本申請是申請日為2012年4月5日、申請?zhí)枮?01280024856.1、發(fā)明名稱為“使用嵌合細胞因子受體逆轉(zhuǎn)腫瘤微環(huán)境的影響”的發(fā)明專利申請的分案申請。本申請要求2011年4月8日提交的美國臨時專利申請系列號61/473,457的優(yōu)先權(quán)，所述文獻通過引用的方式完整并入本文。本發(fā)明的領(lǐng)域至少總體上包括免疫學(xué)、細胞生物學(xué)、分子生物學(xué)和藥學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：常規(guī)化療和放療法經(jīng)常產(chǎn)生不充分的益處，這強調(diào)對新治療藥的需要。體外擴充的腫瘤相關(guān)抗原(taa)特異性細胞毒t淋巴細胞(ctl)的過繼轉(zhuǎn)移可以有效地治療腫瘤，例如包括霍奇金淋巴瘤、鼻咽癌、神經(jīng)母細胞瘤和黑色素瘤。盡管輸注靶向癌表達的taa的ctl在治療上有用，但是至少一些腫瘤利用多種免疫逃避機制，包括下調(diào)抗原表達，和釋放有利于形成th2而非細胞毒性th1型免疫反應(yīng)的可溶性免疫調(diào)節(jié)細胞因子，如il13和il4。本發(fā)明提供為本領(lǐng)域中促進克服這類腫瘤逃避手段的需要解決方案。發(fā)明簡述進行性腫瘤生長可能與免疫反應(yīng)的抑制相關(guān)。許多不同的機制可以有助于免疫逃避，然而許多類型的癌癥已經(jīng)利用細胞因子的調(diào)節(jié)作用來下調(diào)以摧毀癌細胞為目標(biāo)的適宜免疫反應(yīng)。它們通過分泌免疫阻抑性細胞因子做到這點，其中所述免疫阻抑性細胞因子起到招募調(diào)節(jié)性免疫細胞至腫瘤并直接抑制細胞毒性th1t細胞和/或使細胞毒性th1t細胞再極化成無效的th2表型的作用。由癌細胞或周圍腫瘤基質(zhì)分泌的免疫阻抑性細胞因子至少包括白介素(il)13、il4、(轉(zhuǎn)化生長因子β)tgf-β、il6、il8和il-10。本發(fā)明的實施方案提供一項新方案以使腫瘤反應(yīng)性t細胞抵抗腫瘤微環(huán)境存在的免疫阻抑性/抑制性細胞因子。本發(fā)明的某些實施方案涉及使用轉(zhuǎn)基因嵌合細胞因子受體改善腫瘤特異性ctl的擴充和抗腫瘤活性。本發(fā)明的實施方案提供一項新方案以使效應(yīng)th1t細胞抵抗腫瘤微環(huán)境存在的抑制性細胞因子環(huán)境。這類實施方案包括具有嵌合受體的天然或基因修飾的腫瘤特異性t細胞，所述嵌合受體結(jié)合抑制性/阻抑性細胞因子并且使得它們的胞內(nèi)結(jié)果轉(zhuǎn)換成th1免疫刺激性/活化信號，因此改善腫瘤特異性t細胞的功效。例如，本發(fā)明包括載體，如示例性雙順反子逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，所述載體編碼與il2和/或il7細胞因子受體的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域融合的il4和/或il13細胞因子受體的胞外結(jié)構(gòu)域。類似地，本發(fā)明包括載體，如逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，所述載體編碼與il2和/或il1細胞因子受體的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域融合的il10細胞因子受體的胞外結(jié)構(gòu)域。在特定的實施方案中，其中il13、il4和/或il10(或其他)的一種或多種存在微環(huán)境中的癌包括基本上全部實體瘤。具體的示例性癌包括至少：胰腺癌、霍奇金和非霍奇金淋巴瘤、黑色素瘤、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、膠質(zhì)母細胞瘤、肝細胞癌、卵巢癌等。本發(fā)明的實施方案可用來調(diào)節(jié)例如原代t細胞、天然存在的腫瘤抗原特異性細胞毒t淋巴細胞和nk細胞。利用本發(fā)明修飾的t/nk細胞可以在自體或同種異型環(huán)境下使用。在本發(fā)明的一些實施方案中，存在可以使負向免疫調(diào)節(jié)信號轉(zhuǎn)化成正向信號的嵌合分子。僅以舉例方式，這種方案涉及使il-4和/或il-13的胞外結(jié)構(gòu)域與il-2和/或il-7受體的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域融合。這種方案可以用來使得效應(yīng)th1細胞抵抗腫瘤微環(huán)境中經(jīng)常存在的負向細胞因子信號。在一些實施方案中，本發(fā)明提供了使用嵌合細胞因子受體，與il-2和/或il-7受體的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域融合的il-4和/或il-13的胞外結(jié)構(gòu)域，逆轉(zhuǎn)腫瘤微環(huán)境的影響。在特定的實施方案中，本發(fā)明允許使用嵌合細胞因子受體，例如與il-2和il-7受體的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域融合的il-4和il-13的胞外結(jié)構(gòu)域，逆轉(zhuǎn)腫瘤微環(huán)境的影響。在本發(fā)明的一些實施方案中，存在防止對細胞毒性th1t細胞的抑制或其再極化成具有th2表型的細胞的方法，所述方法包括步驟：修飾腫瘤特異性t細胞以包含結(jié)合抑制性或阻抑性細胞因子的嵌合受體，其中經(jīng)抑制性或阻抑性細胞因子與嵌合受體結(jié)合，從而防止對細胞毒性th1t細胞的抑制或使其再極化，因而防止細胞毒性th1t細胞的抑制或再極化。在特定的實施方案中，嵌合受體包含il10、il4和/或il13細胞因子受體的胞外結(jié)構(gòu)域并且包含il2和/或il7細胞因子受體的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。在某些實施方案中，嵌合受體包含免疫阻抑性細胞因子的胞外結(jié)構(gòu)域和傳遞th1信號的細胞因子的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。在某些實施方案中，存在一種載體，其包含嵌合受體，所述嵌合受體包含免疫阻抑性細胞因子受體的胞外結(jié)構(gòu)域和傳遞th1信號的細胞因子受體的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。在一些實施方案中，免疫阻抑性細胞因子的胞外結(jié)構(gòu)域是il10、il4和/或il13細胞因子受體的胞外結(jié)構(gòu)域。在某些實施方案中，傳遞th1信號的細胞因子受體的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域是il2和/或il7細胞因子的細胞因子受體的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。載體可以是任何種類的載體，包括逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體、質(zhì)?；蛳傧嚓P(guān)病毒病毒載體。在特定的實施方案中，嵌合受體包含il4的胞外結(jié)構(gòu)域和il7的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。前文已經(jīng)相當(dāng)廣泛地概述本發(fā)明的特征和技術(shù)優(yōu)點，目的在于可以更好理解隨之而來的本發(fā)明的詳細描述。將在下文描述本發(fā)明的額外特征和優(yōu)點，這形成本發(fā)明權(quán)利要求的主題。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以容易地使用所公開的構(gòu)思和具體實施方案作為修改或設(shè)計用于實施本發(fā)明相同目的其他結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)。本領(lǐng)域技術(shù)人員也應(yīng)當(dāng)認(rèn)識到，這類等同結(jié)構(gòu)不脫離如所附權(quán)利要求書中所述的本發(fā)明精神和范圍。聯(lián)系附圖考慮時，將從以下描述中更好地理解就其組織和操作方法而言據(jù)信是本發(fā)明特征的新特性，連同其他目的和優(yōu)點。然而，將明確地理解，每張圖僅出于說明和描述目的而提供并且是不意在作為限制本發(fā)明的定義。附圖簡述為了更完整地理解本發(fā)明，現(xiàn)在參考結(jié)合附圖所取得的以下描述，其中：圖1.il4和il13信號傳導(dǎo)的示意圖。圖2.a)示例性構(gòu)建體#1和#2的載體圖。b)通過gfp(#1)和morange(#2)表達評價轉(zhuǎn)導(dǎo)效率；c)在10分鐘細胞因子暴露后的磷酸化stat5；d)在il2、4或13存在下培養(yǎng)的轉(zhuǎn)導(dǎo)和對照ctl。圖3示例性構(gòu)建體#3.3b轉(zhuǎn)基因細胞中il4和il13信號傳導(dǎo)的示意圖。圖4il4rα/il7rα(“4/7r”)和報道基因的示例性融合物圖5顯示il4r和morange在轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞上的穩(wěn)定表達。圖6顯示在施用il-4后轉(zhuǎn)基因細胞上的pstat5。圖7表明4/7r表達并未不利地影響ctl功能。圖8顯示表達4/7r的轉(zhuǎn)基因t細胞在il-4的存在下體外增殖。圖9顯示表達4/7r的ctl可以耗盡來自上清液的il4。圖10表明表達4/7r的ctl抵抗其他免疫阻抑性細胞因子。圖11顯示將免疫阻抑性細胞因子的信號傳導(dǎo)改變成t細胞生長因子。圖12-14表明4/7rctl控制腫瘤生長。圖15顯示在某些實施方案中，可以調(diào)節(jié)患者衍生的car-psca修飾的t細胞以例如共表達4/7r。圖16顯示經(jīng)修飾以共表達4/7r的car-pscat細胞保留它們殺傷腫瘤靶的能力。本發(fā)明的具體實施方式i.定義如本說明書中在此所用，“一個”或“一種”可以意指一個(種)或多個(種)。如權(quán)利要求中在此所用，結(jié)合詞語“包含”，詞語“一個”或“一種”可以意指一個(種)或多于一個(種)。