本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，涉及高羊茅“Regenerate”FaHsfC1b基因及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

高羊茅是多年生冷季型草坪草種和牧草草種，起源于北歐、北非、中東、中亞、西伯利亞等地區(qū)。高羊茅作為一種優(yōu)良的草坪草種，具有成活率高、生長迅速、適應(yīng)性強、抗性強和養(yǎng)護(hù)成本低等特性，因此在亞熱帶地區(qū)也得到了廣泛的應(yīng)用，然而這些地區(qū)夏季高溫環(huán)境限制了高羊茅的生長，影響其作為牧草的產(chǎn)量或作為草坪草的坪用質(zhì)量。提高高羊茅耐熱性的研究多集中于生理試驗，包括各種外源激素處理、耐熱性鍛煉等，關(guān)于利用轉(zhuǎn)基因的方式提高高羊茅耐熱性的報道非常少見，因此，挖掘高羊茅抗熱性基因資源對培養(yǎng)耐熱性強的高羊茅種質(zhì)資源具有重要意義。

熱激轉(zhuǎn)錄因子(Hsfs)家族在植物感知脅迫、信號傳導(dǎo)、抗性方面發(fā)揮著重要作用。根據(jù)基因結(jié)構(gòu)，熱激轉(zhuǎn)錄因子家族包括A、B、C三類。Hsfs通常都包含如下兩個基本的結(jié)構(gòu)域：位于N端的DNA結(jié)合區(qū)域(DBD)緊鄰著一個疏水的寡聚化結(jié)構(gòu)域(OD)，DBD結(jié)構(gòu)域有特殊的雙螺旋結(jié)構(gòu)，能夠結(jié)合在下游基因啟動子的熱激元件(heat stress elements，HSE)上，從而調(diào)控下游基因的表達(dá)。所有的A類和C類OD結(jié)構(gòu)域中都有一個特殊HR-A/B區(qū)域，在A類中此區(qū)域中插入了21個氨基酸殘基而在C類中有7個氨基酸殘基的插入，B類Hsfs在此區(qū)域無任何氨基酸插入。在A類Hsfs中還包括有核輸出信號(NES)、AHA短肽基序，分別負(fù)責(zé)核信號輸出和轉(zhuǎn)錄功能的輔助實現(xiàn)。

熱激轉(zhuǎn)錄因子(Hsfs)自發(fā)現(xiàn)以來已經(jīng)得到了廣泛地挖掘和研究，在擬南芥(Arabidopsis thaliana)中有21個，在水稻(Oryza sativa)中有26個，在玉米(Zea mays)中則有30個。HsfA1a被認(rèn)為是番茄中調(diào)控?zé)犴憫?yīng)及抗熱性的主導(dǎo)基因。HsfA2在很多研究中增加了植物對鹽脅迫、滲透脅迫、過氧化脅、缺氧脅迫和熱脅迫的抗性，同時HsfA2也與HsfA1結(jié)合形成激活狀態(tài)的異二聚體，共同影響下游熱響應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。HsfA4基因具有激活活性但HsfA5不具有激活活性，且HsfA5可以抑制HsfA4的轉(zhuǎn)錄激活活性。HsfA9在植物胚胎發(fā)育和種子成熟中發(fā)揮重要作用，在水稻中HsfA7也有類似的作用。跟A類基因發(fā)揮功能的方式相反，B類熱激轉(zhuǎn)錄因子的負(fù)調(diào)控對植物獲得耐熱性具有重要作用。目前僅在水稻中發(fā)現(xiàn)了C類基因OsHsfC1b基因的功能，其在水稻抵抗鹽脅迫、滲透脅迫、維持正常生長方面具有不可替代的作用。

在高羊茅中，對熱激轉(zhuǎn)錄因子功能的研究非常罕見，目前僅發(fā)現(xiàn)FaHsfA2c轉(zhuǎn)基因高羊茅表現(xiàn)出比野生型更強的抗熱性。因此培育高羊茅抗熱性種質(zhì)資源并最終走向商品化應(yīng)用是一項長遠(yuǎn)而有意義的工作。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一種新的高羊茅FaHsfC1b基因。

本發(fā)明的另一目的是提供該FaHsfC1b基因的應(yīng)用。

本發(fā)明的目的可通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)：

高羊茅FaHsfC1b基因，其特征在于具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。含有所述的FaHsfC1b基因的重組表達(dá)載體。

所述的重組表達(dá)載體優(yōu)選將所述的FaHsfC1b基因插入到表達(dá)載體pEarleyGate103的Ecol Ⅰ、EcolⅤ切酶的切位點之間所得。

