本發(fā)明屬于分子生物學(xué)和生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一個(gè)燕麥基因oppdi(aoatphotoperiodinsensitivegene)的克隆及其功能驗(yàn)證，具體涉及的燕麥oppdi基因克隆、生物信息學(xué)分析及轉(zhuǎn)基因擬南芥在光周期方面的分析與功能驗(yàn)證。

背景技術(shù)：

燕麥(avenasatival.)是禾本科(granmineae)燕麥屬(avena)一年生植物，廣泛分布于世界各地42個(gè)國(guó)家。一般分為皮燕麥和裸燕麥兩種，我國(guó)主要種植裸燕麥，主要用作糧食食用，莖和葉作為牲畜飼料，所以裸燕麥?zhǔn)俏覈?guó)重要的糧草兼用型作物，具有極高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和較強(qiáng)的抗逆性，適用性較強(qiáng)，耐嚴(yán)寒、干旱、瘠薄及適度鹽堿，種植風(fēng)險(xiǎn)小。燕麥?zhǔn)堑湫偷拈L(zhǎng)日照作物，必須經(jīng)過長(zhǎng)日照階段才能正常開花結(jié)實(shí)，但是在短日照條件下會(huì)延遲抽穗甚至無(wú)法抽穗開花，這一特性不僅使其在地理分布和播種時(shí)間上受到限制，甚至導(dǎo)致產(chǎn)量下降^[1-2]。如需在原有遺傳資源基礎(chǔ)上培育新品種，必須通過傳統(tǒng)育種手段引入新的遺傳資源，然而由于各地的光照、溫度、地理環(huán)境和氣候條件差異很大，所以引種工作受到很大的限制^[3]，因此深入研究燕麥光周期的分子作用機(jī)制，利用分子育種有針對(duì)性的調(diào)節(jié)燕麥光周期反應(yīng)，使其成為光周期遲鈍型，提高適應(yīng)性，可能有效地?cái)U(kuò)大引種和種植范圍。

許多光周期誘導(dǎo)開花的基因已被報(bào)道，prr(pseudo-responseregulator)是其中一類調(diào)控光周期的蛋白家族，進(jìn)化保守，它們蛋白質(zhì)的c端都包含一個(gè)cct區(qū)域，含有cct區(qū)域的基因在dna水平上非常保守，都在植物感受日照長(zhǎng)度的開花調(diào)控中起著非常重要的作用。cct區(qū)域也是開花調(diào)控關(guān)鍵因子co(constans)家族蛋白的保守區(qū)^[4]。小麥的光周期反應(yīng)主要受到小麥2d、2b和2a染色體短臂上的photoperiod1(ppd)位點(diǎn)，分別稱ppd-d1、ppd-b1和ppd-a1^[5-6]。小麥ppd1基因上游片段缺失會(huì)降低光周期的敏感性^[7]。光鈍基因ppd-d1a在編碼序列上游區(qū)域缺失2089bp核苷酸，改變了基因的表達(dá)模式及下游基因co(constans)和ft(floweringlocust)的表達(dá)，在小麥表型上呈現(xiàn)出，無(wú)論在長(zhǎng)日或短日照條件下均提前開花^[8-9]。光周期基因ppd-dla已經(jīng)被應(yīng)用于小麥育種，使得小麥獲得更廣泛的適應(yīng)性^[10]。ppd-b1也對(duì)小麥抽穗有影響，在ppd-dla遺傳背景下，ppd-b1a比ppd-b1b小麥的抽穗期提前6.7day^[11-12]。ppd-b1位點(diǎn)拷貝數(shù)的多樣性也會(huì)對(duì)小麥開花性狀產(chǎn)生影響，導(dǎo)致小麥出現(xiàn)早花性狀^[13]。不僅ppd基因?qū)π←湽庵芷诜磻?yīng)會(huì)產(chǎn)生影響，在普通小麥中與ppd-1同源的基因taprr73，該基因在轉(zhuǎn)基因水稻中高水平表達(dá)時(shí)促進(jìn)水稻在長(zhǎng)日照條件下早開花^[14]。

利用比較遺傳學(xué)和圖位克隆法在二倍體大麥中獲得兩個(gè)控制光周期反應(yīng)的重要位點(diǎn)。第一個(gè)是位于2h染色體短臂上的ppd-h1，與擬南芥生物鐘pseudo-responseregulator基因同源^[15]。ppd-h1基因普遍存在于冬大麥中，在長(zhǎng)日照條件下通過上調(diào)hvft1基因(與擬南芥中的ft基因同源)的表達(dá)量促進(jìn)早開花^[15,16]，但是ppd-h1基因在保守的cct區(qū)域發(fā)生突變后，在長(zhǎng)日照條件下開花延遲，這種表型變化在春季小麥的種植區(qū)域中表現(xiàn)的尤為顯著^[15,17-19]。第二個(gè)位點(diǎn)是位于1h染色體長(zhǎng)臂的ppd-h2，它控制短日照下開花，光敏感等位基因在短日照下延遲開花^[20]。

