本發(fā)明涉及天然色素分離技術(shù)領(lǐng)域，具體地，涉及辣椒紅素及其制備方法。

背景技術(shù)：

辣椒紅素是天然紅素的一種，不僅色價(jià)高，安全無(wú)毒，無(wú)任何辣味，其顯色強(qiáng)度為其它色素的10倍，而且具有抗癌美容的功效，因此被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化妝品和兒童玩具等領(lǐng)域。辣椒紅素是目前國(guó)際上公認(rèn)的優(yōu)質(zhì)天然紅素，是作為食品添加劑的首選。聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織(FAO)和世界衛(wèi)生組織(WHO)已將辣椒紅素列為A類色素，在使用中不加以限量。

辣椒紅素的提取方法很多，但是對(duì)于辣椒紅素的分離純化綜合研究的不是很深入。分離純化方法是獲得高純度辣椒紅素的關(guān)鍵步驟，目前的分離純化方法普遍比較復(fù)雜，所需的實(shí)驗(yàn)條件以及實(shí)驗(yàn)用品等都比較苛刻，或?qū)υO(shè)備的要求高，在生產(chǎn)實(shí)際中難以推廣，或?qū)苯芳t素品質(zhì)有較大的影響，或?qū)苯芳t素分離純化過(guò)程帶來(lái)較大困難等。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

解決上述問(wèn)題所采用的技術(shù)方案是辣椒紅素及其制備方法。

本發(fā)明提供的一種辣椒紅素的制備方法，包括以下步驟：

提取辣椒油脂的步驟：將干紅辣椒粉經(jīng)丙酮在80℃水浴加熱條件下提取，提取時(shí)間為5h，得到辣椒油脂；

第一次硅膠柱層析的步驟：采用丙酮和石油醚為洗脫劑進(jìn)行洗脫，按顏色的不同分別收集洗脫液，獲得前期洗脫液、中期洗脫液、后期洗脫液；

第二次硅膠柱層析的步驟；將前期洗脫液、中期洗脫液、后期洗脫液分別采用洗脫劑進(jìn)行二次洗脫，獲得不同顏色的洗脫液。

優(yōu)選的，所述的洗脫劑為丙酮和石油醚的混合物，其中，兩者的體積比V_丙酮:V_石油醚＝1:5。

優(yōu)選的，所述前期洗脫液在第二次層析洗脫時(shí)按顏色的不同分別收集洗脫液，獲得2段收集洗脫液。

優(yōu)選的，所述中期洗脫液在第二次層析洗脫時(shí)按顏色的不同分別收集洗脫液，獲得7段收集洗脫液。

優(yōu)選的，所述后期洗脫液在第二次層析洗脫時(shí)按顏色的不同分別收集洗脫液，獲得5段收集洗脫液。

優(yōu)選的，收集洗脫液采用薄層層析法進(jìn)行分析，其中，展開(kāi)劑為丙酮和石油醚的混合物，其中，兩者的體積比V_丙酮:V_石油醚＝1:5。

本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種辣椒紅素，所述的辣椒紅素是采用以上所述辣椒紅素的制備方法制備的。

本發(fā)明提供的一種辣椒紅素及其制備方法，通過(guò)丙酮提取獲得了辣椒油脂，并選擇合適洗脫劑和展開(kāi)劑對(duì)辣椒油脂進(jìn)行分離和分析；通過(guò)兩次柱層析獲得了純品辣椒紅素。初步實(shí)現(xiàn)了辣椒紅素的規(guī)?；蛛x。

附圖說(shuō)明

圖1是實(shí)施例1辣椒油油脂的薄層層析圖；

圖2是實(shí)施例1辣椒油油脂經(jīng)不同配比的洗脫劑洗脫的色譜柱顏色分布；

圖3是實(shí)施例1 V_丙酮:V_石油醚＝1:5洗脫后對(duì)應(yīng)的薄層板顯色圖樣和辣椒油油脂的薄層樣板；

圖4是實(shí)施例1 V_丙酮:V_石油醚＝1:1洗脫后對(duì)應(yīng)的薄層板顯色圖樣和辣椒油油脂的薄層樣板

圖5是實(shí)施例1前期洗脫液的二級(jí)分離圖樣；

圖6是實(shí)施例1前期洗脫液經(jīng)二級(jí)分離后的收集液；

圖7是實(shí)施例1前期洗脫液經(jīng)二級(jí)分離后(1)(2)號(hào)洗脫液對(duì)應(yīng)的薄層板顯色圖樣和一級(jí)分離的前期洗脫液的薄層層析樣板；