含有所述的FaHsfC1b基因的宿主細(xì)胞。

所述的宿主細(xì)胞優(yōu)選農(nóng)桿菌。

本發(fā)明所述的FaHsfC1b基因在創(chuàng)制耐熱新種質(zhì)和/或植物品種改良中的應(yīng)用。

所述的含有FaHsfC1b基因的重組表達(dá)載體在創(chuàng)制耐鹽及耐低溫新種質(zhì)和/或植物品種改良中的應(yīng)用。

有益效果

本發(fā)明根據(jù)前人發(fā)現(xiàn)的水稻OsHsfC1b，從本實驗室高羊茅轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(未發(fā)表)中找到同源基因片段，設(shè)計引物后再通過Touch-down方法從高羊茅“Regenerate”中首次克隆得到FaHsfC1b基因。參照聚類分析的結(jié)果，該基因?qū)儆贑1b亞組，綜合上述基因查找線索我們命名該基因為FaHsfC1b。FaHsfC1b包含一個DNA結(jié)合區(qū)域(DNA binding domain，DBD)，一個疏水的寡聚化結(jié)構(gòu)域(oligomerization domain，OD)，也叫作HR-A/B區(qū)域，和一個核定位信號結(jié)構(gòu)域(nuclear localization signal，NLS)。它和二穗短柄草(Brachypodium distachyon)、水稻(Oryza.sativa L.)分別有73％和75％的相似性。FaHsfC1b與小麥(Triticum aestivum)、二穗短柄草、水稻、玉米(Zea mays)、粟(Setariaitalica)都有較高的同源性。其中,水稻OsHsfC1b基因突變以后，突變體植株對高鹽及滲透脅迫的耐性降低，對脫落酸更為敏感。除此之外，其他物種中HsfC1b的功能研究甚少，其是否參與耐熱性，尚不清楚?？梢?與本發(fā)明高羊茅FaHsfC1b基因同源性較高的基因均不具備耐熱性。

轉(zhuǎn)FaHsfC1b基因擬南芥幼苗在熱脅迫下，比野生型有更高的存活率，同樣轉(zhuǎn)FaHsfC1b 基因擬南芥成苗在高溫處理并恢復(fù)后有比野生型擬南芥更少的枯黃葉片?；蚍治鲲@示，轉(zhuǎn)FaHsfC1b基因擬南芥提高了擬南芥中Hsp18.1-Cl、Hsp22.0-ER、Hsp26.5-P(r)、Hsp70-b基因在高溫下的表達(dá)量。FaHsfC1b基因通過調(diào)控抗性相關(guān)基因來提高轉(zhuǎn)基因擬南芥的耐熱性。

附圖說明

圖1高羊茅FaHsfC1b片段凝膠電泳圖

圖2 FaHsfC1b蛋白的亞細(xì)胞定位

圖3 35S:FaHsfC1b轉(zhuǎn)基因擬南芥FaHsfC1b蛋白在根尖上的核定位

圖4 pEarleyGate 103-FaHsfC1b表達(dá)載體的構(gòu)建。A：pJET1.2-FaHsfC1b質(zhì)粒雙酶切(Ecol Ⅰ、Ecol Ⅴ)，左為pJET1.2-FaHsfC1b質(zhì)粒，右為雙酶切后條帶，箭頭指示為帶有Ecol Ⅰ、Ecol Ⅴ的FaHsfC1b基因片段。B：pENTR^TM1A質(zhì)粒的線性化。左為pENTR^TM1A質(zhì)粒，右為pENTR^TM1A質(zhì)粒雙酶切(Ecol Ⅰ、Ecol Ⅴ)，箭頭指示為線性化后的pENTR^TM1A。C：線性化后的pENTR^TM1A-FaHsfC1b質(zhì)粒(箭頭所指)和pENTR^TM1A-FaHsfC1b環(huán)狀質(zhì)粒。

圖5轉(zhuǎn)基因擬南芥陽性植株的鑒定。WT為陰性對照，pEarleyGate 103-FaHsfC1b質(zhì)粒為陽性對照，箭頭指示為包含F(xiàn)aHsfC1b基因及部分pEarleyGate 103載體序列的片段，15個陽性株系被鑒定出來。

圖6融合了GFP的FaHsfC1b蛋白在轉(zhuǎn)基因擬南芥中的表達(dá)。上排圖片為WT和轉(zhuǎn)基因植株在熒光下的圖片，可以看出發(fā)出綠色熒光的根部，WT根部不發(fā)光。下排圖片為相對應(yīng)明場中的擬南芥植株。

圖7 WT與轉(zhuǎn)基因擬南芥熱處理前后的表型。左圖為處理前各株系表型，中間為45℃熱處理5h并恢復(fù)7d后的表型，右圖為各株系對應(yīng)在培養(yǎng)皿中的位置，每個培養(yǎng)皿中每個株系有15株擬南芥。