如本文所用，“另一個”可以意指事項的至少第二個或更多個。如本文所用的術(shù)語“嵌合細胞因子受體”指來自一種受體的細胞因子結(jié)合部分的工程化受體，所述細胞因子結(jié)合部分與來自不同受體的胞內(nèi)信號傳導(dǎo)部分連接。如本文所用的術(shù)語“細胞因子結(jié)合性胞外結(jié)構(gòu)域”指細胞表面上與細胞因子結(jié)合的細胞因子受體的部分。如本文所用的術(shù)語“信號轉(zhuǎn)導(dǎo)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域”指細胞內(nèi)部負責(zé)在細胞因子結(jié)合時傳遞信號的細胞因子受體的部分。ii.本發(fā)明的一般實施方案為了克服本領(lǐng)域中的障礙并且開發(fā)對抗癌癥的有效免疫治療策略，本發(fā)明的實施方案包括ctl系(具有天然腫瘤特異性的t細胞系)或靶向惡性細胞上表達的抗原的嵌合抗原受體(car)修飾的t細胞，和工程化這些細胞以表達嵌合受體，所述嵌合受體含有與傳遞th1信號的il2rγ和il7rα的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域連接的il13α受體(il13rα1)和il4rα的細胞因子結(jié)合性胞外結(jié)構(gòu)域。在特定的實施方案中，這些操作使得ctl抵抗極化th2的腫瘤微環(huán)境并且反而維持th1信號傳導(dǎo)至靶向taa的ctl?？梢詸z驗癌癥患者樣品并記錄taa表達模式和產(chǎn)生的th2細胞因子的水平和模式。隨后可以確定是否可以擴充針對來自患者pbmc的已表達抗原的ctl并且表征修飾這些ctl的作用，從而它們?nèi)员３謽O化成th1活性，甚至在誘導(dǎo)th2的腫瘤微環(huán)境下也是如此。在特定的實施方案中，針對反應(yīng)性胰腺癌相關(guān)抗原的t細胞(僅舉例)可以從患者的pbmc產(chǎn)生并且受到修飾以保留th1功能，甚至在腫瘤的th2細胞因子環(huán)境下也是如此?？梢匀缦聶z查這類實施方案：1)記錄taa表達模式和評估初次活組織檢查樣品的細胞因子譜；2)產(chǎn)生對多種胰腺癌靶抗原特異的腫瘤反應(yīng)性ctl并且體外評價它們的特異性和功能；和3)通過強制性表達嵌合細胞因子受體，保護ctl免受th2細胞因子的信號傳導(dǎo)的抑制作用。此后，可以評價taa-ctl在患有癌癥(包括胰腺癌)的個體中的安全性和抗腫瘤功效。腫瘤特異性ctl的存活和擴充是對t細胞療法的最佳體內(nèi)功效重要的。雖然施用il2可以產(chǎn)生這些效果，但是它與限制益處的抑制性t細胞群體的毒性和擴充相關(guān)。il7受體的轉(zhuǎn)基因表達可以改善ctl存活和擴充，但是僅在重復(fù)外源性施用il7細胞因子時才有益處，所述il7細胞因子昂貴、依賴于臨床級產(chǎn)物的可獲得性并且可能在腫瘤部位處于不充足的濃度。本發(fā)明的實施方案提供針對il4的受操作的t細胞反應(yīng)，所述il4是一種在幾種腫瘤的微環(huán)境下內(nèi)源性大量存在并且還與促腫瘤發(fā)生作用相關(guān)的細胞因子，所述促腫瘤發(fā)生作用包括癌細胞增殖、保護腫瘤細胞免于凋亡和使細胞毒性腫瘤特異性t細胞再極化成阻抑性th2表型。為逆轉(zhuǎn)il4對腫瘤特異性ctl的抑制性影響并相反使它們可能利用il4作為生長因子，發(fā)明人將逆轉(zhuǎn)錄病毒載體工程化，所述逆轉(zhuǎn)錄病毒載體編碼了與il7r的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域)融合并與允許轉(zhuǎn)基因檢測的morange連接的il4rα胞外結(jié)構(gòu)域(細胞因子結(jié)合部分)。為確定嵌合il4/7r的轉(zhuǎn)基因表達是否改善ctl存活和擴充，發(fā)明人使用ebv-特異性ctl殺傷epsteinbarr病毒+(ebv+)腫瘤。在轉(zhuǎn)導(dǎo)后，通過流式細胞術(shù)(雙陽性morange，il4r)在13-76％的ebv-ctl中可檢測到il4/7rctl。轉(zhuǎn)基因分子是有功能的，因為il4的添加僅在ebv-ctl/il4/7r+中以與施用il2后所實現(xiàn)的水平類似的水平磷酸化stat5。轉(zhuǎn)基因ctl和對照ctl均應(yīng)答于il2而擴充(從1x106個細胞分別增加至3.5x107個細胞和5.3x107個細胞)，但是ebv-ctl/il4/7r+僅在il4存在下(1000ul/ml)在1周內(nèi)擴充(從1x106個ctl分別增至2.9x107個ctl與3.2x106個ctl)。如預(yù)期那樣，與il2存在下培養(yǎng)的ctl相比，ebv-ctl的轉(zhuǎn)基因亞群在il4存在下受到正向選擇(在1周內(nèi)從13％增至80％)。在采用il4擴充后，轉(zhuǎn)基因ctl仍是多克隆的，具有效應(yīng)子記憶譜，并且保留由ifnγ釋放、ebv五聚物結(jié)合和自體ebv-lcl的mhc限制型殺傷所度量的抗原特異性。重要地，ctl擴充嚴(yán)格地保持抗原和細胞因子依賴性，當(dāng)任一種刺激撤除，則擴充終止。這些體外特征在異體移植物小鼠模型中體內(nèi)復(fù)制，在所述小鼠模型中ebv-ctl/il4/7r應(yīng)答于il2或il4而擴充并且維持它們的抗ebv-腫瘤活性。最后，在從產(chǎn)生il-4的腫瘤收獲的上清液存在下培養(yǎng)ctl。僅轉(zhuǎn)基因ctl耗盡來自培養(yǎng)基的細胞因子。因此，在本發(fā)明的實施方案中，il4/7rctl能夠利用腫瘤衍生的il4作為生長因子并且充當(dāng)耗盡來自腫瘤微環(huán)境的細胞因子的接收器，因此使得惡性腫瘤缺乏否則將有益于腫瘤生長和存活的蛋白質(zhì)。iii.腫瘤相關(guān)抗原在其中采用多種taa特異性ctl治療和/或預(yù)防癌癥的實施方案中，可以靶向多種taa。腫瘤抗原是腫瘤細胞中產(chǎn)生的在宿主中觸發(fā)免疫反應(yīng)的物質(zhì)。示例性腫瘤抗原至少包括以下：腸癌的癌胚抗原(cea)；卵巢癌的ca-125；乳腺的muc-1或上皮腫瘤抗原(eta)或ca15-3癌；惡性黑色素瘤的酪氨酸酶或黑色素瘤相關(guān)抗原(mage)；和多種類型腫瘤的ras、p53的異常產(chǎn)物；肝瘤、卵巢癌或睪丸癌的α胎蛋白；患有睪丸癌的男性的hcg的β亞基；前列腺特異性抗原的前列腺癌；多種骨髓瘤和在一些淋巴瘤中的β2微球蛋白；結(jié)直腸癌、膽管癌和胰腺癌的ca19-9；肺癌和前列腺癌的嗜鉻粒蛋白a；黑色素瘤、軟組織肉瘤和乳腺癌、結(jié)腸癌及肺癌的ta90、gp100和melana/mart1。腫瘤抗原的例子是本領(lǐng)域已知的，例如在cheever等人,2009中，所述文獻通過引用的方式完整并入本文。腫瘤抗原的具體例子至少包括cea、mhc、ctla-4、gp100、間皮素、pd-l1、trp1、cd40、egfp、her2、tcrα、trp2、tcr、muc1、cdr2、ras、4-1bb、ct26、gitr、ox40、tgf-α。例如wt1、muc1、lmp2、hpve6e7、egfrviii、her-2/neu、magea3、p53非突變體、ny-eso-1、psma、gd2、melana/mart1、ras突變體、gp100、p53突變體、蛋白酶3(pr1)、bcr-abl、酪氨酸酶、存活素、psa、htert、epha2、pap、ml-iap、afp、epcam、erg(tmprss2ets融合基因)、na17、pax3、alk、雄激素受體、細胞周期蛋白b1、聚唾液酸、mycn、rhoc、trp-2、gd3、巖藻糖基gm1、間皮素、psca、magea1、sle(a)、cyp1b1、plac1、gm3、boris、tn、globoh、etv6-aml、ny-br-1、rgs5、sart3、stn、碳酸酐酶ix、pax5、oy-tes1、精子蛋白17、lck、hmwmaa、akap-4、ssx2、xage1、b7h3、豆莢蛋白、tie2、page4、vegfr2、mad-ct-1、fap、pdgfr-β、mad-ct-2和fos-相關(guān)抗原1。iv.核酸本發(fā)明的核酸可以編碼嵌合細胞因子受體。核酸可以源自基因組dna、互補性dna(cdna)或合成性dna。如本文所用的“核酸”包括單鏈和雙鏈分子，以及dna、rna、化學(xué)修飾的核酸及核酸類似物。構(gòu)思本發(fā)明范圍內(nèi)的核酸可以具有幾乎任何尺寸，部分地由編碼的蛋白質(zhì)或肽的長度決定。構(gòu)思了嵌合細胞因子受體可以由編碼適宜氨基酸序列的任何核酸序列編碼。使用標(biāo)準(zhǔn)化密碼子表，編碼所需氨基酸序列的核酸的設(shè)計和產(chǎn)生是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。在優(yōu)選的實施方案中，可以修飾經(jīng)選擇用于編碼每種氨基酸的密碼子以優(yōu)化核酸在目的宿主細胞中的表達。v.定向遞送基因治療載體在本發(fā)明的具體實施方案中，使用允許整合而非瞬時表達的載體，如逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒和轉(zhuǎn)座子。存在可以借以向細胞中引入基因治療載體的許多方式。在本發(fā)明的某些實施方案中，基因治療載體包括病毒。某些病毒借助受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進入細胞、整合至宿主細胞基因組中或以附加體方式維持和穩(wěn)定且高效表達病毒基因的能力已經(jīng)使它們成為誘人的轉(zhuǎn)移外來基因至哺乳動物細胞中的候選者(ridgeway,1988；nicolas和rubinstein,1988.；baichwal和sugden,1986；temin,1986)。優(yōu)選的基因治療載體通常是病毒載體。用作基因治療載體的dna病毒包括乳多空病毒(例如，猴病毒40，牛乳頭瘤病毒和多瘤病毒)(ridgeway,1988；baichwal和sugden,1986)和腺病毒(ridgeway,1988；baichwal和sugden,1986)。其他基因轉(zhuǎn)移載體可以從逆轉(zhuǎn)錄病毒構(gòu)建。(coffin,1990)為了構(gòu)建體逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，將編碼目的蛋白的核酸插入病毒基因組中替代某些病毒序列以產(chǎn)生復(fù)制缺陷的病毒。