圖8是實(shí)施例1中期洗脫液的二級(jí)分離圖樣；

圖9是實(shí)施例1中期洗脫液經(jīng)二級(jí)分離的收集液；

圖10是實(shí)施例1中期洗脫液二級(jí)分離后收集液的(1)-(7)號(hào)洗脫液對(duì)應(yīng)的薄層板顯色圖樣；

圖11是實(shí)施例1后期洗脫液的柱層析圖樣；

圖12是實(shí)施例1后期洗脫液經(jīng)二級(jí)分離后的收集液；

圖13是實(shí)施例1后期洗脫液二級(jí)分離后收集液的(1)-(5)號(hào)洗脫液對(duì)應(yīng)的薄層板顯色圖樣和一級(jí)分離的后期洗脫液的薄層層析樣板。

具體實(shí)施方式

為使本領(lǐng)域技術(shù)人員更好地理解本發(fā)明的技術(shù)方案，下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。

實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備

1展開(kāi)劑的配制

由于之前我們?cè)谧霰訉游鎏骄窟^(guò)辣椒紅素和辣椒堿類物質(zhì)分離最適展開(kāi)劑為V_丙酮:V_石油醚＝1:5，所以我們現(xiàn)在配制展開(kāi)劑時(shí)也按照此種比例配制。

2洗脫劑的配制

由展開(kāi)劑V_丙酮:V_石油醚＝1:5來(lái)配制洗脫劑得到相同比例的展開(kāi)劑，檢測(cè)該比例是否適合柱層析，而且在此基礎(chǔ)上加一組對(duì)照組：實(shí)驗(yàn)組V_丙酮:V_石油醚＝1:5、對(duì)照組V_丙酮:V_石油醚＝1:1。

3顯色劑的配制

層析完而未處理的硅膠板上，只顯示辣椒紅素類物質(zhì)的顏色紅色，顯色劑的作用是使辣椒堿類物質(zhì)遇顯色劑變?yōu)槠渌伾阌趨^(qū)分辣椒紅素和辣椒堿。顯色劑選用改良碘化鉍鉀試劑。辣椒堿類物質(zhì)遇改良碘化鉍鉀試劑顯示不同程度的綠色。改良碘化鉍鉀試劑配制方法如下：

溶液1：0.85g堿式硝酸鉍溶于10mL冰醋酸和40mL水。

溶液2：8.00g碘化鉀溶于20mL水。

儲(chǔ)存液溶液1和溶液2等量混合(置棕色瓶中可長(zhǎng)期保存)。

顯色時(shí)將1ml儲(chǔ)存液與2ml冰醋酸和10ml水混合，用前配制。

4.薄層層析方法

制硅膠板：取硅膠G(薄層層析用)9.00g于研缽中，加20mL水?dāng)噭虿⒄{(diào)成稀糊狀，用潔凈的長(zhǎng)吸管將稀糊吸至已烘干的潔凈載玻片(25.40mm×76.20mm)上，手晃搖勻，使薄層均勻且無(wú)氣泡，厚度約0.25-1mm，晾干，再置于烘箱中110℃活化0.5h，冷卻后于干凈密封袋中密封備用。

點(diǎn)樣：將樣品用毛細(xì)管分別點(diǎn)在玻璃板一端距邊沿1cm處位置，點(diǎn)樣間隔1-1.5cm，斑點(diǎn)擴(kuò)散成1-2mm為宜。點(diǎn)樣時(shí)使毛細(xì)管液體輕輕接觸薄層即可，切勿點(diǎn)樣過(guò)重致使薄層破壞。

展開(kāi)：在層析缸內(nèi)加入展開(kāi)劑V丙酮:V石油醚＝1:5，將薄層板點(diǎn)有樣點(diǎn)的一端放入，距展開(kāi)劑液面上方約0.5cm，使樣點(diǎn)展開(kāi)。