燕麥光周期不敏感基因的研究從1972年sampson和burrows發(fā)現(xiàn)了燕麥光周期不敏感品種就已經(jīng)開始了^[21]。burrows^[22]在加拿大光照不敏感品種中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)單顯性光照不敏感基因dil。wight^[23]找到了與單顯性dil基因相關(guān)的rapd分子標(biāo)記，但是沒有成功克隆該基因。由于六倍體燕麥基因圖譜繪制困難，在圖譜中定位這些qtl位置非常復(fù)雜。通過分子標(biāo)記技術(shù)，已經(jīng)在第3,6,7,8,11,12,17和24連鎖群上定位到一些與開花時(shí)間相關(guān)的qtl^[24-26]。胡斯攀等^[27]采用aflp標(biāo)記對(duì)22份燕麥材料進(jìn)行了dna指紋分析及光周期不敏感基因的分子標(biāo)記研究，統(tǒng)計(jì)分析aflp圖譜獲得光周期不敏感燕麥品種特異條帶2條，可作為燕麥光周期不敏感基因的相關(guān)分子標(biāo)記。在以親本光照敏感品種白燕1號(hào)與光照不敏感品種voa-8及雜交得到的f2代群體對(duì)306對(duì)ssr引物進(jìn)行了篩選，9對(duì)引物在親本和群體群體間存在多態(tài)性，可用于群體篩選，為進(jìn)一步構(gòu)建燕麥ssr遺傳連鎖圖譜和進(jìn)行光照不敏感基因qtl定位提供了幫助^[28]。2016年elizavetagrigoreva^[29]從燕麥品種“chihuahua”דanatolisher”的重組自交系(ril)中,發(fā)現(xiàn)了影響光周期反應(yīng)的ppd位點(diǎn)。雖然prr家族的基因在植物感受日照長(zhǎng)度的開花調(diào)控中起著非常重要的作用，但是還沒有報(bào)道成功克隆燕麥光周期相關(guān)基因，因此本研究通過cdna-aflp技術(shù)篩選得到了一個(gè)燕麥光不敏感基因oppdi。采用熒光定量pcr進(jìn)行基因表達(dá)量分析。該基因在長(zhǎng)日照條件下，在燕麥光照不敏感品種voa-8和光照敏感品種白燕1號(hào)的基因表達(dá)量差異不大，但是在短日照條件下，相比于白燕1號(hào)，該基因在品種voa-8中的表達(dá)量明顯升高。采用race方法克隆到了oppdi基因的3’末端和5’末端，并完成了基因拼接與生物信息學(xué)分析，并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化擬南芥進(jìn)而驗(yàn)證其生物學(xué)功能。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明對(duì)不同來源的11個(gè)燕麥品種進(jìn)行長(zhǎng)短日照光周期模擬實(shí)驗(yàn)，篩選獲得燕麥光照不敏感品種voa-8，因此voa-8的基因組中可能攜帶光不敏感基因。將voa-8和白燕1號(hào)燕麥品種種植在長(zhǎng)、短日照條件下，利用cdna-aflp技術(shù)對(duì)燕麥光周期相關(guān)基因表達(dá)差異進(jìn)行研究分析，篩選獲得了1個(gè)與光周期相關(guān)的基因。采用race方法克隆獲得了1個(gè)光周期相關(guān)的基因cdna全長(zhǎng)序列，名稱為oppdi，其核苷酸序列如seqidno：1所示。。該基因由2749個(gè)堿基組成，完整的開放閱讀框含有1983bp，同時(shí)還含有5’非翻譯區(qū)和3’非翻譯區(qū)序列，開放閱讀框的起始密碼子為atg，終止密碼子為taa。oppdi編碼660個(gè)氨基酸，其氨基酸序列如seqidno：2所示。利用rt-pcr技術(shù)檢測(cè)該基因在不同光照處理?xiàng)l件下在白燕1號(hào)和voa-8品種的表達(dá)量情況。對(duì)oppdi基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，表明這個(gè)基因的蛋白屬于prr基因家族。對(duì)oppdi基因進(jìn)行載體構(gòu)建，一種重組載體以及重組載體轉(zhuǎn)化得到的重組基因工程菌，含有燕麥光照不敏感基因oppdi的核苷酸序列。含有重組載體的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化擬南芥進(jìn)行功能鑒定，表明燕麥光周期相關(guān)基因oppdi與小麥和大麥、高粱的光周期基因ppd-h1,ppd-d1和sbprr37，以及與玉米zmcct具有類似的功能和作用，降低了擬南芥對(duì)光周期的敏感性，促使開花時(shí)間提前，出現(xiàn)了明顯早花現(xiàn)象。