圖8培養(yǎng)皿中熱處理恢復(fù)后WT與轉(zhuǎn)基因株系的存活率。數(shù)值為三個生物學(xué)重復(fù)的均值，柱子上的星號表示通過費舍檢驗WT與4個轉(zhuǎn)基因株系在0.05水平上差異顯著。

圖9轉(zhuǎn)基因擬南芥FaHsfC1b相對表達(dá)量。N.D.表示在WT植株中未檢測到基因FaHsfC1b的表達(dá)，數(shù)值為三個生物學(xué)重復(fù)的均值，柱子上的星號表示通過費舍檢驗WT與4個轉(zhuǎn)基因株系在0.05水平上差異顯著。

圖10盆栽WT和轉(zhuǎn)基因擬南芥耐熱性檢測。6周大的WT和轉(zhuǎn)基因擬南芥在熱處理前、熱處理(12-h 45℃/12-h 40℃)后及恢復(fù)(25℃)后的表型。

圖11熱處理恢復(fù)后WT與轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片枯黃率。數(shù)值為四個生物學(xué)重復(fù)的均值，柱子上的星號表示通過費舍檢驗WT與4個轉(zhuǎn)基因株系在0.05水平上差異顯著。

圖12熱處理并恢復(fù)后WT與轉(zhuǎn)FaHsfC1b基因擬南芥生理指標(biāo)。A：葉片光化學(xué)效率(Fv/Fm)。B：葉片葉綠素含量(Chl)C：相對電解質(zhì)滲漏率(EL)數(shù)值為四個生物學(xué)重復(fù)的均值，柱子上的星號表示通過費舍檢驗WT與4個轉(zhuǎn)基因株系在0.05水平上差異顯著。

圖13 WT與轉(zhuǎn)FaHsfC1b基因擬南芥ROS染色。A：植物在正常條件下的DAB染色。B：熱脅迫后的DAB染色。C：植物在正常條件下的NBT染色。D：熱脅迫后的NBT染色。熱脅迫處理為37℃1h。

圖14 FaHsfC1b熱處理下潛在目標(biāo)基因的相對表達(dá)量。選擇過表達(dá)株系OE6和OE16，在37℃熱處理1小時后檢測圖中四個潛在目標(biāo)基因表達(dá)量。定量PCR值為三個生物學(xué)重復(fù)的均值，每個生物學(xué)重復(fù)又包含三個技術(shù)重復(fù)的均值，柱子上標(biāo)注的星號表示處理前與處理后通過費舍檢驗在0.05水平上差異顯著的數(shù)值。

具體實施方式

實施例1基因克隆

高羊茅葉片總RNA由試劑盒Plant RNA Kit(50)(Omega Bio-Tec，American)提取，將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。采用Touch-down PCR(Don,Cox et al.1991)擴增目的基因，Touch-down PCR反應(yīng)體系為Q5 Enzyme(0.5μl)、5×Q5 Buffer(10μl)、5×Q5 Enhancer(10μl)、FaHsfC1b-F：SEQ ID NO.1(10μM)(2.5μl)、FaHsfC1b-R：SEQ ID NO.2(10μM)(2.5μl)、dNTPs mixture(2.5mM each)(4μl)、dd H₂O(18.5μl)、cDNA(2μl)。反應(yīng)程序為：98℃預(yù)變性30s，第一部分5個循環(huán)(98℃變性10s，72℃退火30s，72℃延伸3min)，第二部分5個循環(huán)(98℃變性10s，68℃退火30s，72℃延伸3min)，第三部分10個循環(huán)(98℃變性10s，65℃退火30s，72℃延伸3min)，第四部分15個循環(huán)(98℃變性10s，62℃退火30s，72℃延伸3min)，72℃后延伸10min。產(chǎn)物采用0.9％瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(圖1)，查看片段大小符合預(yù)期后進(jìn)行凝膠片段的回收?；厥漳康钠芜B接pJET1.2 blunt vector得到pJET1.2 blunt vector-FaHsfC1b質(zhì)粒(圖4A)，體系如下：