記錄色素分離情況：待展開(kāi)劑前沿距薄層板上端約1cm時(shí)，取出用鉛筆畫(huà)出前沿位置，晾干，拍照并記錄辣椒色素斑點(diǎn)離底線的距離及其顏色差異情況。計(jì)算各色素斑點(diǎn)的Rf值。

顯色：向薄層板輕噴顯色劑，防止薄層被吹起脫落玻璃板。放置幾分鐘后即可顯出綠色斑點(diǎn)，拍照并記錄綠色斑點(diǎn)離底線的距離及其顏色差別。計(jì)算各色素斑點(diǎn)的Rf值。

5.柱層析方法

制硅膠柱：本實(shí)驗(yàn)采用濕法裝柱。一級(jí)分離和二級(jí)分離的柱層析制柱方法除了選用的硅膠目數(shù)有差異外，其余步驟和方法相同。一級(jí)分離柱層析選用的硅膠為100-200目，二級(jí)分離選用的硅膠為200-300目。具體步驟如下：取硅膠20.00g于燒杯中，加約25ml洗脫劑(洗脫劑用量為完全浸沒(méi)硅膠以上)攪拌約2min，待硅膠與洗脫劑混合完全后；關(guān)閉玻璃層析柱下端活塞，將濾斗放置在玻璃層析柱上端，將混合溶液沿著濾斗慢慢傾倒入柱內(nèi)，邊倒邊用玻璃棒攪拌，使得硅膠更多的進(jìn)入柱內(nèi)，并用少量洗脫劑潤(rùn)洗；打開(kāi)活塞，讓洗脫液留下，用干凈錐形瓶收集洗脫液；在此過(guò)程中，可用橡膠管輕輕敲打柱壁，使硅膠沉降加快，并可趕走柱內(nèi)少量氣泡；最后用玻璃棒檢測(cè)沉降是否完全。

上樣：確定硅膠柱很結(jié)實(shí)后，取樣品，由于樣品呈稠裝液體，需用少量洗脫劑溶解均勻；在加樣前保證洗脫劑液面略高于硅膠柱面，用膠頭滴管取2ml辣椒油油脂溶液，沿著柱的內(nèi)壁旋轉(zhuǎn)加入樣品，保證樣品在柱內(nèi)分布均勻；這樣使得樣品在同一水平面上向下洗脫，并用少量洗脫劑清洗柱壁。

洗脫：待柱內(nèi)的樣品基本進(jìn)入硅膠柱內(nèi)后，可開(kāi)始大量加入洗脫劑，保持洗脫劑液面始終高于硅膠柱面約5cm，保證層析柱下端流速一定，便于后面收集。加入洗脫劑的原則是用膠頭滴管沿柱內(nèi)壁慢慢加入，勿過(guò)快而破壞硅膠柱表面。

收集：待層析柱下端有有色液體出來(lái)開(kāi)始用玻璃刻度離心管收集，按照色譜柱的顏色順序先后分別收集洗脫液，并測(cè)量各種洗脫液體積，待洗脫液基本呈無(wú)色停止收集，并將收集液分別編號(hào)。

檢測(cè)：由于所收集的洗脫液濃度太低，在做薄層層析檢測(cè)時(shí)會(huì)帶來(lái)困難，所以在檢測(cè)之前需要對(duì)樣品進(jìn)行濃縮。將收集好的洗脫液置于90℃水浴鍋上水浴加熱濃縮，并在已經(jīng)做好了的薄層硅膠板上點(diǎn)樣，同樣用V_丙酮:V_石油醚＝1:5作為展開(kāi)劑進(jìn)行薄層層析，通過(guò)比較Rf值大小及差值檢測(cè)樣品的分離效果。

實(shí)施例1

1.辣椒油脂的提取

將辣椒粉、組裝脂肪測(cè)定儀提取瓶、提取筒、稱量用品等放進(jìn)80℃烘箱中烘干。冷卻后分別稱重。重復(fù)以上過(guò)程，直至恒重。

稱取辣椒粉約20.00g用脫脂紗布包成圓柱狀，直徑略小于提取筒的直徑，并用一小段脫脂棉線扎緊，貯于密封袋中備用，向提取瓶中加入丙酮20ml。連接好裝置并打開(kāi)冷凝水開(kāi)關(guān)，潤(rùn)洗裝置。