為了產(chǎn)生病毒粒，構(gòu)建含有g(shù)ag、pol和env基因但沒有l(wèi)tr和包裝組件的包裝細胞系(mann等人,1983)。將含有cdna連同逆轉(zhuǎn)錄病毒ltr和包裝序列的重組質(zhì)粒導(dǎo)入這種細胞系(例如通過磷酸鈣沉淀法)時，包裝序列允許重組質(zhì)粒的rna轉(zhuǎn)錄物包裝至病毒顆粒中，后者隨后分泌至培養(yǎng)基中(nicolas和rubenstein,1988；temin,1986；mann等人,1983)。隨后將含有重組逆轉(zhuǎn)錄病毒的培養(yǎng)基收集，任選地濃縮，并用于基因轉(zhuǎn)移。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體能夠感染廣泛種類的細胞類型。然而，整合和穩(wěn)定表達需要宿主細胞分裂(paskind等人,1975)。其他病毒載體可以用作定向基因治療載體?？梢允褂迷醋圆《救缍幻绮《?ridgeway,1988；baichwal和sugden,1986；coupar等人,1988)、腺聯(lián)病毒(aav)(ridgeway,1988；baichwal和sugden,1986；hermonat和muzycska,1984)和皰疹病毒的載體。在本發(fā)明的又一個實施方案中，基因治療構(gòu)建體可以包埋于脂質(zhì)體中。脂質(zhì)體介導(dǎo)的核酸遞送和外來dna體外表達已經(jīng)非常成功的。wong等人(1980)在培養(yǎng)的雞胚、hela和肝瘤細胞中展示脂質(zhì)體介導(dǎo)的外來dna遞送和表達的可行性。nicolau等人(1987)實現(xiàn)靜脈內(nèi)注射后在大鼠中成功的脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移。本發(fā)明的基因治療載體可以包含各種轉(zhuǎn)基因，它們一般由表達載體的dna或rna編碼?；蛑委熆梢杂糜诒磉_治療性基因、表達apa以增強新生血管化或用于抑制apa表達以治療與新生血管化相關(guān)的疾病狀態(tài)。dna可以處于以下形式：cdna、體外聚合的dna、質(zhì)粒dna、質(zhì)粒dna的部分、源自病毒的遺傳物質(zhì)、線性dna、載體(p1、pac、bac、yac、人工染色體)、表達盒、嵌合序列、重組dna、染色體dna、寡核苷酸、反義dna、或這些群組的衍生物。rna可以處于以下形式：寡核苷酸rna、trna(轉(zhuǎn)移rna)、snrna(小的核rna)、rrna(核糖體的rna)、mrna(信使rna)、體外聚合的rna、重組rna、嵌合序列、反義rna、sirna(小干擾性rna)、核酶或這些群組的衍生物。反義多核苷酸是干擾dna和/或rna功能的多核苷酸。反義多核苷酸包括但不限于：嗎啉代、2'-o-甲基多核苷酸、dna、rna等。sirna包含雙鏈結(jié)構(gòu)，所述雙鏈結(jié)構(gòu)一般含有15-50堿基對和優(yōu)選地21-25堿基對并且具有與細胞內(nèi)部表達的靶基因或rna相同或幾乎相同的核苷酸序列。干擾可以導(dǎo)致表達的抑制。多核苷酸也可以其在細胞中的存在或表達改變細胞基因或rna(例如，apa)的表達或功能的序列。此外，dna和rna可以是單鏈、雙鏈、三鏈或四鏈的。vi.藥物組合物本發(fā)明的藥物組合物包含有效量的一種或多種組合物，所述組合物包含溶解或分散于可藥用載體中的載體或攜帶載體的細胞，其中所述載體編碼如本文所述的本發(fā)明嵌合細胞因子受體。短語“可藥用或藥理學(xué)可接受的”指當(dāng)施用至動物(如果適宜，例如人)時不產(chǎn)生不良、變應(yīng)性或其他不利反應(yīng)的分子實體和組合物。根據(jù)本公開，制備含有至少一種本發(fā)明組合物或額外有效成分的藥物組合物將是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，如remington'spharmaceuticalsciences,第18版,mackprintingcompany,1990所例舉，所述文獻通過引用方式并入本文。另外，對于動物(例如，人類)施用，應(yīng)當(dāng)理解制品應(yīng)當(dāng)滿足如fda生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)辦公室所要求的無菌性、致熱原性、總體安全性和純度標(biāo)準(zhǔn)。如本文所用，“可藥用載體”包括任何和全部溶劑、分散介質(zhì)、包衣、表面活性劑、抗氧化劑、防腐劑(例如，抗菌藥、抗真菌藥)、等滲劑、吸收延遲劑、鹽、防腐劑、藥物、藥物穩(wěn)定劑、凝膠、粘合劑、賦形劑、崩解劑、潤滑劑、甜味劑、矯味劑、染料、這類相似材料和其組合，如本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將已知(見例如，remington'spharmaceuticalsciences,第18版,mackprintingcompany,1990,第1289-1329頁，所述文獻通過引用方式并入本文)。除了任何常規(guī)載體與有效成分不相容的情況下之外，構(gòu)思了所述載體在治療組合物或藥物組合物中的用途。本發(fā)明的治療組合物和診斷組合物可以包含不同類型的載體，這取決于是否將以固態(tài)、液態(tài)或氣溶膠形式施用它和對于這類施用途徑是否需要它是無菌的?？梢詫⒈景l(fā)明按靜脈內(nèi)、皮內(nèi)、動脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、病灶內(nèi)、顱內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、胸膜內(nèi)、氣管內(nèi)、腫瘤內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、囊內(nèi)、舌下方式、通過吸入(例如氣溶膠吸入)、注射、輸注、連續(xù)輸注、直接局限化灌流浸浴靶細胞、借助導(dǎo)管、借助灌洗、以脂質(zhì)組合物(例如、脂質(zhì)體)或通過其他方法或前述方式的任何組合施用，如本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將已知(見例如，remington'spharmaceuticalsciences,第18版,mackprintingcompany,1990,所述文獻通過引用方式并入本文)。向受試者施用的本發(fā)明組合物的實際劑量可以由身體和生理因素如體重、病狀嚴(yán)重性、正在治療的疾病的類型、先前或同時存在的治療性介入、患者特發(fā)病決定并且取決于施用途徑。在任何情況下，負責(zé)施用的執(zhí)業(yè)者將決定用于單個受試者的組合物中的有效成分濃度及適宜劑量。在某些實施方案中，藥物組合物可以包含例如至少約0.1％的活性化合物。在其他實施方案中，活性化合物可以例如占到約2％至約75％之間、或約25％至約60％之間以及其間任何可推導(dǎo)范圍的單位重量。在其他非限制性例子中，劑量也可以包括每次施用約1μg/kg/體重、約5μg/kg/體重、約10μg/kg/體重、約50μg/kg/體重、約100μg/kg/體重、約200μg/kg/體重、約350μg/kg/體重、約500μg/kg/體重、約1mg/kg/體重、約5mg/kg/體重、約10mg/kg/體重、約50mg/kg/體重、約100mg/kg/體重、約200mg/kg/體重、約350mg/kg/體重、約500mg/kg/體重至約1000mg/kg/體重或更多，及其間任何可推導(dǎo)范圍。在從本文中列出的數(shù)值可推導(dǎo)的范圍的非限制性例子中，基于上文描述的數(shù)值，可以施用約5mg/kg/體重至約100mg/kg/體重、約5微克/kg/體重至約500毫克/kg/體重的范圍。在任何情況下，組合物可以包含各種抗氧化劑以遲滯一種或多種組分的氧化。額外地，可以通過防腐劑，如各種抗菌劑和抗真菌劑，包括但不限于尼泊金酯(例如，尼泊金甲酯、尼泊金丙酯)、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞或其組合，實現(xiàn)對微生物作用的預(yù)防。在其中組合物為液體形式的實施方案中，載體可以是溶劑或分散介質(zhì)、其包括但不限于水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液體聚乙二醇)、脂類(例如，甘油三酯、植物油、脂質(zhì)體)和其組合。在許多情況下，將優(yōu)選包括等滲劑，例如，糖、氯化鈉或其組合。通過以下方式制備無菌可注射溶液劑：將靶向apa的部分或其綴合物以所要求的量連同上文列舉的多種其他成分一起并入適宜的溶劑中，根據(jù)需要，隨后過濾消毒。通常，通過將多種消毒的有效成分并入無菌溶媒中來制備分散體，所述無菌溶媒含有基礎(chǔ)分散介質(zhì)和/或其他成分。在用于現(xiàn)場制備無菌可注射溶液劑、混懸劑或乳劑的無菌粉末情況下，優(yōu)選的制備方法是真空干燥或冷凍干燥技術(shù)，所述技術(shù)產(chǎn)生有效成分的粉末，外加來自其事先無菌過濾的液體介質(zhì)中的任何額外所需成分。如果需要，應(yīng)當(dāng)合適地緩沖液體介質(zhì)并且首先用足夠的鹽水或葡萄糖使液體稀釋劑在注射之前等滲。也構(gòu)思制備用于直接注射的組合物，其中構(gòu)思使用dmso作為溶劑以導(dǎo)致極端快速的滲透、遞送高濃度的有效藥物至微小區(qū)域。組合物必須在制造和儲存條件下是穩(wěn)定的；因此，受到保護以免微生物如細菌和真菌的污染作用?？梢岳斫鈶?yīng)當(dāng)最小地保持內(nèi)毒素污染處于安全水平，例如，小于0.5ng/mg蛋白質(zhì)。vii.聯(lián)合療法在本發(fā)明的某些實施方案中，用于臨床方面的本發(fā)明方法與有效治療過度增殖性疾病的其他藥劑如抗癌藥組合?！翱拱┧帯蹦軌蚶缤ㄟ^以下方式在受試者中不利地影響癌癥：殺傷癌細胞、在癌細胞中誘導(dǎo)凋亡、降低癌細胞的生長速率、降低轉(zhuǎn)移的發(fā)生率或數(shù)目、減少腫瘤尺寸、抑制腫瘤生長、減少通向腫瘤或癌細胞的血液供應(yīng)、促進針對癌細胞或腫瘤的免疫反應(yīng)、阻止或抑制癌癥進展、或增加癌癥受試者的壽命。更一般地，將以有效殺傷細胞或抑制其增殖的合并量提供這些其他組合物。這種方法可以涉及使癌細胞與表達構(gòu)建體和藥物或多種因子同時接觸。