將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到E.coli DH5α感受態(tài)大腸桿菌中，隨機挑取8個單菌落進(jìn)行測序，該基因序列如：SEQ ID NO.3所示。經(jīng)測序后在BioXM2.6軟件上進(jìn)行分析，預(yù)測其編碼區(qū)和編碼的蛋白，并在NCBI進(jìn)行Blastn比對分析。它與二穗短柄草(Brachypodium distachyon)和水稻(Oryza.sativa L.)分別有73％和75％的相似性。FaHsfC1b與小麥(Triticum aestivum)、二穗短柄草、水稻、玉米(Zea mays)、粟(Setariaitalica)都有較高的同源性。FaHsfC1b包含一個DNA結(jié)合區(qū)域(DNA binding domain，DBD)，一個疏水的寡聚化結(jié)構(gòu)域(oligomerization domain，OD)，也叫作HR-A/B區(qū)域，和一個核定位信號結(jié)構(gòu)域(nuclear localization signal，NLS)，將獲得的新基因命名為FaHsfC1b。

實施例2載體構(gòu)建

挑選經(jīng)測序驗證的包含F(xiàn)aHsfC1b基因的克隆進(jìn)行擴大培養(yǎng)，提取pJET1.2 blunt vector-FaHsfC1b質(zhì)粒。將pJET1.2blunt vector-FaHsfC1b質(zhì)粒及入門載體pENTR^TM1A(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)分別用EcoRI和EcoRV進(jìn)行雙酶切，分別獲得帶酶切位點的FaHsfC1b片段和線性化的pENTR^TM1A(圖4B)。其反應(yīng)體系如下：

以上得到的酶切目的片段插入到線性化入門載體pENTR^TM1A中，體系如下：

連接體系為16℃30min，采用電擊法將產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌，方法為：將感受態(tài)大腸桿菌取出，冰上解凍。準(zhǔn)備好電極杯，晾干其中的酒精并置于冰上預(yù)冷，將5μl連接產(chǎn)物加入到大腸桿菌菌液(每支約100μl)中，混勻后轉(zhuǎn)移到電極杯中，蓋上蓋子并順著電轉(zhuǎn)器杯槽將電極杯推入到電極中，設(shè)置好電壓模式后，點擊開始按鈕，電轉(zhuǎn)即完成。將電轉(zhuǎn)后的混合液轉(zhuǎn)移到滅菌后的1.5ml離心管中，加入600μl LB液體培養(yǎng)基，用封口膜密封管蓋并放置于37℃培養(yǎng)箱中震蕩(180rpm)約45min。

恢復(fù)培養(yǎng)后將菌液涂抹在LBK板(LB固體培養(yǎng)基加100mg/l卡那霉素Kan)上，過夜37℃倒置培養(yǎng)后，挑取數(shù)個單菌落擴大培養(yǎng)，菌液PCR并瓊脂糖凝膠電泳檢測條帶大小。挑選條帶大小正確的的菌液擴大培養(yǎng)并提取質(zhì)粒。

為了進(jìn)行FahsfC1b的亞細(xì)胞定位，將質(zhì)粒pENTR^TM1A-FaHsfC1b進(jìn)行線性化(圖4C)，體系為：

利用二元載體p2GWF7.0構(gòu)建了FaHsfC1b-eGFP重組質(zhì)粒(Earley,Haag et al.2006)：

反應(yīng)程序為25℃1h，再加入0.5μl蛋白酶K(Protease K)混勻后37℃靜置10min，LR重組即完成。重組后的產(chǎn)物電擊轉(zhuǎn)化大腸桿菌，參考前人的方法(Wu,Shen et al.2009)，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入擬南芥原生質(zhì)體中，過夜后于共聚焦顯微鏡(Carl Zeiss,Jena,Germany)下觀察。在觀察過程中，將DAPI染色添加到原生質(zhì)體溶液中使細(xì)胞核染色，GFP信號和DAPI染色的細(xì)胞核完全重疊(圖2)，說明FaHsfC1b定位于擬南芥原生質(zhì)體細(xì)胞核。在雙元表達(dá)載體pEarleyGate 103上也存在一個GFP的編碼區(qū)域，后期轉(zhuǎn)FaHsfC1b基因擬南芥便使用此表達(dá)載體，用DAPI染色液滴入盛有根尖的載玻片，在顯微鏡下觀察細(xì)胞核的位置，與GFP信號比對后兩者完全重合(圖3)，再次證明了FaHsfC1b的核定位，且說明了FaHsfC1b在擬南芥中亞細(xì)胞定位的永久性。

構(gòu)建轉(zhuǎn)基因工程質(zhì)粒：將得到的線性化pENTR^TM1A-FaHsfC1b與pEarleyGate 103進(jìn)行LR 重組(Earley,Haag et al.2006)，反應(yīng)如下：

反應(yīng)程序為25℃1h，再加入0.5μl蛋白酶K(Protease K)混勻后37℃靜置10min，LR重組即完成。重組后的產(chǎn)物電擊轉(zhuǎn)化大腸桿菌，恢復(fù)培養(yǎng)后將菌液涂抹在LBK板(LB固體培養(yǎng)基加100mg/l卡那霉素Kan)上，過夜37℃倒置培養(yǎng)后，挑取單個菌落擴大培養(yǎng)并且提取質(zhì)粒。

