本發(fā)明涉及一種用于絲狀支原體山羊亞種的SYBR Green Ⅰ實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)引物，屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

絲狀支原體山羊亞種是絲狀支原體簇的成員之一，是羊支原體性肺炎的病原之一。羊支原體性肺炎的潛伏期平均為18-20d，最快3-6d，最長(zhǎng)為30-40d。其臨床特征主要表現(xiàn)為高熱、咳嗽漸進(jìn)性消瘦以及肺實(shí)質(zhì)、小葉間質(zhì)及胸膜發(fā)生漿液性和纖維素性炎癥，肺部有明顯的肝變?yōu)橹饕卣鞯暮粑兰膊。送膺€可引起乳房炎、角膜結(jié)膜炎和敗血病等。該病的發(fā)病率為19%-90%，死亡率高達(dá)40%。當(dāng)前國(guó)內(nèi)貴州、重慶、內(nèi)蒙古、青海、廣西、福建等地均有該病發(fā)生的報(bào)道。

目前羊支原體性肺炎的診斷方法較少，這主要是由于絲狀支原體山羊亞種屬于絲狀支原體簇成員，絲狀支原體簇成員之間同源性較高，血清學(xué)上有交叉反應(yīng)。當(dāng)前已建立的診斷方法主要有病原分離培養(yǎng)鑒定、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)等。前者費(fèi)時(shí)費(fèi)力，后者不能定量。SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光定量PCR是在普通PCR的基礎(chǔ)上，在反應(yīng)體系中加入熒光染料，利用熒光PCR檢測(cè)儀來(lái)檢測(cè)靶核苷酸序列的技術(shù)，具有特異性強(qiáng)、定量準(zhǔn)確、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。通過(guò)查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)前國(guó)內(nèi)外尚未有針對(duì)絲狀支原體山羊亞種檢測(cè)的SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法。本發(fā)明的建立可以填補(bǔ)該領(lǐng)域的空白。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種用于絲狀支原體山羊亞種的熒光定量PCR檢測(cè)引物。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一種用于絲狀支原體山羊亞種的SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)引物，引物的核苷酸序列為：

上游引物：5’- TGTTGTTGGTGGGTCTGCTT-3’，

下游引物：5’- ACTTTATCAGCCGCCATTTGA-3’，

其目的擴(kuò)增片段為117 bp。

利用本發(fā)明的引物可用于對(duì)絲狀支原體山羊亞種的相應(yīng)基因進(jìn)行檢測(cè)，尤其適用于SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的檢測(cè)。通過(guò)對(duì)反應(yīng)體系和反應(yīng)條件的各種優(yōu)化，建立了一套可用于檢測(cè)絲狀支原體山羊亞種的SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法。具體操作方法如下：

1、引物設(shè)計(jì)：根據(jù)GenBank上公布的絲狀支原體山羊亞種FQ377874.1基因組序列，利用Primer 6.0 軟件對(duì)MLC_1770基因序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，采用BLAST工具進(jìn)行檢索，初步驗(yàn)證其特異性。

2、反應(yīng)體系的優(yōu)化：優(yōu)化出的25μL最佳反應(yīng)體系為：SYBR^? Premix Ex Taq^TM(TIiRNaseH Plus) 12.5μL，上、下游引物（10 μmol/L）各0.5μL，模板2μL，水補(bǔ)足至25μL。最佳反應(yīng)條件為：95℃，30s 預(yù)變性；95℃，5s，60℃，30s，共40 個(gè)循環(huán)。

3、陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品的制備：取1 mL絲狀支原體山羊亞種培養(yǎng)液加入1.5 mL離心管中，10000r/min離心3min，棄上清收集菌體，使用生工組織DNA提取試劑盒提取DNA，利用蛋白質(zhì)核酸儀測(cè)定其濃度，換算成拷貝數(shù)，作為陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品備用。

4、標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的建立：以?xún)?yōu)化的反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以拷貝數(shù)為橫坐標(biāo)，以Ct值為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，判斷陽(yáng)性的標(biāo)準(zhǔn)。

該方法可用于絲狀支原體山羊亞種的病原診斷和流行病學(xué)調(diào)查，為疾病的早期防治提供檢測(cè)方法。

有益效果：

本發(fā)明根據(jù)GenBank登錄的FQ377874.1的MLC_1770基因序列，設(shè)計(jì)特異性引物，于國(guó)內(nèi)外首先建立絲狀支原體山羊亞種的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，該方法特異性好、靈敏度高、重復(fù)性好，可用于檢測(cè)臨床樣品中絲狀支原體山羊亞種的含量。