潤(rùn)洗完后，將提取瓶中的液體倒掉，并把準(zhǔn)備好的辣椒粉樣品包裝入提取筒，向提取瓶中加丙酮240ml，連接好裝置。水浴溫度設(shè)為80℃，提取5h。然后裝置回流0.5h，回收有機(jī)溶劑。提取瓶，樣品渣稱重后放入烘箱烘干。冷卻后稱重，重復(fù)操作，直至恒重，計(jì)算辣椒油脂得率。提取瓶烘至恒重后所剩物質(zhì)為辣椒油油脂，用石油醚將其溶解，然后倒入廣口瓶中。廣口瓶放進(jìn)通風(fēng)櫥中將溶劑石油醚揮發(fā)，剩余為辣椒油油脂，儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

2.薄層層析

將提取出來(lái)的辣椒油油脂進(jìn)行薄層層析，薄層板上出現(xiàn)3個(gè)有色斑點(diǎn)，從上到下依次為深紅色、紅色和橙紅色，這些斑點(diǎn)為辣椒紅素斑點(diǎn)；經(jīng)顯色后薄層板的顏色結(jié)果顯示(見(jiàn)圖1)

圖1可見(jiàn)，薄層板經(jīng)辣椒堿顯色劑顯色后，又出現(xiàn)了3個(gè)綠色斑點(diǎn)，并與辣椒紅素斑點(diǎn)呈現(xiàn)交替分布，通過(guò)本實(shí)驗(yàn)的薄層層析方法可以分析出辣椒油油脂的6種成分，其中辣椒紅素有3種成分，辣椒堿類物質(zhì)有3種成分；分別計(jì)算各斑點(diǎn)的Rf值，其結(jié)果顯示(見(jiàn)表1)。

表1辣椒油油脂各斑點(diǎn)的Rf值

由表1數(shù)據(jù)分析可知，辣椒紅素斑點(diǎn)與辣椒堿類物質(zhì)的Rf值之差在0.05-0.56范圍內(nèi)，分離效果較好，而且不同辣椒紅素之間的Rf值之差在0.13-0.31范圍內(nèi)，分離效果很好；通過(guò)Rf值得比較可知用V_丙酮:V_石油醚＝1:5作展開(kāi)劑做薄層層析分離效果好，但由于辣椒紅素和辣椒堿在分離時(shí)呈交替分布，而且成分較為復(fù)雜，這樣給分離純化帶來(lái)困難。

3.第一次柱層析

第二次柱層析采用的硅膠為150目，應(yīng)當(dāng)理解的是100-200目的硅膠都是可行的。

將相同量的辣椒油油脂在洗脫劑為V_丙酮:V_石油醚＝1:5和V_丙酮:V_石油醚＝1:1的分別洗脫，硅膠柱的顏色結(jié)果顯示(見(jiàn)圖2)

圖2可見(jiàn)，洗脫劑V_丙酮:V_石油醚1:5在洗脫時(shí)能夠在硅膠柱內(nèi)呈現(xiàn)顏色分明的條帶，自下而上顏色依次為黃色、深紅色、紅色、淺紅色、橙色、黃色，條帶清晰。具體見(jiàn)圖2左側(cè)色譜柱。

洗脫劑V_丙酮:V_石油醚＝1:1在洗脫時(shí)在硅膠柱內(nèi)則呈現(xiàn)出黃色、深紅色、橙色、黃色的色譜條帶。具體見(jiàn)圖2右側(cè)色譜柱。

單從顏色上右側(cè)色譜柱的辣椒紅素都集中在一起，辣椒紅素與辣黃素分離開(kāi)，但我們從上面的薄層層析圖樣可以看出幾種辣椒紅素的Rf值差別很大，因此不應(yīng)該是同時(shí)被洗脫下來(lái)；另外分析V_丙酮:V_石油醚＝1:5洗脫中的辣椒紅素的分布情況更加接近于薄層層析的圖樣。通過(guò)類似的比較和篩選實(shí)驗(yàn)，可以認(rèn)為洗脫劑配比為V_丙酮:V_石油醚＝1:5的效果較好，更加適合于柱層析中辣椒紅素的分離。

3.1.柱層析一級(jí)分離效果檢測(cè)