利用電擊法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞，將感受態(tài)農(nóng)桿菌取出，冰上解凍。準(zhǔn)備好電極杯，晾干其中的酒精并置于冰上預(yù)冷，將5μl純化后的產(chǎn)物加入到農(nóng)桿菌菌液(每支約100μl)中，混勻后轉(zhuǎn)移到電極杯中，蓋上蓋子并順著電轉(zhuǎn)器杯槽將電極杯推入到電極中，設(shè)置好電壓模式后，點擊開始按鈕，電轉(zhuǎn)即完成。將電轉(zhuǎn)后的混合液轉(zhuǎn)移到滅菌后的1.5ml離心管中，加入600μl LB液體培養(yǎng)基，用封口膜密封管蓋并放置于28℃培養(yǎng)箱中震蕩(180rpm)約45min。

將震蕩后的混合液7000rpm離心并去掉一部分上清液，剩余液體約100μl，用1ml槍頭吸打混勻后，在無菌臺上均勻涂抹于YEB板(YEB固體培養(yǎng)基加50mg/l卡那霉素Kan，50mg/l利福平Rif)上，在28℃培養(yǎng)箱中倒置、靜置培養(yǎng)1-2天。

挑取培養(yǎng)板上的單個農(nóng)桿菌菌落，轉(zhuǎn)移到Y(jié)EB液體培養(yǎng)基中(加50mg/l Kan，50mg/l Rif)，28℃震蕩培養(yǎng)1h以增加菌液濃度，取菌液利用特定引物進(jìn)行菌液PCR檢驗，以pEarleyGate103-F：SEQ ID NO.4和FaHsfC1b-R：SEQ ID NO.2分別作為正向和反向引物；

反應(yīng)體系為：

預(yù)變性94℃5min后，30個循環(huán)中包含三個階段：95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min。最后72℃延伸10min，產(chǎn)物4℃保存。瓊脂糖凝膠電泳檢測條帶大小是否正確。

陽性克隆直接取出菌液進(jìn)行放大培養(yǎng)，在2ml離心管中保存菌液，每個離心管中加入750μl農(nóng)桿菌菌液，再加入250μl 70％無菌甘油，最后放在-80℃冰箱中保存。

實施例3 FaHsfC1b基因轉(zhuǎn)化擬南芥及檢測

參考前人的方法(Clough and Bent 1998)，提前一天從-80℃冰箱中取出實施例2中的農(nóng)桿菌放大培養(yǎng)，第二天每隔一個小時用分光光度計測量菌液濃度，當(dāng)農(nóng)桿菌在600nm處的OD值達(dá)到7-1.5時即可開始侵染試驗。同時選用已經(jīng)抽薹并少量開花的擬南芥，以多數(shù)為未開放的花蕾為佳，剪去果莢及已經(jīng)開放的花朵。

菌液在高速離心機內(nèi)7000rpm離心5-10min，棄去上清液，用5％蔗糖溶液重新懸浮，再加入0.05％(500μl/l)Silwet-77，懸浮至OD₆₀₀值約為0.8。農(nóng)桿菌菌液置于100ml燒杯或50ml離心管中，將擬南芥花序浸沒在菌液中侵染1min后迅速取出，保證所有花序都侵染了液體后，將擬南芥放置在紙箱中密封，在黑暗條件下放置24h，最后光照下25℃正常培養(yǎng)。3-4周后新的果莢長出并開始成熟，收取褐色并干枯的果莢內(nèi)種子，在37℃培養(yǎng)箱中烘干水分并放置在4℃冰箱中妥善保存。

T1代轉(zhuǎn)基因擬南芥初篩：pEarleyGate 103質(zhì)粒包含有一個草銨膦耐受的報告基因，因此T1代轉(zhuǎn)基因擬南芥由加入20μg/ml草銨膦(Basta)的MS固體培養(yǎng)基來篩選。將侵染后的擬南芥生成的種子消毒后撒播在添加草銨膦的MS培養(yǎng)基上，生根并長出葉子的擬南芥移栽到草炭土、蛭石、珍珠巖比例為3:3:1的基質(zhì)中。

T1代轉(zhuǎn)基因擬南芥檢測：待擬南芥長出6-9片蓮座葉時，提取擬南芥葉片gDNA，采用植物基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)(TIANGEN，BeiJing，China)，用pEarleyGate103-F和FaHsfC1b-R作為引物鑒定陽性植株。