附圖說(shuō)明

圖1絲狀支原體山羊亞種SYBR Green Ⅰ實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法的擴(kuò)增曲線(xiàn)。

圖2 為絲狀支原體山羊亞種的SYBR Green Ⅰ實(shí)時(shí)熒光定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1 絲狀支原體山羊亞種的SYBR Green Ⅰ熒光定量PCR 方法的建立

一、材料：

絲狀支原體山羊亞種（GenBank 登錄號(hào)：KU870648）

山羊支原體山羊肺炎亞種由中國(guó)科學(xué)院蘭州研究所饋贈(zèng)，大腸桿菌、巴氏桿菌、金黃色葡萄球菌、副豬嗜血桿菌等由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所禽病實(shí)驗(yàn)室和豬病實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng)；綿肺炎支原體、羊口瘡病毒為本科室分離、保存。

二、步驟

1、儀器與試劑：Mastercyclereprealplex熒光定量PCR 儀購(gòu)自eppendorf公司；SYBR^? Premix Ex Taq^TM (TIi RNaseH Plus)、DL2000 Marker 均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；熒光定量PCR管購(gòu)自Axygen。

2. 引物的特異性

引物的特異性是本實(shí)驗(yàn)所建立方法的最重要因素。根據(jù)GenBank登錄的FQ377874.1的MLC_1770基因序列，通過(guò)比對(duì)分析，設(shè)計(jì)引物。

3、陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品的制備

以提取的DNA為模板，取1 mL絲狀支原體山羊亞種培養(yǎng)液加入1.5 mL離心管中，10000r/min離心3min，棄上清收集菌體，使用生工組織DNA提取試劑盒提取DNA，利用蛋白質(zhì)核酸儀測(cè)定其濃度，換算成拷貝數(shù)，作為陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品備用。

4、反應(yīng)條件的優(yōu)化

采用25μL反應(yīng)體系SYBR^? Premix Ex Taq^TM(TIiRNaseH Plus) 12.5μL，PCR上游引物（10μmol/L）0.5μL，PCR 下游引物（10μmol/L）0.5μL，倍比稀釋后的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品2μL，補(bǔ)水至終體積25μL，以出現(xiàn)最小的Ct 值以及在熔解曲線(xiàn)分析中不出現(xiàn)非特異性峰為指標(biāo)，分別對(duì)退火溫度（55～68℃）和引物濃度（0.2～1.0μmol/L）進(jìn)行優(yōu)化。

將陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行連續(xù)10倍系列稀釋?zhuān)?0^-1～10^-8），以?xún)?yōu)化的條件進(jìn)行擴(kuò)增，以拷貝數(shù)為橫坐標(biāo)，以Ct 值為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

對(duì)陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增曲線(xiàn)和標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)顯示，SYBR Green Ⅰ熒光定量PCR 方法對(duì)絲狀支原體山羊亞種的CT與拷貝數(shù)在1.12×10²～1.12×10⁹拷貝/ 反應(yīng)范圍內(nèi)有很好的線(xiàn)性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.996，擴(kuò)增效率為162%。擴(kuò)增曲線(xiàn)見(jiàn)圖1，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)見(jiàn)圖2。

5、特異性檢測(cè)

5.1 特異性檢測(cè)

用優(yōu)化的條件分別檢測(cè)山羊支原體山羊肺炎亞種，大腸桿菌、巴氏桿菌、金黃色葡萄球菌、副豬嗜血桿菌、綿肺炎支原體、羊口瘡病毒核酸樣品進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)其特異性進(jìn)行評(píng)價(jià)。檢測(cè)結(jié)果均為陰性。

5.2 可重復(fù)性及再現(xiàn)性評(píng)估

對(duì)同一陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品設(shè)3個(gè)重復(fù)管，用SYBR Green Ⅰ實(shí)時(shí)熒光定量PCR 進(jìn)行檢測(cè)，評(píng)價(jià)其重復(fù)性，

計(jì)算組內(nèi)變異系數(shù)；將陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品置于-20℃冰箱保存，分別于第7、14、21d 重檢，評(píng)價(jià)其再現(xiàn)性，計(jì)算其組間變異系數(shù)。計(jì)算得組內(nèi)變異系數(shù)為0.60%～2.46%，組間變異系數(shù)為1.07%～2.67%，可重復(fù)性好。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，凡依本發(fā)明申請(qǐng)專(zhuān)利范圍所做的均等變化與修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明的涵蓋范圍。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所

<120> 一種用于絲狀支原體山羊亞種的熒光定量PCR檢測(cè)引物

<130> 2

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tgttgttggt gggtctgctt 20

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

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