這可以通過以下方式實現(xiàn)：使細胞與包括兩種藥物的單一組合物或藥理學(xué)制劑接觸，或使細胞與兩種不同的組合物或制劑同時接觸，其中一種組合物包含表達構(gòu)建體而另一種組合物包含第二藥物。抵抗化療藥物和放療藥物的腫瘤細胞代表臨床腫瘤學(xué)中的一個主要問題。當(dāng)前癌癥研究的一個目標(biāo)是找出通過與基因治療組合改善化療法和放療法功效的方式。例如，單純皰疹病毒胸苷激酶(hs-tk)基因，在通過逆轉(zhuǎn)錄病毒載體系統(tǒng)遞送至腦腫瘤時，成功地誘導(dǎo)對抗病毒藥更昔洛韋的敏感性(culver等人，1992)。在本發(fā)明的上下文中，構(gòu)思除了其他促凋亡或細胞周期調(diào)節(jié)劑之外，細胞療法可以類似地與化療性、放療性或免疫治療性介入治療結(jié)合使用。可選地，本發(fā)明療法可以在其他藥物之前或在其之后以范圍從數(shù)分鐘至數(shù)周的間隔時間施用。在其他藥物和本發(fā)明分別施加至個體的實施方案中，通常將確保充足的時間段在每次遞送的時間之間不失效，從而該藥物和本發(fā)明療法將仍能夠?qū)毎l(fā)揮有利聯(lián)合的效應(yīng)。在這類情況下，構(gòu)思可以使細胞與兩種藥物在約12-24小時內(nèi)彼此接觸并且更優(yōu)選地6-12小時內(nèi)彼此接觸。然而，在一些情況下，可能合乎需要顯著延長治療時間，其中在相應(yīng)的施用之間逝去幾日(2、3、4、5、6或7日)至幾周(1、2、3、4、5、6、7或8周)。可以使用各種組合，本發(fā)明是“a”和第二種藥劑如放療或化療是“b”：預(yù)期治療循環(huán)將根據(jù)需要重復(fù)。也構(gòu)思各種標(biāo)準(zhǔn)療法以及手術(shù)介入可以與本發(fā)明的細胞療法組合應(yīng)用。a.化療癌癥療法也包括采用基于化學(xué)和輻射的治療法的多種組合療法。組合化療法例如包括abraxane、六甲蜜胺、多西紫杉醇、赫賽汀、甲氨蝶呤、米托蒽醌、諾雷德、順鉑(cddp)、卡鉑、丙卡巴肼、氮芥、環(huán)磷酰胺、喜樹堿、異環(huán)磷酰胺、美法倉、苯丁酸氮芥、白消安、亞硝基脲、更生霉素、佐柔比星、多柔比星、博來霉素、普卡霉素(plicomycin)、絲裂霉素、依托泊苷(vp16)、他莫昔芬、雷洛昔芬、雌激素受體結(jié)合劑、紫杉酚、吉西他濱(gemcitabien)、長春瑞濱、法呢基蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移酶抑制劑、反式鉑、5-氟尿嘧啶、新長春堿、長春堿和甲氨蝶呤、或前述藥物的任何類似物或衍生變體。b.放療造成dna損傷并已經(jīng)廣泛使用的其他因素包括公知作為γ-射線、x射線和/或向腫瘤細胞定向遞送放射性同位素。也構(gòu)思其他形成的dna損傷因素，如微波和uv-照射。最可能的是，全部這些因素對dna、對dna前體、對dna復(fù)制和修復(fù)和對染色體裝配和維持造成寬范圍的損傷。x射線的劑量范圍是從每日劑量50至200倫琴持續(xù)延長的時間段(3至4周)至單劑量的2000至6000倫琴。放射性同位素的劑量范圍廣泛地變動并且取決于同位素半壽期、所發(fā)射的輻射的強度和類型和腫瘤細胞的攝取量。當(dāng)適用于細胞時，術(shù)語“接觸”和“暴露”在本文中用來描述借以遞送治療性構(gòu)建體和化療或放療藥至靶細胞或?qū)⑺鼈冎苯又糜诎屑毎浇倪^程。為了實現(xiàn)細胞殺傷或停滯，將兩種藥物以有效殺傷細胞或防止它分裂的聯(lián)合量遞送至細胞。c.免疫療法免疫治療藥總體上依賴于使用免疫效應(yīng)細胞和分子以靶向和摧毀癌細胞。免疫效應(yīng)子可以例如是對腫瘤細胞表面上的一些標(biāo)記特異的抗體?？贵w單獨可以充當(dāng)療法的效應(yīng)子或它可以招募實際實現(xiàn)細胞殺傷的其他細胞?？贵w也可以與藥物或毒素(化療、放射性核素、蓖麻毒蛋白a鏈、霍亂毒素、百日咳毒素等)綴合并且僅起到導(dǎo)引劑的作用。可選地，效應(yīng)子可以是攜帶與腫瘤細胞靶直接或間接相互作用的表面分子的淋巴細胞。各種效應(yīng)細胞包括細胞毒t細胞和nk細胞。因此，免疫療法可以作為聯(lián)合療法的一部分與本發(fā)明的細胞療法結(jié)合使用。下文討論聯(lián)合療法的一般方案?？傮w上，腫瘤細胞必須攜帶能夠進行靶向(即，大多數(shù)其他細胞上不存在的)的一些標(biāo)記。存在許多腫瘤標(biāo)記并且這些腫瘤標(biāo)記的任一者可以適合于本發(fā)明情境下的靶向。常見的腫瘤標(biāo)記包括癌胚抗原、前列腺特異性抗原、尿路腫瘤相關(guān)抗原、胚胎抗原、酪氨酸酶(p97)、gp68、tag-72、hmfg、唾液酸化路易斯抗原、muca、mucb、plap、雌激素受體、層粘連蛋受體、erbb和p155。d.基因在又一個實施方案中，第二治療是其中在本發(fā)明臨床實施方案之前、之后或與之同時施用治療性多核苷酸的基因治療。本發(fā)明中包括多種表達產(chǎn)物，包括細胞增殖的誘導(dǎo)物、細胞增殖的抑制劑或程序性細胞死亡的調(diào)節(jié)物。e.手術(shù)大約60％患有癌癥的人將經(jīng)歷某種類型的手術(shù)，所述手術(shù)包括預(yù)防、診斷或分期、治愈性和姑息性手術(shù)。治愈性手術(shù)是可以結(jié)合其他療法如本發(fā)明療法、化療法、放療法、激素療法、基因治療、免疫療法和/或替代性療法使用的癌癥療法。治愈性手術(shù)包括其中物理摘除、切除和/或摧毀全部或部分癌組織的切除術(shù)。腫瘤切除指物理摘除至少部分的腫瘤。除腫瘤切除之外，手術(shù)治療包括激光手術(shù)、低溫手術(shù)、電外科手術(shù)和顯微鏡下控制的手術(shù)(mohs手術(shù))。進一步構(gòu)思本發(fā)明可以與摘除淺表癌、初癌或附帶量的正常組織結(jié)合使用。一旦切除全部癌細胞、組織或腫瘤的部分，則可以在身體內(nèi)形成空腔?？梢酝ㄟ^用額外的抗癌療法灌流、直接注射或局部施加該區(qū)域?qū)崿F(xiàn)治療。這種治療可以重復(fù)，例如，每隔1、2、3、4、5、6或7日，或每隔1、2、3、4和5周或每隔1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個月重復(fù)。這些治療也可以變動劑量。f.其他藥劑構(gòu)思了其他藥劑可以與本發(fā)明組合使用以改善療法的治療功效。這些額外藥劑包括免疫調(diào)節(jié)劑、影響細胞表面受體和縫隙連接上調(diào)的藥劑、細胞穩(wěn)定及分化劑、細胞黏附抑制劑或增加過度增殖性細胞對凋亡誘導(dǎo)物的靈敏度的藥劑。免疫調(diào)節(jié)劑包括腫瘤壞死因子；干擾素α、β、和γ；il-2和其他細胞因子；f42k和其他細胞因子類似物；或mip-1、mip-1β、mcp-1、rantes和其他趨化因子。進一步構(gòu)思，細胞表面受體或其配體如fas/fas配體、dr4或dr5/trail的上調(diào)將通過對過度增殖性細胞上建立自分泌或旁分泌效應(yīng)，激動本發(fā)明的凋亡誘導(dǎo)能力。通過提高縫隙連接的數(shù)目增加胞間信號傳導(dǎo)將增加對相鄰過度增殖性細胞群的抗過度增殖作用。在其他實施方案中，細胞穩(wěn)定或分化劑可以與本發(fā)明組合使用以改善療法的抗過度增殖功效。構(gòu)思細胞黏附抑制劑改善本發(fā)明的功效。細胞黏附抑制劑的例子是局部黏著斑激酶(fak)抑制劑和洛伐他汀。還構(gòu)思了增加過度增殖性細胞對凋亡的靈敏度的其他藥劑(如抗體c225)可以與本發(fā)明組合使用以改善治療功效。激素療法也可以與本發(fā)明結(jié)合或與前述任何其他癌癥療法組合使用。激素的用途可以用于治療某些癌癥如乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、或?qū)m頸癌以降低某些激素如睪酮或雌激素的水平或阻斷其作用。這種治療經(jīng)常與至少一個其他癌癥療法組合使用作為治療選項或以便降低轉(zhuǎn)移風(fēng)險。dna甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑和/或組蛋白脫乙酰酶抑制劑示例性dna甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑包括例如5-氮雜胞苷、5-氮雜-2'-脫氧胞苷、1-β-d-阿拉伯呋喃糖基-5-氮雜胞嘧啶和二氫-5-氮雜胞苷。示例性hdac抑制劑包括異羥肟酸，如曲古抑菌素a；環(huán)四肽(如trapoxinb)，和酯肽；苯甲酰胺；親電酮類；和脂族酸化合物如苯基丁酸酯和丙戊酸。g.程序性細胞死亡的調(diào)節(jié)物凋亡或程序性細胞死亡，是正常胚胎發(fā)育、維持成體組織中穩(wěn)態(tài)和抑制癌發(fā)生的重要過程(kerr等人,1972)。已經(jīng)展示bcl-2蛋白家族和ice樣蛋白酶是其他系統(tǒng)中凋亡的重要調(diào)節(jié)物和效應(yīng)子。發(fā)現(xiàn)與濾泡淋巴瘤相關(guān)的bcl-2蛋白在控制凋亡和增強應(yīng)答于各種凋亡性刺激的細胞存活方面發(fā)揮突出作用(bakhshi等人,1985；cleary和sklar,1985；cleary等人,1986；tsujimoto等人,1985；tsujimoto和croce,1986)?，F(xiàn)在認(rèn)為進化上保守的bcl-2蛋白是相關(guān)蛋白質(zhì)家族的成員，所述成員可以歸類為死亡激動劑或死亡拮抗劑。在其發(fā)現(xiàn)后，顯示bcl-2發(fā)揮作用以抑制多種刺激觸發(fā)的細胞死亡。另外，現(xiàn)在已知存在分享共有結(jié)構(gòu)和序列同源性的bcl-2細胞死亡調(diào)節(jié)蛋白家族。這些不同的家族成員已經(jīng)顯示擁有與bcl-2相似的功能(例如，bclxl、bclw、bcls、mcl-1、a1、bfl-1)或?qū)筨cl-2功能并促進細胞死亡(例如，bax、bak、bik、bim、bid、bad、harakiri)。h.生血管抑制劑在某些實施方案中，本發(fā)明可以涉及施用與抗血管生成劑有效連接的靶向部分，所述抗血管生成劑是如血管緊張素、層粘連蛋肽、纖連蛋白肽、纖維蛋白溶酶原激活物抑制劑、組織金屬蛋白酶抑制劑、干擾素、白介素12、血小板因子4、ip-10、gro-β、血小板應(yīng)答蛋白、2-甲氧基雌二醇、增殖蛋白相關(guān)蛋白、羧胺三唑(carboxiamidotriazole)、cm101、馬立馬司他(marimastat)、硫酸戊聚糖聚酯、血管生成素2(regeneron)、干擾素-α、除莠霉素a、pnu145156e、16k催乳素片段、利諾胺、沙立度胺、己酮可可堿、染料木黃酮、tnp-470、內(nèi)皮抑素、紫杉醇、accutin、血管抑制素、西多福韋、長春新堿、博來霉素、agm-1470、血小板因子4或米諾環(huán)素。