本發(fā)明首次在燕麥品種voa-8中利用race方法克隆了一個(gè)光照不敏感基因oppdi的全長(zhǎng)cdna序列和蛋白序列，并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化擬南芥進(jìn)而驗(yàn)證其生物學(xué)功能。所述的燕麥光照不敏感基因oppdi應(yīng)用在燕麥育種中，不僅能夠深入研究燕麥的光周期反應(yīng)的分子機(jī)理，弱化燕麥的光周期敏感性，不但有利于燕麥品種的創(chuàng)新，而且有利于提高燕麥品種對(duì)不同地理緯度和播種季節(jié)的適應(yīng)性，使燕麥由原來的一年一熟變?yōu)橐荒觌p熟，這將對(duì)燕麥產(chǎn)量提高具有重要的經(jīng)濟(jì)與社會(huì)效益。

附圖說明

圖1.燕麥光照不敏感品種voa-8和敏感品種白燕1號(hào)中在長(zhǎng)日照和短日照條件下oppdi基因的表達(dá)分析

圖2.燕麥oppdi基因開放閱讀框(orf)分析

圖3.燕麥基因oppdi與不同植物中同源的prr氨基酸序列的同源性分析

圖4.oppdi與其他植物prr氨基酸多重序列比對(duì)

圖5.燕麥oppdi蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

圖6.oppdi蛋白的保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)

圖7.oppdi蛋白疏水性預(yù)測(cè)

圖8.為燕麥oppdi開放閱讀框重組質(zhì)粒pcr擴(kuò)增凝膠電泳圖

m：dl2000dnamarker；m：2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp；1，2：擴(kuò)增片段

圖9.野生型擬南芥和t3代轉(zhuǎn)基因擬南芥長(zhǎng)日照功能鑒定

圖10.野生型擬南芥短日照功能鑒定

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合具體實(shí)例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。

實(shí)例一：燕麥oppdi基因的克隆

1.rna的提取

利用rnaisoreagent(takara,japan)提取燕麥品種voa-8葉片的總rna。

(1)取在光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行短日照處理(10hlight/14hdark)的燕麥光照不敏感品種voa-8的第七葉幼嫩葉片作為實(shí)驗(yàn)材料，分別取3株混合放入1.5ml離心管中，每管約40mg，迅速放入液氮中。

(2)研磨后迅速每管加入1mlrnaisoreagent(takara)，振蕩混勻，使粉末均勻散布在試劑中，室溫靜止10min。

(3)12,000×g，4℃，離心15min。

(4)吸取上清液，加入200μl氯仿，劇烈震蕩，室溫靜止5min。

(5)12,000×g，4℃，離心10min。

(6)上清液轉(zhuǎn)入另一新的1.5ml離心管中，加入等體積預(yù)冷的異丙醇。-20℃醇沉1h。

(7)12,000×g，4℃，離心15min。

(8)倒掉上清，沉淀加入1ml75％無(wú)水乙醇沖洗。12,000×g，4℃，離心5min。

(9)再次加入75％無(wú)水乙醇沖洗。12,000×g，4℃，離心5min。

(10)放入超凈工作臺(tái)，吹干(大約10min，不能太干，否則不易溶解)。

(11)加入20μldepc處理水溶解。待完全溶解，-80℃保存。

(12)取1μl總rna，稀釋100倍，分光光度計(jì)測(cè)od值。a260/a280值在1.6-1.8。取2μlrna1％瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，eb染色。

2.cdna第一鏈的合成

第一鏈cdna合成混合液包含：

microtube管中配制下列模板rna/引物混合液，體系10μl。

70℃保溫10min后，迅速在冰上急冷2min以上。離心數(shù)秒鐘使模板rna/引物的變性溶液聚集于microtube管底部。

在上述microtube管中配制下列反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液。

42℃1h，70℃15min，冰上急冷，-20℃保存。取5μlcdna第一鏈產(chǎn)物1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

3.燕麥oppdi基因3'端的擴(kuò)增

上游引物設(shè)計(jì)利用cdna-aflp分析得到的一段轉(zhuǎn)錄衍生片段序列(transcript-derivedfragment,tdfs)進(jìn)行設(shè)計(jì)特異引物sp。下游引物根據(jù)真核生物mrna3'末端具有ploya尾結(jié)構(gòu)的特性，設(shè)計(jì)了錨定反轉(zhuǎn)錄引物3'p1和pcr下游引物3'p2。