先將洗脫劑為V_丙酮:V_石油醚＝1:5洗脫的洗脫液按先后順序分別收集三次，依次為前期洗脫液(6ml)、中期洗脫液(10ml)和后期洗脫液(8ml)，并將洗脫液進(jìn)行濃縮點(diǎn)樣進(jìn)行薄層層析檢測(cè)，對(duì)應(yīng)的薄層板依次為1、2、3，經(jīng)顯色后薄層層析結(jié)果顯示(見(jiàn)圖3)。

圖3可見(jiàn)，1號(hào)薄層板自上而下依次呈現(xiàn)綠色條帶和深紅色斑點(diǎn)，其中深紅色斑點(diǎn)有擴(kuò)散現(xiàn)象；2號(hào)薄層板自上而下依次呈現(xiàn)綠色條帶、深紅色斑點(diǎn)、紅色斑點(diǎn)和淺綠色斑點(diǎn)，其中深紅色斑點(diǎn)有擴(kuò)散現(xiàn)象，顏色也明顯加深；3號(hào)薄層板自上而下依次呈現(xiàn)深紅色斑點(diǎn)、紅色斑點(diǎn)、淺綠色斑點(diǎn)、橙紅色斑點(diǎn)和淡綠色斑點(diǎn)。分別與未被分離的辣椒油油脂薄層板4號(hào)對(duì)比發(fā)現(xiàn)：1號(hào)薄層板上只含有一種辣椒紅素和一種辣椒堿，2號(hào)薄層板上含有兩種辣椒紅素和兩種辣椒堿，3號(hào)薄層板上含有三種辣椒紅素和兩種辣椒堿；從所含成分推知，前期、中期、后期洗脫液中辣椒紅素與辣椒堿類物質(zhì)得到了一定的分離。分別計(jì)算各斑點(diǎn)的Rf值，其結(jié)果顯示(見(jiàn)表2)

表2 1-4號(hào)薄層板上各斑點(diǎn)的Rf值(4作對(duì)照)

由表中數(shù)據(jù)分析可知，深紅色、紅色和橙紅色斑點(diǎn)為辣椒紅素斑點(diǎn)，深綠色、淺綠色和淡綠色斑點(diǎn)為辣椒堿斑點(diǎn)；1號(hào)薄層板上辣椒紅素與辣椒堿類物質(zhì)的Rf值之差為0.22，2號(hào)薄層板上辣椒紅素與辣椒堿類物質(zhì)的Rf值之差在0.04-0.27范圍內(nèi)，3號(hào)薄層板上辣椒紅素與辣椒堿類物質(zhì)的Rf值之差在0.06-0.34范圍內(nèi)；由此看出辣椒紅素與辣椒堿類物質(zhì)有一定的分離效果。

再將洗脫劑為V_丙酮:V_石油醚＝1:1洗脫的洗脫液按先后順序分別收集三次，依次為前期洗脫液、中期洗脫液和后期洗脫液，并將洗脫液進(jìn)行濃縮點(diǎn)樣做薄層層析，對(duì)應(yīng)的薄層板依次為(1)、(2)、(3)，經(jīng)顯色后薄層層析結(jié)果顯示(圖4)

圖4可見(jiàn)：(1)薄層板自上而下依次呈現(xiàn)綠色條帶、深紅色斑點(diǎn)和紅色斑點(diǎn)，其中深紅色斑點(diǎn)有擴(kuò)散現(xiàn)象；(2)和(3)薄層板自上而下依次呈現(xiàn)綠色條帶、深紅色斑點(diǎn)、紅色斑點(diǎn)、淺綠色斑點(diǎn)、橙紅色斑點(diǎn)和綠色斑點(diǎn)。分別與未被分離的辣椒油油脂薄層板4號(hào)對(duì)比發(fā)現(xiàn)：(1)薄層板上含有兩種辣椒紅素和一種辣椒堿，(2)和(3)薄層板上含有三種辣椒紅素和三種辣椒堿。除(1)薄層板中成分有分離外，(2)和(3)薄層板中所含成分與未分離前一樣，基本未達(dá)到分離效果。