腫瘤細胞增殖非常依賴于廣泛的腫瘤血管化，這伴隨癌癥進展。因此，已經(jīng)引入采用抗血管生成劑抑制新血管形成和定向破壞既有血管作為有效和相對無毒的腫瘤治療方案。(arap等人,1998；arap等人,1998；ellerby等人,1999)。多種抗血管生成劑和/或血管抑制劑是已知的(例如，folkman,1997；eliceiri和cheresh,2001)。i.細胞毒劑化療(細胞毒)劑可以用來治療各種疾病狀態(tài)，包括癌癥?？赡苁褂玫幕?細胞毒)劑包括但不限于5-氟尿嘧啶、博來霉素、白消安、喜樹堿、卡鉑、苯丁酸氮芥、順鉑(cddp)、環(huán)磷酰胺、更生霉素、佐柔比星、多柔比星、雌激素受體粘合劑、依托泊苷(vp16)、法呢基轉(zhuǎn)移酶抑制劑、吉西他濱、異環(huán)磷酰胺、氮芥、美法倉、絲裂霉素、長春瑞濱、亞硝基脲、普卡霉素(plicomycin)、丙卡巴肼、雷洛昔芬、他莫昔芬、紫杉酚、替莫唑胺(temazolomide)(含水形式的dtic)、反式鉑、長春堿和甲氨蝶呤、長春新堿或前述藥物的任何類似物或衍生變體。大部分化療藥術(shù)語以下類別：烷基化劑、抗代謝物、抗腫瘤抗生素、皮質(zhì)類固醇激素、有絲分裂抑制劑、和亞硝基脲類、激素藥、其他藥劑和任何類似物或其衍生變體?；熕幒褪┯梅椒?、劑量等是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的(見例如，“physiciansdeskreference”,goodman&gilman's“thepharmacologicalbasisoftherapeutics”以及在“remington'spharmaceuticalsciences”第15版，第1035-1038頁和第1570-1580頁中，所述文獻通過引用方式以相關(guān)部分并入本文)，并且可以根據(jù)與本文公開內(nèi)容與本發(fā)明公開。取決于正在接受治療的患者的狀況，劑量的一些變動將必然地出現(xiàn)。在任何情況下，負責(zé)施用的人將決定各個受試者的適宜劑量。當(dāng)然，本文所述的全部劑量和藥劑是示例性的，而非限制的，并且其他劑量或藥劑可以由技術(shù)人員用于特定患者或應(yīng)用。在這些點之間的任何劑量或其中可推導(dǎo)的范圍也預(yù)期用于本發(fā)明中。j.烷基化劑烷基化劑是直接與dna基因組相互作用以阻止細胞增殖的藥物。這類的化療藥物代表影響細胞周期全部階段的藥劑，即，它們不是階段特異性的。烷基化劑，可以包括但不限于氮芥、乙烯亞胺(ethylenimene)、甲基蜜胺、烷基磺酸酯、亞硝基脲或三嗪類。它們包括但不限于：白消安、苯丁酸氮芥、順鉑、環(huán)磷酰胺(cytoxan)、達卡巴嗪、異環(huán)磷酰胺、氮芥(mustargen)和美法侖。k.抗代謝物抗代謝物破壞dna和rna合成。不同于烷基化劑，它們特別地影響s期期間的細胞周期?？勾x物可以劃分成各種類別，如葉酸類似物、嘧啶類似物和嘌呤類似物和相關(guān)的抑制性化合物。抗代謝物包括但不限于5-氟尿嘧啶(5-fu)、阿糖胞苷(ara-c)、氟達拉濱、吉西他濱和甲氨蝶呤。l.天然產(chǎn)物天然產(chǎn)物通常指最初從天然來源分離并經(jīng)鑒定具有藥理學(xué)活性的化合物。這類化合物、其類似物和衍生物可以從天然來源分離、化學(xué)合成或通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何技術(shù)重組地產(chǎn)生。天然產(chǎn)物包括這些類別，如有絲分裂抑制劑、抗腫瘤抗生素、酶和生物反應(yīng)調(diào)節(jié)物。有絲分裂抑制劑包括植物生物堿和可以抑制細胞分裂或有絲分裂所需要的蛋白質(zhì)合成的其他天然物質(zhì)。它們在細胞周期期間的特定階段期間起作用。有絲分裂的抑制劑包括例如多西紫杉醇、依托泊苷(vp16)、替尼泊苷、紫杉醇、紫杉酚、長春堿、長春新堿和長春瑞濱。紫杉醇類化合物是從灰樹短葉紅豆杉(taxusbrevifolia)的樹皮分離的一類相關(guān)化合物。紫杉醇類化合物包括但不限于諸如多西紫杉醇和紫杉醇之類的化合物。紫杉醇與微管蛋白結(jié)合(在不同于長春堿類生物堿所利用的位點處)且促進微管的裝配。蔓長春花屬生物堿是經(jīng)鑒定具有藥物活性的一類植物生物堿。它們包括這類化合物如長春堿(vlb)和長春新堿。m.抗生素某些抗生素具有抗微生物活性和細胞毒活性。通過化學(xué)地抑制酶和有絲分裂或改變細胞膜，這些藥物也干擾dna。這些藥物不是階段特異性的，因此它們在細胞周期全部階段中發(fā)揮作用。細胞毒性抗生素的例子包括但不限于博來霉素、更生霉素、佐柔比星、多柔比星(阿霉素)、普利霉素(光神霉素)和伊達比星。n.其他藥劑不屬于前述分類的其他細胞毒藥物包括但不限于鉑配位絡(luò)合物、蒽二酮類、取代脲、甲基肼衍生物、安吖啶、l-天冬酰胺酶，和維甲酸(tretinoin)。鉑配位絡(luò)合物包括這類化合物如卡鉑和順鉑(順-ddp)。示例性蒽二酮是米托蒽醌。示例性取代脲是羥基脲。示例性甲基肼衍生物是丙卡巴肼(n-甲基肼，mih)。這些實例不是限制性的，并且構(gòu)思任何已知的細胞毒劑、細胞穩(wěn)定劑或殺細胞劑可以與靶向肽連接并且施用至本發(fā)明范圍內(nèi)的所靶向的器官、組織或細胞類型。viii.本發(fā)明的試劑盒可以在試劑盒中包含本文所述的任何組合物。在非限制性實例中，包含嵌合細胞因子受體的修飾細胞和/或產(chǎn)生這類細胞的試劑可以包含于試劑盒中。這類試劑包括細胞、核酸載體、緩沖劑、核苷酸、寡核苷酸等中的一種或多種。試劑盒將在一個或多個適合的容器中包含其任何組分。試劑盒的組分可以在含水介質(zhì)中或以凍干形式包裝。試劑盒的容器裝置通常將包括至少一個小瓶、試管、燒瓶、瓶、注射器或其他容器裝置，其中可以安置并且優(yōu)選地適當(dāng)?shù)确纸M分。在試劑盒中存在多于一種組分的情況下，試劑盒通常也將含有其中可以分別放置額外組分的第二、第三或其他額外容器。然而，可以在小瓶中包含組分的各種組合。本發(fā)明的試劑盒一般也將包括以用于商業(yè)銷售的密封含有組分的裝置。這類容器可以包括留置所需小藥瓶的注塑或吹塑成型塑料容器。試劑盒的組分可以作為干燥粉末提供。當(dāng)試劑和/或組分作為干燥粉末提供時，可以通過添加合適的溶劑使粉末復(fù)水。構(gòu)思了也可以在另一個容器裝置中提供溶劑。實施例將如下實施例包括在內(nèi)以闡述本發(fā)明的優(yōu)選實施方案。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，以下的實施例中公開的技術(shù)代表由發(fā)明人發(fā)現(xiàn)的在實施本發(fā)明時發(fā)揮良好作用的技術(shù)，并且因此可以視為構(gòu)成其實施的優(yōu)選模式。然而，根據(jù)本公開，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解可以在公開的具體實施方案中產(chǎn)生許多變化并且仍獲得類似或相似的結(jié)果而不脫離本發(fā)明的精神和范圍。實施例1使用嵌合細胞因子受體逆轉(zhuǎn)腫瘤微環(huán)境的影響胰腺癌仍是發(fā)達國家中第四種最常見的癌癥死亡原因。臨床表現(xiàn)發(fā)生晚并且疾病早期轉(zhuǎn)移，發(fā)生率和死亡率已經(jīng)保持幾乎相同超過50年(sweeney等人,2009；wong等人,2009)。因此需要基于理解疾病生物學(xué)的改進治療策略。由惡性細胞表達的腫瘤相關(guān)抗原(taa)可以具有免疫原性，并因此是免疫破壞的潛在靶(tassi等人,2008；han等人,2009；rong等人,2009；li等人,2008；plate,2007)。體外擴充的taa特異性細胞毒t淋巴細胞(ctl)的過繼轉(zhuǎn)移可以有效地治療腫瘤，例如包括霍奇金淋巴瘤和黑色素瘤(bollard等人,2007；morgan等人,2006)。盡管輸注靶向胰腺癌表達的taa的ctl具有治療潛力，這些腫瘤利用多種免疫逃避機制，包括下調(diào)抗原表達，和釋放有利于形成th2而非細胞毒性th1型免疫反應(yīng)的可溶性免疫調(diào)節(jié)細胞因子和其他物質(zhì)(leen等人,2007；selcean等人,2009；formentini等人,2009；kornmann等人,1999；prokopchuk等人,2005；seruga等人,2008)。為了克服這些障礙并且開發(fā)對抗胰腺癌的有效免疫治療策略，本發(fā)明的實施方案涉及生成靶向惡性細胞上表達的抗原的ctl系，并且工程化這些ctl以表達嵌合分子，所述嵌合分子含有與傳遞th1信號的il2rγ和il7rα的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域連接的il13α受體(il13rα1)和il4rα的細胞因子結(jié)合性胞外結(jié)構(gòu)域(formentini等人,2009；prokopchuk等人,2005)。在本發(fā)明的特定實施方案中，這些操作使得ctl抵抗極化th2的腫瘤微環(huán)境并且反而維持th1信號傳導(dǎo)至靶向taa的ctl(vera等人,2009)。可以通過檢驗來自癌癥患者(如胰腺癌患者)的活組織檢查和血清樣品來開始，并記錄taa表達模式和產(chǎn)生的th2細胞因子的水平和模式。隨后可以確定是否可以擴充針對來自患者pbmc的已表達抗原的ctl并且修飾這些ctl的作用，從而它們?nèi)员３謽O化成th1活性，甚至在誘導(dǎo)th2的腫瘤微環(huán)境下也是如此。在本發(fā)明的實施方案中，針對反應(yīng)性胰腺癌相關(guān)抗原的t細胞可以從患者的pbmc產(chǎn)生并且受到修飾以保留th1功能，甚至在腫瘤的th2細胞因子環(huán)境下也是如此。這類實施方案可以由三種示例性方法表征：1)記錄taa表達模式和評估初次活組織檢查樣品的細胞因子譜；2)產(chǎn)生對多種胰腺癌靶抗原特異的腫瘤反應(yīng)性ctl并且體外評價它們的特異性和功能；和3)通過強制性表達嵌合細胞因子受體，保護ctl免受th2細胞因子的信號傳導(dǎo)抑制性作用。背景和意義胰腺癌.