預(yù)變性94℃5min后，30個循環(huán)中包含三個階段：95℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min。最后72℃延伸10min，產(chǎn)物4℃保存。瓊脂糖凝膠電泳檢測條帶大小是否正確。最終得到了15個陽性植株(圖5)。

T2代轉(zhuǎn)基因GFP表達(dá)的檢測：上述最終鑒定出的陽性擬南芥植株繼續(xù)妥善養(yǎng)護(hù)并收取T2代種子，將收取的種子在加有草銨膦的MS固體培養(yǎng)基中篩選，選取培養(yǎng)基中生長4天大的擬南芥幼苗，整株放置在顯微鏡下，開啟GFP觀察模式，查看轉(zhuǎn)基因植株根部是否有綠色熒光(圖6)，有即說明基因穩(wěn)定遺傳至下一代。

實施例4轉(zhuǎn)FaHsfC1b基因擬南芥耐熱性分析

篩選耐熱性轉(zhuǎn)FaHsfC1b基因擬南芥株系：將T2代轉(zhuǎn)基因擬南芥滅菌后播于草銨膦篩選培養(yǎng)基上，4℃冰箱春化3天，發(fā)芽后的擬南芥轉(zhuǎn)移到MS固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)環(huán)境為25℃，12h光周期的無菌室，一部分?jǐn)M南芥繼續(xù)留在MS培養(yǎng)基上等待隨后進(jìn)行的熱處理試驗，另一部分在長出3-4出葉后轉(zhuǎn)移到盆栽基質(zhì)中，準(zhǔn)備后續(xù)擬南芥的抗熱性鑒定試驗。

選取上述GFP鑒定過的T₂代擬南芥植株OE5、OE6、OE16、OE17，將3周大的WT和轉(zhuǎn)基因擬南芥放置在45℃下處理5h，再放回25℃恢復(fù)7d，觀察擬南芥的恢復(fù)情況并拍照(圖7)，從圖中可以看出，處理前不同株系擬南芥植株與WT表型一致，熱處理并恢復(fù)7d后，WT植株大部分枯黃，而四個轉(zhuǎn)基因株系表現(xiàn)較好。存活率統(tǒng)計如圖8所示，四個轉(zhuǎn)基因株系均比WT表現(xiàn)出更強的耐熱性，其中以O(shè)E6、OE16表現(xiàn)更好。

將培養(yǎng)皿中2周大的T₂擬南芥進(jìn)行37℃熱處理1h，處理結(jié)束后立即取樣保存，提取RNA并反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行qRT-PCR檢測，結(jié)果如圖9所示，在WT中未檢測到FaHsfC1b的表達(dá)，以O(shè)E5為參照，四個株系FaHsfC1b基因表達(dá)量均顯著，其中以O(shè)E16為最高。

轉(zhuǎn)FaHsfC1b基因擬南芥植株的耐熱性鑒定：

上述移栽擬南芥至盆中時，按照每盆3株，每個株系4盆來準(zhǔn)備，在25℃人工氣候室中繼續(xù)培養(yǎng)3周后，放入光照培養(yǎng)箱中，白天溫度45℃，夜晚40℃，光周期12h，空氣濕度為白天70％，夜晚75％，處理3d，3天內(nèi)間隔澆1/2營養(yǎng)液或水以防植株收到干旱脅迫。處理結(jié)束后放回25℃人工氣候室恢復(fù)10天，每周澆一次營養(yǎng)液。從圖10中可以看出，處理前WT與OE5、OE6、OE16、OE17五個株系在表型上無差別，熱處理后WT植株葉片萎蔫較嚴(yán)重，而轉(zhuǎn)基因株系葉片萎蔫程度較輕，恢復(fù)10d天后，WT植株熱處理后萎蔫的葉片部分枯黃，而轉(zhuǎn)基因株系有大部分萎蔫的葉片恢復(fù)活力，受傷較輕。統(tǒng)計恢復(fù)后各株系的葉片枯黃率(圖11)，轉(zhuǎn)基因株系明顯低于WT植株。說明過表達(dá)FaHsfC1b提高了轉(zhuǎn)基因擬南芥的耐熱性，并提高了擬南芥受熱后的恢復(fù)能力。