綜合兩次實(shí)驗(yàn)分離效果發(fā)現(xiàn)：洗脫劑為V_丙酮:V_石油醚＝1:5的洗脫效果明顯優(yōu)于洗脫劑為V_丙酮:V_石油醚＝1:1的效果。通過(guò)多種組成的洗脫劑組合及配比的比較實(shí)驗(yàn)，可以證實(shí)V_丙酮:V_石油醚＝1:5為最佳配比洗脫劑。此結(jié)果與薄層層析展開(kāi)劑配比一致。但是由于洗脫劑為V_丙酮:V_石油醚＝1:5的洗脫液并沒(méi)有得到純度較高的辣椒紅素，所以需要對(duì)其洗脫液進(jìn)行柱層析二級(jí)分離。

4.第二次柱層析

第二次柱層析采用的硅膠為250目，應(yīng)當(dāng)理解的是200-300目的硅膠都是可行的。

4.1前期洗脫液的柱層析二級(jí)分離效果分析

將前期洗脫液進(jìn)行二級(jí)分離，洗脫劑為V丙酮:V石油醚＝1:5，硅膠柱的顏色結(jié)果顯示(見(jiàn)圖5)。

圖5可見(jiàn)，由于前期洗脫液顏色較淺，且收集液的量少，所以柱層析的色譜柱整體顏色較淺，但有分層現(xiàn)象，自上而下依次為淺黃色和黃色兩種色譜；經(jīng)洗脫液洗脫后，按色譜柱顏色分別收集了兩次洗脫液，記為(1)、(2)號(hào)，顏色都為淡黃色，結(jié)果顯示(見(jiàn)圖6)

讀取(1)號(hào)和(2)號(hào)洗脫液收集量，分別為6ml和12ml；再將(1)、(2)號(hào)洗脫液經(jīng)濃縮后點(diǎn)樣做薄層層析，經(jīng)顯色后，結(jié)果顯示(見(jiàn)圖7)。

圖7可見(jiàn)，1-1薄層板只有上端有一淡綠色斑點(diǎn)，1-2薄層板上斑點(diǎn)自上而下的順序依次為淡綠色斑點(diǎn)和淡紅色斑點(diǎn)，與1薄層板對(duì)比發(fā)現(xiàn)，斑點(diǎn)的位置略有區(qū)別，但成分相同。分別計(jì)算各斑點(diǎn)的Rf值，其結(jié)果顯示(見(jiàn)表3)：

表3 1-1、1-2薄層板上各斑點(diǎn)的Rf值(1作對(duì)比)

由表中數(shù)據(jù)可知：綠斑點(diǎn)為辣椒堿；淡紅色斑點(diǎn)為辣椒紅素；將各Rf值與1薄層板上斑點(diǎn)的Rf值對(duì)比發(fā)現(xiàn)，其結(jié)果基本一致，1-2薄板中淺紅色斑點(diǎn)與1薄板中深紅色斑點(diǎn)是對(duì)應(yīng)的。由薄層層析檢測(cè)分析推知：前期洗脫液經(jīng)二級(jí)分離后，(1)號(hào)洗脫液中全部為辣椒堿溶液，(2)號(hào)洗脫液為辣椒紅素與辣椒堿的混合溶液。該二級(jí)分離達(dá)到了良好的分離效果。

4.2中期洗脫液的柱層析二級(jí)分離效果分析

將中期洗脫液進(jìn)行二級(jí)分離，洗脫劑為V_丙酮:V_石油醚＝1:5，硅膠柱的顏色結(jié)果顯示(見(jiàn)圖8)

由于中期洗脫液的顏色較深，且收集液量較多，所以柱層析后整個(gè)柱子的顏色較深，并且色譜柱的顏色層次分明，自下而上依次為黃色、深紅色、橙紅色、橙色、紅色、深黃色和淺黃色，按色素帶順序收集洗脫液，依次編號(hào)為(1)-(7)號(hào)，其結(jié)果顯示(見(jiàn)圖9)。