胰腺癌在世界范圍造成每年估計213,000例死亡(wong等人,2009)。手術(shù)切除仍是唯一治愈性療法，導(dǎo)致15-20％的5年存活率，但是這種選項不可用于診斷患有局部晚期或轉(zhuǎn)移性疾病的絕大部分患者(sweeney等人,2009；tanis等人,2009)。常規(guī)化療和放療法幾乎不產(chǎn)生實質(zhì)益處，這強調(diào)對新治療藥的需要。用于病毒相關(guān)性惡性腫瘤的過繼免疫療法.發(fā)明人已經(jīng)常規(guī)地產(chǎn)生病毒特異性ctl用于過繼轉(zhuǎn)移(leen等人,2006；leen等人,2009)，并且在超過100位干細胞細胞接受者中的研究已經(jīng)顯示供體衍生的ebv-ctl可以安全地保護患者對抗ebv驅(qū)動的淋巴瘤并且治愈甚至存在嚴(yán)重已建立病情的患者(heslop等人,2009；heslop等人,1996；rooney等人,1995)。這種方案也已經(jīng)顯示成功治療免疫功能健全個體中的ebv+ve腫瘤(bolard等人,2007；louis等人,2009；straathof等人,2005；bollard等人,2004)。在最近一項i期試驗中，在高風(fēng)險ebv+vehl或nhl緩解時接受治療的9/10患者仍處于緩解，而5/6存在活躍復(fù)發(fā)病情的患者具有腫瘤緩解，所述腫瘤緩解在4位患者中是完全的(bollard等人,2007)。這些研究展示，ebv特異的功能性t細胞在輸注后在患者血液中頻率增加(暗示體內(nèi)擴充)、尋的至腫瘤組織并消除腫瘤細胞。用于病毒非依賴性惡性腫瘤的過繼免疫療法.利用過繼轉(zhuǎn)移的ctl治療病毒非依賴性癌癥的努力已經(jīng)受阻于(i)關(guān)于taa表達的信息有限，(ii)鑒于循環(huán)的反應(yīng)性t細胞經(jīng)常遭遇失能或耐受，缺少可重復(fù)方法以產(chǎn)生針對已表達抗原的ctl系，和(iii)腫瘤利用的免疫逃避策略，這些策略限制過繼轉(zhuǎn)移的t細胞的體內(nèi)活性。這些策略包括下調(diào)表達的靶抗原和分泌抑制性細胞因子，所述抑制性細胞因子起到招募調(diào)節(jié)性免疫細胞至腫瘤并直接抑制和/或使細胞毒性th1t細胞針對無效th2表型再極化的作用(selcean等人,2009；formentini等人,2009；prokopchuk等人,2005)。使用優(yōu)化的抗原呈遞細胞(apc)和增強性細胞因子以產(chǎn)生taa-ctl，發(fā)明人已經(jīng)開發(fā)了活化遭失能/耐受的t細胞的策略(kaka等人,2009；foster等人,2007；kaka等人,2008)。發(fā)明人在下文提供多種策略以鑒定胰腺癌表達的靶并調(diào)節(jié)體外產(chǎn)生的taa-ctl對腫瘤微環(huán)境存在的細胞因子的反應(yīng)；開發(fā)這些策略以便使用過繼免疫療法靶向胰腺癌。確定taa表達模式.已經(jīng)存在由胰腺癌活組織檢查樣品表達的taa的有限報道。因此，可以例如使用免疫組織化學(xué)(ihc)和rt-pcr，全面記錄胰腺癌中的taa表達。體外產(chǎn)生taa特異性ctl.發(fā)明人已經(jīng)開發(fā)了使用表達完整抗原(pepmix或編碼taa的質(zhì)粒)的dc作為apc從患者pbmc中產(chǎn)生taa-ctl并且以最佳細胞因子混合物共培養(yǎng)的方案(表1)。也可以確定這種策略是否可以適用于產(chǎn)生靶向胰腺癌相關(guān)抗原的taa-ctl?？朔[瘤免疫逃避策略.對于有效免疫療法，必須表征和規(guī)避腫瘤免疫逃避策略。il13和il4均對抑制和再極化th1效應(yīng)子t細胞作出主要貢獻，所述th1效應(yīng)子t細胞對胰腺癌中消除腫瘤至關(guān)重要(formentini等人,2009；prokopchuk等人,2005)?？梢杂们逗霞毎蜃邮荏w表征武裝性taa-ctl，所述嵌合細胞因子受體結(jié)合這些抑制性細胞因子并且使得它們的胞內(nèi)結(jié)果轉(zhuǎn)換成th1信號，因此改進ctl的功效。示例性結(jié)果檢測癌癥活組織檢查樣品上的taa.為了將該方案初步建模，從源自tch的病理科、methodist醫(yī)院和兒童腫瘤學(xué)組織的霍奇金疾病或濾泡性b細胞淋巴瘤患者獲得石蠟包埋的4μm淋巴結(jié)切片。將切片脫石蠟和復(fù)水。triton-x-100和digestall1(zymed)用于抗原修復(fù)。切片用針對mage-a4、prame和存活素的第一抗體染色。用(i)針對兔或小鼠第一抗體的powervision+試劑盒(immunovision)或(ii)針對其他第一抗體的abc試劑盒(vectorlabs)成功地檢測到抗原表達。全部抗體均使用陽性對照和陰性對照切片和含有非癌組織的組織陣列驗證。使用pepmix刺激的或質(zhì)粒胞核轉(zhuǎn)染的apc產(chǎn)生同時對多種taa具有特異性的taa-ctl.發(fā)明人通過以下方式優(yōu)化ctl產(chǎn)生方案：使用以涵蓋示例性淋巴瘤相關(guān)抗原ssx2、存活素和magea4的pepmix主混合物刺激的dc作為apc并且在il7(10ng/ml)、il12(10ng/ml)、il15(10ng/ml)和il6(1000u/ml)存在下共培養(yǎng)(表1)。組th1極化增殖/存活抑制調(diào)節(jié)性t細胞(tregs)1il-12il7；il-152il-12il7；il-15il-63il-12，il-27il7；il-154il-12，il-27il7；il-15il-6生成對全部三種刺激抗原同時具有特異性的taa-ctl。重要地，使用相同抗原從相同供體產(chǎn)生，但是使用次優(yōu)細胞因子組合所培養(yǎng)的ctl(表1；組1、3、4)產(chǎn)生針對免疫優(yōu)勢ssx2抗原的單特異性ctl，因此在至少某些實施方案中展示了優(yōu)化細胞因子組合以產(chǎn)生多種tm-ctl的用途。通過使用以編碼ssx2、存活素和magea4的dna質(zhì)粒經(jīng)核轉(zhuǎn)染的dc從6/6供體產(chǎn)生多種tm-ctl，證實該系統(tǒng)的一致性和穩(wěn)健性。發(fā)明人也產(chǎn)生同時靶向白血病表達的抗原wt1、prame、存活素和蛋白酶3(n＝3)以及示例性肝細胞表達的抗原mage1、mage3和afp(n＝3)的多種taa-ctl。這些多種taa-ctl是有功能的，如通過ifnγelispot和細胞毒性測定法所評估?？梢圆捎眠@項技術(shù)來產(chǎn)生靶向最頻繁表達的胰腺癌表達抗原的多種taa-ctl。逆轉(zhuǎn)th2信號傳導(dǎo)對ctl的作用并且確保暴露于這些細胞因子而非維持th1型反應(yīng).工程化2種逆轉(zhuǎn)錄病毒中間構(gòu)建體和在轉(zhuǎn)基因ctl中的初步測試。已經(jīng)報道以共有組分與受體結(jié)合的th2細胞因子il4和il13在患有胰腺癌的受試者中抑制th1免疫力(formentini等人,2009；prokopchuk等人,2005)。il13受體由il4rα鏈和il-13rα1鏈組成。il13細胞因子以低親和力與il13α1鏈結(jié)合，隨后招募il4rα鏈以增加結(jié)合親和力。相反，il4首先結(jié)合il4rα，后者隨后招募il13rα1或il2rγc鏈(圖1)。來自兩種受體復(fù)合體的信號由il4rα鏈轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而il4和il13招募相同的janus激酶(jak)信號傳導(dǎo)者和轉(zhuǎn)錄激活物(stat6)途徑。作為結(jié)果，暴露于任一種細胞因子具有重疊的免疫抑制結(jié)果(formentini等人,2009；prokopchuk等人,2005)。為了對抗在th1taa-ctl上的這些作用，發(fā)明人構(gòu)建了兩種示例性第一代逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。如圖2a中所述，構(gòu)建體#1編碼經(jīng)ires與gfp連接的il13rα1胞外結(jié)構(gòu)域與il2rγ胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(il-13rα1/il-2rγ)的融合蛋白。構(gòu)建體#2編碼與morange連接的il4rα胞外結(jié)構(gòu)域與il7rα胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(il-4rα/il-7rα)的融合蛋白。因此，在本發(fā)明的具體實施方案中，一旦結(jié)合il4或il13細胞因子，則共表達兩種構(gòu)建體的細胞誘導(dǎo)胞內(nèi)th1信號。為了評估逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的效率，在雙重轉(zhuǎn)導(dǎo)的抗原特異性ctl上評價gfp或morange的表達。如預(yù)期，這產(chǎn)生表達構(gòu)建體#1(gfp陽性-右下側(cè)四分圖)、構(gòu)建體#2(morange陽性-左上側(cè)四分圖)或雙陽性(gfp/morange-右上四分圖)(圖2b)的ctl的混合群體。通過測量stats暴露于il2(50u/ml)、il-4(1000u/ml)或il13(5ng/ml)后的磷酸化，證實轉(zhuǎn)基因的功能。僅在施用il2后的對照細胞中檢測到磷酸化stat5；相反，在暴露于3種細胞因子中任一種后的共表達兩種構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因細胞中檢測到磷酸化stat5(圖2c)。使用顯微分析，證實這些細胞因子作為生長因子發(fā)揮作用(圖2d)。示例性實驗設(shè)計和方法胰腺癌是預(yù)后不良的侵襲性疾病。雖然存在腫瘤特異性t細胞免疫力的證據(jù)(tassi等人,2008；rong等人,2009；plate，2007；alters等人,1997；cappello等人,2009；lepoisto等人,2008；kawaoka等人,2008；kondo等人,2008)，但是腫瘤環(huán)境中的免疫阻抑性細胞因子限制t細胞的有效性(selcean等人,2009；formentini等人,2009；kornmann等人,1999；prokopchuk等人,2005)。