采集葉片測量光化學(xué)效率(Photochemical Efficiency，F(xiàn)v/Fm)、葉綠素含量(Chlorophyll Content，Chl)以及相對電解質(zhì)滲漏率(Relative Electrolyte Leakage，EL)。葉片F(xiàn)v/Fm測量：統(tǒng)一選取相同葉齡葉片，先用葉夾將葉片夾起來，推起黑色塑料片使葉片暗適應(yīng)30min，暗適應(yīng)結(jié)束后推開黑色塑料片，用Licor 6400光合儀(LI-6400,Li-Cor,Lincoln,NE,USA)探頭伸入到葉夾孔中，測量葉片光化學(xué)效率并記錄數(shù)據(jù)。葉綠素含量測量：稱取恢復(fù)后擬南芥葉片0.1g，放置在15ml離心管中，加入10ml 95％酒精完全浸沒葉片，蓋緊蓋子防止酒精揮發(fā)降低濃度，在常溫黑暗環(huán)境下浸泡72h后，用分光光度計(GE Healthcare Life Sciences,Cambridge,UK)測量酒精溶液液在663nm和645nm波長下的吸光值，及A663和A645。棄去酒精溶液，將去除葉綠素的葉片放在信封中并置于80℃烘箱中烘干水分，稱量葉片重量。葉綠素含量計算公式為C＝((13.95×A663-6.88×A645+13.95×A645-7.23×A663)×0.01)/干重。相對電解質(zhì)滲漏率測定：稱取0.2g恢復(fù)后葉片，用去離子水沖洗干凈，包裹上滅菌后的濾紙，放置在50ml離心管中，加入30ml去離子水使葉片和濾紙完全浸沒，同時準(zhǔn)備三個重復(fù)的50ml離心管，其中僅放置相同大小的濾紙浸泡于30ml離心管中。將離心管在180r/min搖床上震蕩24h，用電導(dǎo)率測量儀(Thermo Scientific,Baverly,USA)測量初始值Ci，其后在高壓滅菌鍋中121℃煮沸15min，冷卻后在搖床上繼續(xù)震蕩24h，測量最大值Cmax，其中三個只有濾紙的離心管同樣測量前后值，平均后作為濾紙電導(dǎo)率參考值在實際記錄中減去。最后計算公式為EL＝(Ci/Cmax)×100。

如圖12A和12B，WT光化學(xué)效率和葉綠素含量明顯低于轉(zhuǎn)基因擬南芥，說明野生型擬南芥在熱脅迫后受到了更大的傷害并難以與轉(zhuǎn)基因擬南芥有同等水平的恢復(fù)能力，因此轉(zhuǎn)基因擬南芥在熱處理并恢復(fù)后有更強、更穩(wěn)定的光和系統(tǒng)。如圖12C，WT EL值顯著高于轉(zhuǎn)基因株系，表明轉(zhuǎn)基因株系的細(xì)胞膜穩(wěn)定性更強。

活性氧檢測：將培養(yǎng)皿中生長2周大的擬南芥WT和轉(zhuǎn)基因株系放置在37℃下熱處理1h，處理前和處理后進(jìn)行取樣。氮藍(lán)四唑(NBT)染色法測定O^2-，參照前人NBT染色法(Lee,Lee et al.2002)，將擬南芥幼苗輕輕從培養(yǎng)皿中取出放在15ml離心管中，加入25mM HEPES緩沖液(pH7.6)，緩沖液中加入了0.1mg/ml NBT(sigma,USA)，在黑暗條件下25℃放置染色2h，倒掉緩沖液，加入85％酒精溶液，脫色24h后在顯微鏡(Olympus,Tokyo,Japan)下觀察并拍照。二甲基聯(lián)苯胺(DAB)染色法檢測法檢測H₂O，依舊參照Lee等的方法，將擬南芥幼苗輕輕從培養(yǎng)皿中取出放在15ml離心管中，0.1mg/ml DAB(sigma,USA)溶解在50mM CAT 緩沖液中，調(diào)pH至5.0。常溫下染色24h，倒掉緩沖液，加入85％酒精溶液，脫色24h后在顯微鏡(Olympus,Tokyo,Japan)下觀察并拍照。

由圖13可以看出，擬南芥幼苗在熱處理前(圖A、C)染色較淺，且WT和轉(zhuǎn)基因株系染色程度無明顯差別，說明在正常情況下不同株系都未受傷害且體內(nèi)ROS含量基本一致，熱處理后(圖B、D)，無論是DAB染色還是NBT染色，各株系的顏色都比處理前變深，表現(xiàn)為DAB染色下的深棕色和NBT染色下的深藍(lán)色，說明擬南芥幼苗都受到了傷害。但比較WT與轉(zhuǎn)基因株系后可以看出，WT植株DAB染色或NBT染色程度明顯深于四個過表達(dá)株系，說明WT植株在熱處理下有更多的ROS，即WT株系在熱脅迫下受到的傷害更大，轉(zhuǎn)FaHsfC1b基因擬南芥幼苗有更強的耐熱性。