分別讀取(1)-(7)號(hào)洗脫液的收集量，其結(jié)果顯示(見(jiàn)表4)：

表4(1)-(7)號(hào)洗脫液的收集量

將(1)-(7)號(hào)洗脫液濃縮后點(diǎn)樣做薄層層析，經(jīng)顯色后，結(jié)果顯示(見(jiàn)圖10)；

圖10可見(jiàn)，2-1薄層板上只有最上端的綠色斑點(diǎn)；2-2薄層板自上而下依次顯示綠色斑點(diǎn)和深紅色斑點(diǎn)，其中深紅色斑點(diǎn)有向上擴(kuò)散現(xiàn)象，綠色斑點(diǎn)較1-1中顏色加深；2-3薄層板的斑點(diǎn)與2-2中一樣，但綠色斑點(diǎn)有較嚴(yán)重的拖尾現(xiàn)象，且顏色較2-2中要淡；2-4薄層板自上而下依次顯示綠色斑點(diǎn)、深紅色斑點(diǎn)和紅色斑點(diǎn)，其中綠色斑點(diǎn)有拖尾現(xiàn)象，顏色較2-3中要淡；2-5薄層板自上而下依次顯示深紅色斑點(diǎn)、紅色斑點(diǎn)和淺綠色斑點(diǎn)，對(duì)比2-4中少了綠色斑點(diǎn)，但多出淺綠色斑點(diǎn)；2-6薄層板自上而下依次顯示紅色斑點(diǎn)和淺綠色斑點(diǎn)，較2-5中少了深紅色斑點(diǎn)；2-7薄層板上只有淺綠色斑點(diǎn)；并且與2薄層板對(duì)比發(fā)現(xiàn)各斑點(diǎn)的顏色和位置基本相同。分別計(jì)算各薄層板上斑點(diǎn)的Rf值，其結(jié)果顯示(見(jiàn)表5)：

表5 2-1至2-7薄層板上各斑點(diǎn)的Rf值(2作對(duì)比)

由表中數(shù)據(jù)分析知：深紅色斑點(diǎn)和紅色斑為辣椒紅素斑點(diǎn)，綠色斑點(diǎn)和淺綠色斑點(diǎn)為辣椒堿斑點(diǎn)；其中辣椒紅素類物質(zhì)的Rf值約為0.70和0.60，辣椒堿的Rf值約為0.95和0.56，辣椒紅素與辣椒堿的Rf值之差為0.04-0.35范圍內(nèi)，分離效果明顯。另外，由薄層層析推測(cè)(1)-(7)號(hào)洗脫液中所含成分知，(1)號(hào)洗脫液中為較純的辣椒堿；(2)號(hào)洗脫液中有少許辣椒紅素，但大部分都是辣椒堿；(3)號(hào)洗脫液中辣椒紅素和辣椒堿都含有；(4)號(hào)洗脫液在中辣椒堿含量明顯減少，辣椒紅素含量增多；(5)號(hào)洗脫液中含有另一種辣椒堿，辣椒紅素含量也相對(duì)較多；(6)號(hào)洗脫液中辣椒紅素含量明顯減少，辣椒堿含量增多；(7)號(hào)洗脫液中基本無(wú)辣椒紅素，只含有辣椒堿。那么從洗脫順序來(lái)看，黃色譜帶中基本只含有辣椒堿；深紅色譜帶和橙紅色譜帶中辣椒紅素的含量最多，也含有很少量的辣椒堿類物質(zhì)，可以進(jìn)一步探討辣椒紅素的含量比例；橙色譜帶中多含有一種辣椒紅素成分；紅色譜帶中也是辣椒紅素與辣椒堿的混合物，但是所含辣椒堿的成分不同；深黃色譜帶中則少一種辣椒紅素成分。整體上從二級(jí)分離中期洗脫液的效果可以得出：辣椒紅素與辣椒堿類物質(zhì)得到了較好的分離，可以得到較純的辣椒紅素；雖然沒(méi)有得到辣椒紅素純品，但對(duì)比一級(jí)分離的效果更加明顯。

4.3后期洗脫液的柱層析二級(jí)分離效果分析

將后期洗脫液進(jìn)行二級(jí)分離，洗脫劑為V丙酮:V石油醚＝1:5，硅膠柱的顏色結(jié)果顯示(見(jiàn)圖11)。后期洗脫液的顏色相對(duì)中期洗脫液較淺，柱層析后色譜柱的顏色也相對(duì)較淺，但層次分明，從下向上依次為淡黃色、深黃色、橙紅色、黃色和淺黃色，按色譜帶順序分別收集，得到(1)-(5)號(hào)洗脫液，其結(jié)果顯示(見(jiàn)圖12)；