在特定的實施方案中，輸注離體擴充的taa-ctl產(chǎn)生臨床益處并且提供針對胰腺癌的新治療性選項，其中所述taa-ctl已經(jīng)(i)在th1極性細胞因子存在下培養(yǎng)以逆轉(zhuǎn)失能，(ii)經(jīng)選擇而對多種taa特異，以最小化因表位喪失所致的逃逸，和(iii)使其抵抗體內(nèi)存在的抑制性可溶性因子。在第一方案中，可以進行以下操作：a)評估胰腺腫瘤的細胞因子譜，和b)記錄它們的taa表達模式?？梢越⒒颊哐逯衪h1和th2/抑制性細胞因子的模式以及從培養(yǎng)的原代腫瘤樣品中釋放的細胞因子的模式，使用例如ihc和rt-pcr確定活組織檢查樣品中的taa表達模式，并且產(chǎn)生編碼最頻繁表達的抗原的dna質(zhì)粒庫用于下文描述的ctl刺激方案。來自這個方案的數(shù)據(jù)允許設(shè)計用于過繼免疫療法的t細胞，其中可以使所述t細胞靶向腫瘤抗原并且變得抵抗腫瘤抑制作用。示例性方法如下。細胞因子分析.可以記錄例如30-50份入庫患者血清樣品的細胞因子譜，并且使用th1/th2細胞因子陣列，將這些血清樣品與從例如30位健康供體采集的血清比較，所述th1/th2細胞因子陣列檢測il1β、il2、il4、il5、il6、il7、il8、il10、il12、il13、ifnγ、gm-csf和tnfα；可以通過elisa測量tgfβ。也可以采集新鮮的活組織檢查樣品，在rpmi+5％hus中培養(yǎng)4-5日并且使用相同的細胞因子分析上清液。這允許評估完整范圍的在這些患者中循環(huán)和由腫瘤產(chǎn)生的抑制性和刺激性細胞因子。taa表達.可以通過ihc和rt-pcr對活組織檢查樣品篩查taa表達，包括先前聲稱與胰腺癌相關(guān)的那些taa(cea、muc1、muc2、muc5ac、muc6和端粒酶)(han等人,2009；li等人,2008)以及prame、magea、ssx2/4、ny-eso和存活素。產(chǎn)生dna質(zhì)粒庫.可以產(chǎn)生質(zhì)粒，所述質(zhì)粒編碼在篩查中最頻繁檢測到的7種抗原(舉例)。這些抗原可以克隆至p-max表達質(zhì)粒中處在cmv啟動子的控制下，所述cmv啟動子確保高水平的轉(zhuǎn)基因表達并且將隨gfp共表達以可能評估核轉(zhuǎn)染效率。發(fā)明人先前已經(jīng)驗證dna質(zhì)粒作為產(chǎn)生病毒(gerdemann等人,2009)和腫瘤特異性ctl的抗原的有效來源。在本發(fā)明的特定實施方案中，在患者血清中和來自培養(yǎng)的活組織檢查樣品的上清液中檢測th2/抑制性細胞因子il13和il4占優(yōu)勢，因為這兩種細胞因子均由胰細胞系過量產(chǎn)生并且由腫瘤用作自分泌生長因子。在特定的實施方案中，在患者活組織檢查樣品上檢測taa表達。公布的報道表明，大部分腫瘤是cea陽性的，大約60％表達muc-1，同時較低頻率地檢測到muc-6(<15％)，并且可以進一步表征taa表達的頻率和強度?？梢援a(chǎn)生表達最頻繁檢測到的taa的質(zhì)粒庫。表2：示例性組織樣品組織樣品數(shù)目血細胞232囊腫液22正常組織701胰液66血漿574血清559腫瘤組織780胰腺炎178總計3092這些描述的實施方案提供由胰腺腫瘤表達的taa和抑制性細胞因子的概況，從而允許設(shè)計靶向策略和保護策略。在第二方案中，可以產(chǎn)生對多種胰腺癌相關(guān)性靶抗原特異的腫瘤特異性ctl并體外評價它們的特異性和功能?？梢源_定是否可以從患有胰腺癌的受試者擴充針對胰腺癌taa的ctl。基于其他癌癥中取得成功，可以產(chǎn)生ctl，首先用單一抗原特異性和隨后采用多種抗原特異性，意圖在于使腫瘤抗原喪失變體介導(dǎo)的免疫逃避最小化。示例性方法如下：可以例如獲得，40-50ml將作為apc和應(yīng)答者t細胞的來源的患者血液。例如可以從20-25位患者產(chǎn)生ctl系。dc產(chǎn)生：通過在cellgenixdc培養(yǎng)基中在gm-csf和il-4存在下培養(yǎng)，從cd14選擇的單核細胞中分化出dc。將cd14陽性細胞冷凍用于后續(xù)刺激。使培養(yǎng)的dc再成熟24小時，例如使用如上文所述產(chǎn)生的編碼不同抗原的dna質(zhì)粒進行核轉(zhuǎn)染，隨后使其成熟另外24小時。通過使用流式細胞術(shù)測量成熟分子cd80、cd83、cd86、hla-dr和gfp的表達評估表型和核轉(zhuǎn)染效率。ctl刺激：為了活化抗原特異性t細胞，將核轉(zhuǎn)染的dc與cd14陽性pbmc以r:s比率10:1在ctl培養(yǎng)基(45％click's、45％高級rpmi、5％人血清和5mml-glutamax)中，在促進最佳ctl存活和擴充的優(yōu)化細胞因子混合物(il-7、il-12、il15和il6)(表1)存在下共培養(yǎng)。為了產(chǎn)生多種taa-ctl，可以用多種質(zhì)粒同時轉(zhuǎn)染dc。將擴充的細胞在第9日用核轉(zhuǎn)染的dc再刺激并且隨il7一起培養(yǎng)并且從第12日起每周二次給予il-2(50u/ml)。通過臺盼藍拒染法評估ctl擴充和生存力。在3次刺激后，可以使用包括cd4、cd8、cd56、cd16、cd45ra、cd45ro、cd25、cd28、cd27和cd62l的標(biāo)記分析細胞表型以確定ctl的活化和記憶(效應(yīng)子與中樞記憶)狀態(tài)?？梢允褂胑lispot或胞內(nèi)細胞因子染色法，測量應(yīng)答于刺激(或者肽或核轉(zhuǎn)染的dc)的th1(ifn-γ、tnfα、il2)和th2(il4、il5、il13、il10和tgfβ)細胞因子的產(chǎn)生。通過elispot評估表位寬度，例如，使用重疊肽匯集物來刺激經(jīng)cd4和cd8選擇的細胞并且確定在每種蛋白質(zhì)內(nèi)部識別出哪種cd4和cd8表位。使用表達taa的apc、hla匹配的胰細胞系以及自體腫瘤作為靶細胞，通過cr51釋放測定法評估溶細胞功能。在本發(fā)明的特定實施方案中，使用核轉(zhuǎn)染的dc作為apc，從患者pbmc容易地產(chǎn)生多克隆多種taa-ctl。在某些情況下，并非全部抗原在全部供體中均有免疫原性，雖然在特定情況下，可以一致地為每位受試者產(chǎn)生識別至少2種抗原的多種taa-ctl。基于在ctl系中的研究結(jié)果結(jié)合如上文所述鑒定的taa表達譜，可以鑒定用于未來免疫療法的最佳4-5個靶(例如)。擴充的細胞可以是多克隆的(cd4+和cd8+)，具有中樞記憶(cd62l+)和效應(yīng)子記憶(cd62l-)群體和終端分化的效應(yīng)子。在優(yōu)化的細胞因子混合物存在下，在具體實施方案中，ctl將具有th1細胞因子譜并且一旦刺激，將產(chǎn)生tnfα、ifnγ和il2，從而允許鑒定每種抗原的一組cd4+和cd8+t細胞表位。在本發(fā)明的一些實施方案中，擴充的細胞保留針對全部刺激抗原的特異性和活性，如通過例如流式細胞術(shù)、胞內(nèi)細胞因子染色法和溶細胞測定法測量。在其中可能使用核轉(zhuǎn)染的dc作為apc無法產(chǎn)生taa-ctl的情況下，可以將pepmixe用作抗原刺激。在其中可能用多種taa特異性無法產(chǎn)生同時活化擴充ctl的情況下，就病毒抗原而言，并非全部taa均同等地具有免疫原性并且可以見到抗原性競爭和在多個輪次刺激后針對較弱抗原的特異性喪失。然而，優(yōu)化的細胞因子組合使得在細胞系內(nèi)部維持多特異性成為可能。在可能存在taa-ctl體外增殖不良的情況下(雖然這是不太可能，因為發(fā)明人在16日的培養(yǎng)時間范圍內(nèi)在g-rex生物反應(yīng)器中一致實現(xiàn)20-40倍taa-ctl擴充；vera等人,2009)，但是如果這種擴充得不到維持，則可以將il15替換為增進增殖而特異性不喪失的il2(quintarelli等人,2007)。在反應(yīng)性t細胞的頻率低于ifnγelispot和胞內(nèi)染色測定法檢測限的情況下，雖然這不太可能，因為ellspot可以檢測少至1/100,000分泌細胞因子的細胞，但是可以分析已經(jīng)多次刺激過的(并且每次刺激例如重復(fù)7-10次)的ctl，因此將期望t細胞的頻率充分放大以允許檢測。如果不是如此，可以重新刺激。在本發(fā)明的實施方案中，開發(fā)了制造多克隆ctl的可重復(fù)技術(shù)，所述多克隆ctl針對癌(至少包括胰腺癌)中表達的多個腫瘤抗原內(nèi)的多個表位具有特異性。在第三方案中，可以通過強制性表達嵌合細胞因子受體，保護ctl免受th2細胞因子信號傳導(dǎo)的抑制作用。在具體的實施方案中，例如產(chǎn)生單一雙順反子構(gòu)建體，所述構(gòu)建體編碼與il2rγ和/或il7rα的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域連接的il13rα和/或il4rα的胞外結(jié)構(gòu)域。由胰腺癌使用的一種腫瘤免疫逃避策略例如是釋放th2抑制性細胞因子，如il13和il4，所述細胞因子i)增強癌細胞增殖和ii)減弱taa特異性th1-ctl并使其再極化成th2細胞。因此為了改善過繼轉(zhuǎn)移的多種taa-ctl的功效，可以使用嵌合細胞因子受體，使它們抵抗il13和il4的抑制作用，其中所述嵌合細胞因子受體連接結(jié)合這些th2細胞因子的受體的胞外結(jié)構(gòu)域至兩種刺激性(th1)細胞因子受體的信號傳導(dǎo)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。示例性方法如下：發(fā)明人已經(jīng)制備并測試了2種示例性有功能的逆轉(zhuǎn)錄病毒中間載體；構(gòu)建體#1編碼il-13rα1/il-2rγ-ires-gfp和構(gòu)建體#2編碼il-4rα/il-7rα-ires-morange(圖2)。包含相容性單一限制性酶位點(xhol-mlul)以允許將構(gòu)建體#1中的gfp容易替換成來自構(gòu)建體#2的il4rα/il7rα融合蛋白(圖2a)，目的在于產(chǎn)生編碼hil4受體和il13受體連同信號轉(zhuǎn)導(dǎo)il2和il7受體的胞外結(jié)構(gòu)域的單一雙順反子構(gòu)建體(#3)(圖3a)?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)手段驗證其功能。