熱脅迫下轉(zhuǎn)FaHsfC1b基因擬南芥潛在目標(biāo)基因表達(dá)情況：將盆栽擬南芥WT和轉(zhuǎn)基因株系放置于37℃下熱處理4h，采集處理前和處理后擬南芥葉片，提取RNA后反轉(zhuǎn)錄cDNA，選取了以下四個基因作為潛在的目標(biāo)基因：AtHsp18.1-CI、AtHsp22.0-ER、AtHsp26.5-P(r)、AtHsp70b。以AtActin2作為內(nèi)參基因進(jìn)行qRT-PCR檢測，檢測方法如前所述。所用引物見表1。

表1 qRT-PCR所用引物序列

鑒于C類熱激轉(zhuǎn)錄因子耐熱性下游目標(biāo)基因方面研究的空白，我們參照A類Hsfs，根據(jù)前人所述與熱應(yīng)答有關(guān)的Hsp基因，選取了Hsp18.1-Cl、Hsp22.0-ER、Hsp26.5-P(r)、Hsp70-b四個潛在的目標(biāo)基因。根據(jù)圖14，處理前WT與過表達(dá)株系OE6、OE16中四個目標(biāo)基因表達(dá)量無顯著差別，且表達(dá)量較低。37℃熱處理4h后，四個目標(biāo)基因在五個株系中表達(dá)量激增，且過表達(dá)株系中Hsp基因表達(dá)量都顯著高于WT。說明Hsp18.1-Cl、Hsp22.0-ER、Hsp26.5-P(r)、Hsp70-b四個基因?qū)崦{迫有響應(yīng)，在熱脅迫下對FaHsfC1b基因也有所響應(yīng)。

<110> 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)

<120> 高羊茅“Regenerate” FaHsfC1b基因及其應(yīng)用

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<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> 引物FaHsfC1b-F

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gaattcgcat gggcagcgag tgcaagg 27

<210> 2

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物FaHsfC1b-R

<400> 2

gatatctgta gaacacttgt cccatag 27

<210> 3

<211> 1333

<212> DNA

<213> 高羊茅“Regenerate”

<220>

<223> FaHsfC1b基因

<400> 3

atcagctcgc tccatttgtt gcctccaacg gcgagaaccc aaaagccgtt ccccgggtcg 60

aggccgacgc atgtcggcac gcacagagcg aggtagatac ttgtaaatct actataggcg 120

ccaccgcccc gcccccgacg gaaatatctg cgcacacaca cgtaggccaa cgaccacgcc 180

gagcagagca cgaacagctc gcgcctttct tatccggttc ttgtagctag cttcgttcat 240

gggcagcgag tgcaagggcc accagttcca ggacgacgac gacggcggcg gcggcccggg 300

cgccatcgcg ccgttcgtgg cgaagacgtt ccacatcgtc agcgacccgg ccacggacgc 360

cgtcgtgcgc tggggcggcg ccagcaacac cttcctcgtc ctcgaccccg ccgccttctc 420

cgacttcctc ctccccgcct acttcaagca ccgcaacttt gccagcttcg tccgccagct 480

caacacctac ggtttccgca agatcgatcc ggacaggtgg gagttcgcgc acgagtcgtt 540

cctgcgcggg caggccaagc tgctgccgct gatcgcgcgc aagaagaaga aggccggttc 600

agcgggcagc agggagctat gcgaggagga ggcggaggag gtgcggggca cgatccaggc 660

ggtgcggagg ctgcgtgacg agcggagggg catggaggag gagctgcagt ccatggaccg 720

caggctccgc gccgccgaga accggccggg ccagatgatg gcgttcctcg gcaagctcgc 780

cgacgacccc accgtcgtgc tgcgcgcgat ggtcgccaag aaggaggagc tggccgcggc 840

cggtggcgac ggttccagcc cggagaagag gcggcggatc gtggccgagg acgaggccgg 900

acgcagcgcc gacgacgcgg aggtggtcca gagcagggca ccgtcgttcc ccttctctgc 960

tatgggacaa gtgttctact agtctgactt ccacagtaga tggataggtg tacacgtgtg 1020

atgtgtatat tacgccatgt gacctgtgaa tatattgtaa tttagtgcgg ctatgtttgg 1080

agatagaaga gtctcggcct tcgcggacgt cgcggacgta gaacgtgtgt gtatatcaat 1140

aagctaatct aaatgctttg tttgtcgtgg aaattctgta gccaagataa gcaacttttc 1200

tttttcggtt tcgctaattc tcagtacact gagatttagc ttacagctta gtaaaatatg 1260

tagtcgttga atcgttgaat cgccaaggcc ggctctatct ttcgcgtcct tgggcgaggt 1320

gatgaaagag gcc 1333

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> 引物pEarleyGate103-F

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