由于后期洗脫液在一級(jí)分離時(shí)最后被洗脫，洗脫時(shí)間較長(zhǎng)，所以其二級(jí)分離時(shí)色素帶洗脫液量較多，測(cè)量各洗脫液的量，其結(jié)果顯示(見(jiàn)表6)；

表6(1)-(5)號(hào)洗脫液的收集量

將(1)-(5)號(hào)洗脫液分別濃縮做薄層層析，顯色后的結(jié)果顯示(見(jiàn)圖13)。

從圖13可見(jiàn)：3-1薄層板自上而下依次為淺綠色斑點(diǎn)和深紅色斑點(diǎn)；3-2薄層板只有深紅色斑點(diǎn)；3-3薄層板自上而下依次顯示深紅色斑點(diǎn)和紅色斑點(diǎn)；3-4薄層板自上而下依次顯示紅色斑點(diǎn)、淡綠色斑點(diǎn)和橙紅色斑點(diǎn)；3-5薄層板自上而下依次顯示淡綠色斑點(diǎn)、橙紅色斑點(diǎn)和綠色斑點(diǎn)，3-5薄層板斑點(diǎn)顏色明顯較3-4薄層板要淡。與3薄層板對(duì)比發(fā)現(xiàn)各斑點(diǎn)的顏色和位置基本相同。分別計(jì)算薄層板各斑點(diǎn)的Rf值，其結(jié)果顯示(見(jiàn)表8)

表8 3-1至3-5薄層板上各斑點(diǎn)的Rf值(3作對(duì)比)

由表8數(shù)據(jù)可知：深紅色斑點(diǎn)、紅色斑點(diǎn)和橙紅色斑點(diǎn)為辣椒紅素斑點(diǎn)；深綠色斑點(diǎn)、淡綠色斑點(diǎn)和綠色斑點(diǎn)為辣椒堿斑點(diǎn)；辣椒紅素類物質(zhì)的Rf值約為0.72、0.59和0.40，辣椒堿的Rf值約為0.95、0.52和0.35，辣椒紅素與辣椒堿的Rf值之差在0.05-0.55范圍內(nèi)，分離效果明顯。從薄層層析板上的斑點(diǎn)分布情況，可推斷并得出如下結(jié)論：(1)號(hào)洗脫液中含有辣椒紅素和辣椒堿的量都很少；(2)號(hào)洗脫液中只含有辣椒紅素，并且成分單一；(3)號(hào)洗脫液中也只含有辣椒紅素，但是其成分為兩種辣椒紅素；(4)號(hào)洗脫液中含有兩種辣椒紅素和另一種辣椒堿；(5)號(hào)洗脫液中含有兩種辣椒堿和一種辣椒紅素，且含量相對(duì)更少。

從洗脫順序和效果來(lái)看，一級(jí)柱層析分離收集的后期洗脫液再經(jīng)過(guò)二級(jí)柱層析分離可以得到辣椒紅素的單一成分(3-2洗脫液)和不含辣椒堿的兩種辣椒紅素混合物(3-3洗脫液)。由于一級(jí)柱層析分離收集的中期洗脫液有效成分含量較多，經(jīng)過(guò)二級(jí)柱層析分離雖然沒(méi)有得到不含辣椒堿的辣椒紅素，但已經(jīng)取得了良好的分離效果，中期洗脫液經(jīng)二級(jí)柱層析分離收集的7管洗脫液中每官洗脫液均只含一種類型的辣椒堿，經(jīng)薄層層析驗(yàn)證，且與辣椒紅素不存在交叉分布現(xiàn)象，為三級(jí)柱層析分離實(shí)現(xiàn)辣椒紅素和辣椒堿的完全分開(kāi)提供了條件?？傊?，通過(guò)二級(jí)柱層析能夠得到辣椒紅素純品。

可以理解的是，以上實(shí)施方式僅僅是為了說(shuō)明本發(fā)明的原理而采用的示例性實(shí)施方式，然而本發(fā)明并不局限于此。對(duì)于本領(lǐng)域內(nèi)的普通技術(shù)人員而言，在不脫離本發(fā)明的精神和實(shí)質(zhì)的情況下，可以做出各種變型和改進(jìn)，如三級(jí)柱層析分離等，這些變型和改進(jìn)也視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。