可以使用293t細胞的瞬時轉(zhuǎn)染制備逆轉(zhuǎn)錄病毒上清液并且ctl轉(zhuǎn)導(dǎo)可以遵循公布的方案進行(vera等人,2009；quintarelli等人,2007；vera等人,2006；savoldo等人,2007)?？梢酝ㄟ^facs分析il13rα和il4rα，評價重組蛋白的表達，并且在il2、il4或il13存在下通過磷酸化stat5分析，評價il2rγ胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域和il7rα胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的功能性?？梢噪S后產(chǎn)生pg-13穩(wěn)定生產(chǎn)細胞系，其以反式方式含有g(shù)ag和pol序列，從而允許穩(wěn)定產(chǎn)生病毒?？梢苑蛛x單一細胞克隆并檢測它們的功能滴度，并分離復(fù)制型載體。在本發(fā)明的特定實施方案中，存在il13rα1和il4rα的相等表達，如通過facs評價，并且il2rγ和il7rα胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域?qū)鬟f通過磷酸化stat5分析法可檢測的th1信號。例如存在大于20％的t細胞靶轉(zhuǎn)導(dǎo)，并且通過在il4或il13存在下培養(yǎng)隨時間推移選擇轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞(vera等人,2009；bollard等人,2007；savoldo等人,2007)。在一些情況下，在il13rα1胞外結(jié)構(gòu)域和ctl上微弱表達的野生型il4rα之間可能存在交叉配對，并且這可能導(dǎo)致低水平背景stat6信號傳導(dǎo)。然而，高比率的轉(zhuǎn)基因:野生型受體表達降低這種情況發(fā)生的概率。在某些方面，il4rα胞外結(jié)構(gòu)域與野生型il2rγ的交叉配對也可能發(fā)生，但是在這個情況下是可接受的，因為th1信號將被傳遞(圖3)。在本發(fā)明的一些實施方案中，產(chǎn)生一種雙順反子構(gòu)建體及穩(wěn)定生產(chǎn)系，這使得ctl支持th1活性信號成為可能，甚至當(dāng)暴露于正常情況下誘導(dǎo)th2轉(zhuǎn)換的il4或il13時也是如此。可以評估在il13和il4存在下培養(yǎng)的基因修飾的多種taa-ctl的離體轉(zhuǎn)導(dǎo)效率和功能。這種形式的體外比較允許確定每種融合蛋白是否多種taa-ctl中功能地表達、轉(zhuǎn)基因表達是否持久以及這類表達是否改變轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞的表型，或不利地影響它們的抗腫瘤活性。示例性方法如下：如上文所述生成多種taa-ctl，例如用例如構(gòu)建體#3轉(zhuǎn)導(dǎo)?？梢詼y量未轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞的擴充?？梢允褂靡呀?jīng)用構(gòu)建體#1或#2單一轉(zhuǎn)導(dǎo)的ctl作為對照。在il2、il4和il13存在下培養(yǎng)ctl。可以使用facs和臺盼藍拒染法測量細胞表型、數(shù)目和生存力的變化，并且使用多重途徑信號傳導(dǎo)試劑盒測量細胞信號傳導(dǎo)的變化。此外，在短期(4小時cr51，測定法)和長期(4日共培養(yǎng))研究中，使用表達自體taa的apc、hla匹配的胰細胞系和自體腫瘤細胞作為靶在il2、il13和il4的存在下比較抗腫瘤活性。在本發(fā)明的具體方面，檢測兩種融合蛋白的功能性水平，并且未轉(zhuǎn)導(dǎo)的ctl的培養(yǎng)物或用構(gòu)建體#1在伴有除il2之外的任何細胞因子情況下轉(zhuǎn)導(dǎo)的ctl的培養(yǎng)物對ctl功能、增殖和存活產(chǎn)生負向作用。在一個具體實施方案中，用構(gòu)建體#2轉(zhuǎn)導(dǎo)的ctl在il4的存在下增殖并且維持它們的功能，因為這種示例性嵌合構(gòu)建體可以與野生型il2rγ二聚化。最后，在本發(fā)明的特定實施方案中，用構(gòu)建體#3轉(zhuǎn)導(dǎo)的ctl在全部三種細胞因子存在下傳遞th1信號、增殖、存活和發(fā)揮功能(圖3)。表3中顯示示例性結(jié)果的匯總表。表3：示例性構(gòu)建體的預(yù)測結(jié)果+il2+il4+il13生長/功能生長/功能生長/功能未轉(zhuǎn)導(dǎo)+++--#1(il13rα/il2rγ)+++--#2(il4rα/il7rα)+++++-#3(融合)+++++++++++在本發(fā)明的實施方案中，開發(fā)靶向腫瘤的多特異性ctl療法用于癌癥，如胰腺癌，并且使這些細胞抵抗由腫瘤采用的重要免疫逃避策略?？梢栽谂R床研究中產(chǎn)生和融合基因修飾的多種taa-ctl以在患有胰腺癌的個體中評價它們的安全性和抗腫瘤功效。實施例2作為實例用il4rα/il7rα對car修飾的t細胞進行基因修飾腫瘤已經(jīng)演變出復(fù)雜機制以破壞細胞免疫反應(yīng)，包括表達在效應(yīng)子t細胞中誘導(dǎo)失能或凋亡的fasl或pd-l1。微環(huán)境中包括招募調(diào)節(jié)性t細胞和分泌抑制t細胞增殖的tgf-β和其他免疫阻抑性細胞因子。存在腫瘤和調(diào)節(jié)性樹突細胞的吲哚胺2,3-雙加氧酶(ido)組成型表達，這耗盡色氨酸，導(dǎo)致t細胞失能和mhc和共刺激分子的下調(diào)或調(diào)節(jié)。t細胞可以受腫瘤微環(huán)境存在的多種因子(包括至少il10、tgf-β、il13和il-4)抑制。如果細胞因子受體胞外結(jié)構(gòu)域與非天然胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域一起用來武裝t細胞以抵抗抑制性腫瘤微環(huán)境，則可以克服這個問題。在本發(fā)明的實施方案中，通過強制性表達人工il4/il7細胞因子受體保護多種taa-ctl免受th2細胞因子的抑制作用?？梢援a(chǎn)生示例性轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體，如圖4中的那一種，其顯示為il4rα/il7rα的融合物并且包含報道基因，如morange，不過在一些情況下，構(gòu)建體缺少報道基因。圖5顯示轉(zhuǎn)基因受體的穩(wěn)定表達，如通過檢測轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞上il4r表達和morange共表達的流式細胞術(shù)所檢測。圖6顯示轉(zhuǎn)基因受體是有功能的，如通過檢測當(dāng)暴露于il4細胞因子時轉(zhuǎn)基因細胞中的磷酸化stat5(pstat5)所評估，所述il4在野生型條件下將誘導(dǎo)pstat6。圖7表明嵌合4/7r的轉(zhuǎn)基因表達并未不利地影響ctl功能，如使用檢測靶細胞特異性裂解的鉻釋放測定法評估，并且圖8顯示表達4/7r的轉(zhuǎn)基因t細胞在il2(用來誘導(dǎo)t細胞增殖的標(biāo)準(zhǔn)生長因子)或il-4存在下體外增殖，同時從相同供體產(chǎn)生但是不表達4/7r的ctl僅能夠在生長因子il2存在下增殖。圖9顯示表達4/7r的ctl可以耗盡來自從腫瘤細胞系收集的上清液中的il4，這表明轉(zhuǎn)基因受體實際上可以利用腫瘤產(chǎn)生的細胞因子并且可以潛在地使腫瘤缺少以前的生長因子。圖10顯示表達4/7r的ctl抵抗其他免疫阻抑性細胞因子，如通過暴露于所示細胞因子條件后細胞計數(shù)所評估；維持ctl特異性和功能，如通過elispot評估。顯示將免疫阻抑性細胞因子的信號傳導(dǎo)改變成t細胞生長因子(圖11)。圖12-14顯示4/7rctl在異體移植物小鼠模型中控制腫瘤生長其中scid小鼠植入產(chǎn)生il4的腫瘤，所述腫瘤共表達ffluc以允許體內(nèi)成像。隨后，動物用未轉(zhuǎn)導(dǎo)的或4/7r修飾的ctl治療。用4/7rctl治療的動物具有比對照組顯著更小的腫瘤，這導(dǎo)致總生存期的增加。圖15顯示在某些實施方案中，可以調(diào)節(jié)患者衍生的car-psca修飾的t細胞以例如共表達4/7r。圖16顯示經(jīng)修飾以共表達4/7r的car-pscat細胞保留它們殺傷腫瘤靶的能力。這個實施例顯示t細胞可以經(jīng)修飾以共表達不同的轉(zhuǎn)基因。通過用靶向示例性腫瘤抗原psca的嵌合抗原受體進行基因修飾向t細胞賦予抗原特異性。隨后，修飾相同細胞以共表達4/7r。采用4/7r修飾并未不利地影響t細胞識別腫瘤細胞的能力。參考文獻altersse,gadeajr,philipr.immunotherapyofcancer.generationofceaspecificctlusingceapeptidepulseddendriticcells.adv.exp.med.biol.1997；417:519-524.bollardcm,aguilarl,straathofkc等人,cytotoxictlymphocytetherapyforepstein-barrvirus+hodgkin'sdisease.j.exp.med.2004；200:1623-1633.bollardcm,gottschalks,leenam等人,completeresponsesofrelapsedlymphomafollowinggeneticmodificationoftumor-antigenpresentingcellsandt-iymphocytetransfer.blood2007；110:2838-2845.cappellop,tomainob,chiarler等人,anintegratedhumoralandcellularresponseiselicitedinpancreaticcancerbyalpha-enolase,anovelpancreaticductaladenocarcinoma-associatedantigen.intjcancer2009；125:639-648.formentinia,prokopchuk0,straterj等人,interleukin-13exertsautocrinegrowth-promotingeffectsonhumanpancreaticcancer,an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