)7.84-7.69(m，2H)，7.36-7.22(m，4H)，7.14-7.02(m，2H)，6.15-6.08(d，J＝5.9Hz，1H)，6.06-6.00(d，J＝5.9Hz，1H)，4.03-3.93(t，J＝1.0Hz，2H).MS(EI)m/z 270.2[M+H]⁺.IR(KBr)：3356，3148，3048，1646，1591，1419cm^-1.

實施例32

1.基于Hela細胞的IDO1抑制活性測試

1.1實驗材料和主要儀器

1.2實驗方法

從ATCC購買的Hela細胞保存在最低基礎(chǔ)培養(yǎng)基(2mM L-谷氨酰胺和調(diào)成含有1.5g/L碳酸氫鈉、0.1mM非必需氨基酸、1mM丙銅酸鈉和10％胎牛血清的Earle氏BSS)中。在37℃下將Hela細胞保存在提供5％CO₂的控濕培養(yǎng)箱中。

按5×10³/孔的密度將Hela細胞接種在96孔培養(yǎng)板中，并培養(yǎng)過夜。第二天，將IFN-γ(終濃度100ng/mL)和化合物的系列稀釋液(總體積200μL培養(yǎng)基)加給細胞。溫育24小時后將140μL上清液/孔移至新的96孔板中，加入10μL 6.1mol/L的三氯乙酸，在恒溫烘箱中50℃溫育30min以使產(chǎn)生的N-甲?；虬彼崴鉃槿虬彼帷Ｈ缓笠?000rpm將反應(yīng)混合物離心10min以去除沉淀物。將100μL上清液/孔移至另一96孔板中，與等體積2％(w/v)對-二甲氨基苯甲醛的乙酸溶液混合。使用酶標儀在480nm處檢測吸光值，所得結(jié)果利用IC₅₀計算器計算。實驗設(shè)3個復(fù)孔。

1.3實驗結(jié)果

實驗結(jié)果如表1所示。結(jié)果表明，本發(fā)明化合物對IDO1的活性具有顯著的抑制作用。其中，化合物4f的活性最強(IC₅₀：6.08μM)。

表1本發(fā)明化合物對IDO1的抑制活性

2.T淋巴細胞的增殖實驗

2.1實驗方法

B16F1細胞處理：吸去培養(yǎng)基(高糖DMEM，10％FBS)，PBS洗1-2次。加入0.25％胰酶消化。吸去胰酶，加入培養(yǎng)基，將細胞吹打下來，轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管中，離心，吸去上清，加入1mL DMEM培養(yǎng)基重新懸浮細胞。加入絲裂霉素C(終濃度25μg/ml)，吹打混勾，37℃，水浴30min，RP1640洗3次，細胞計數(shù)，待用。

脾臟細胞的制備：取C57/BL6小鼠，摘眼球放血處死，無菌取出脾臟放入含有2mL無菌的預(yù)冷RPMI 1640培養(yǎng)基的35mm的培養(yǎng)皿中，用5mL注射器針芯輕輕將脾細胞擠出。再加入2mL培養(yǎng)基，用5mL移液管反復(fù)吹打直至懸液均勻。將細胞懸液用70μm濾器過濾，300g離心5min(4℃)。棄上清后脾細胞加入10mL Tris-NH₄Cl，吹均，靜置2-3min，300g離心5min(4℃)，去除紅細胞。棄上清后，再用PRMI 1640洗滌兩次，待用。

1)將處理過的B16F1細胞2×10⁴個/孔(剌激細胞)，脾臟淋巴細胞1×10⁶個/孔(反應(yīng)細胞)，加入96孔板，加入RP1640(10％FBS)，補齊至200μL。

2)分組：給藥組(剌激細胞+反應(yīng)細胞+對應(yīng)化合物)，空白對照(只加反應(yīng)細胞)，模型組(剌激細胞+反應(yīng)細胞)，除空白對照外，其他組均加入ConA(終濃度5μg/ml)，置于37℃、濕度95％、5％CO₂的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)48h。

3)加入20μL MTT(終濃度4mg/ml)培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4h，酶標儀測定570nm波長處吸光度值；計算T淋巴細胞增殖率：

T淋巴細胞增殖率(％)＝[給藥孔(T淋巴細胞+B16F1細胞+IDO1抑制劑)OD值一對照孔(T淋巴細胞+B16F1細胞)OD值]/對照孔(T淋巴細胞+B16F1細胞)OD值×100％

2.2實驗結(jié)果

在混合淋巴細胞反應(yīng)體系中，B16F1細胞高表達IDO1，對T淋巴細胞的增殖能夠產(chǎn)生抑制作用。當(dāng)加入化合物4e、4f和6c(3倍IC₅₀濃度)培養(yǎng)48h后，利用MTT檢測T淋巴細胞的增殖，增殖率為29.96％、52.25％和27.22％，說明化合物4e、4f和6c能顯著增加T淋巴細胞的增殖。

3.對調(diào)節(jié)性T淋巴細胞的影響

3.1實驗方法

將處理過的B16F1細胞(8×10⁴個孔)，脾臟淋巴細胞(106個孔，使用5μg/mL的ConA刺激)加入24孔板中，加入對應(yīng)濃度的化合物后置于37℃、濕度95％、5％CO₂的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h；收集上清液測試ELISA，使用抗CD4、抗CD25、抗FOCP3抗體染色，在流式細胞儀中檢測T細胞的分化。

3.2實驗結(jié)果

當(dāng)原始T淋巴細胞與黑色素瘤細胞株B16F1共培養(yǎng)時，調(diào)節(jié)性T淋巴細胞的數(shù)量和僅含原始T淋巴細胞的實驗組(5.1％)相比上升了2倍(11.7％)。當(dāng)化合物4e、4f和6c(3倍IC₅₀濃度)加入體系中后能夠明顯逆轉(zhuǎn)了這種效應(yīng)(分別下降為6.0％、8.7％和7.1％)，說明化合物4e、4f和6c能夠通過抑制IDO1逆轉(zhuǎn)原始T淋巴細胞向調(diào)節(jié)性T淋巴細胞的轉(zhuǎn)化。

4.對IDO1表達的影響

4.1實驗方法

Hela細胞以2×10⁵每孔的密度種于6孔板培養(yǎng)，于37℃，5％CO₂條件下培養(yǎng)12h?？瞻讓φ?只加培養(yǎng)基)，模型組(加入IFN-γ、對應(yīng)陽性藥)，藥物處理組(加入IFN-γ、對應(yīng)化合物)，于37℃，5％CO₂條件下培養(yǎng)24h，收集細胞，Western blot檢測IDO1表達。

4.2實驗結(jié)果

實驗結(jié)果表明，化合物4e、4f和6c不影響Hela細胞中IDO1的表達，說明化合物4e、4f和6c是通過抑制IDO1的活性來逆轉(zhuǎn)IDO1介導(dǎo)的免疫抑制。