第一輪pcr：用實(shí)例一得到的rna反轉(zhuǎn)錄成cdna，引物3'p1進(jìn)行cdna第一鏈的合成。pcr反應(yīng)程序：70℃保溫10min后，迅速在冰上急冷2min以上；第二輪模板為第一輪的pcr產(chǎn)物，引物為spprimer和3'p2primer。pcr反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性3min，94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min，35個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min，4℃保存。

sp：5'-aagggaagcagttggaaataggc-3'

3'p1：5'-tgcgtggaggacattgtggtagtgtttttttttttttttttt-3'

3'p2：5'-tgcgtggaggacattgtggtagtg-3'

第二輪pcr反應(yīng)結(jié)束后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，回收，測(cè)序，分析3'端測(cè)序結(jié)果。

4.燕麥oppdi基因5’端的擴(kuò)增

由cdna-aflp獲得的片段，設(shè)計(jì)巢式pcr引物(ap1和ap2)和通用引物5'p。第一輪pcr：用實(shí)例一得到的rna反轉(zhuǎn)錄成cdna，引物5'p1進(jìn)行cdna第一鏈的合成。pcr反應(yīng)程序：70℃保溫10min后，迅速在冰上急冷2min以上；cdna第一鏈合成后采用rnasea降解單鏈rna，30℃1h，37℃1h；采用超薄dna產(chǎn)物純化試劑盒純化cdna第一鏈；對(duì)cdna第一鏈3'末端加polyg，37℃30min；采用超薄dna產(chǎn)物純化試劑盒純化已經(jīng)加polyg的cdna第一鏈；

以已加尾的cdna第一鏈為模板，進(jìn)行pcr擴(kuò)增，引物為5'pprimer和ap2primer。pcr反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性3min，94℃變性30s，58℃退火1min，72℃延伸2min，35個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min，4℃保存。

5'p5'-ttaaattaatccccccccccccccc-3'

ap15'-cccatgtcgttgttgttgctactgccg-3'

ap25'-gaaccctgctccgccttgattgg-3'

pcr反應(yīng)結(jié)束后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，回收，測(cè)序，分析5'端測(cè)序結(jié)果。

5.燕麥oppdi基因拼接

以得到oppdi3'端和5'端的序列，利用dnaman軟件對(duì)5'端和3'端的序列進(jìn)行拼接，成功獲得oppdi基因全長(zhǎng)的cdna,。根據(jù)拼接結(jié)果，設(shè)計(jì)基因cds特異性引物(oppdif/oppdir)，以反轉(zhuǎn)錄的cdna為模板，成功獲得預(yù)期大小的cdna全長(zhǎng)。pcr反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性3min，94℃變性30s，58℃退火1min，72℃延伸2min，35個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min，4℃保存。

oppdif:5'-cccgcaccactcctcctc-3'

oppdir:5'-atcaaggaacgccacgatataa-3'

反應(yīng)結(jié)束后，進(jìn)行電泳，產(chǎn)物回收，測(cè)序，從而獲得cdna全長(zhǎng)，其核苷酸序列如2(1d),氨基酸序列為2(2b)。

實(shí)例二：燕麥oppdi基因的生物信息學(xué)分析

利用ncbi的orffinder，對(duì)測(cè)序的序列進(jìn)行orf分析。燕麥oppdi基因包含1983bp完整的開放閱讀框，同時(shí)含有274bp的5'非翻譯區(qū)(5'utr)和492bp的3'非翻譯區(qū)(3'utr)。用dnaman軟件進(jìn)行分析，推測(cè)編碼660個(gè)氨基酸。

利用ncbi的conserveddomains預(yù)測(cè)基因保守區(qū)發(fā)現(xiàn)，oppdi基因包含類蛋白接收信號(hào)(rec)超家族的保守區(qū)(26-140)，接受調(diào)節(jié)反應(yīng)(response_reg)保守區(qū)(28-141)和cct超家族保守區(qū)(608-652)。

利用expasy-protparam工具進(jìn)行分析，oppdi蛋白推測(cè)的分子量為70806.5da，等電點(diǎn)為8.97。將這660個(gè)氨基酸分為20類，其中有71個(gè)是帶正電荷的酸性氨基酸(asp+glu)，85個(gè)是帶負(fù)電荷的酸性氨基酸(arg+lys)(表1)。

表1oppdi蛋白的各個(gè)氨基酸的數(shù)量和百分比

利用ncbi數(shù)據(jù)庫(kù)的blast功能，對(duì)這個(gè)oppdi基因進(jìn)行同源性分析。表明oppdi氨基酸序列與小麥、大麥、山羊草、短柄草、高粱和水稻的prr蛋白(pseudo-responseregulator)的氨基酸具有很高同源性，e值(expectvalue)為0.0，一致性達(dá)到72％-76％，因此該基因?qū)儆趐rr蛋白(pseudo-responseregulator)家族成員之一。

ncbi數(shù)據(jù)庫(kù)搜索出不同植物中同源的prr氨基酸序列，其中包括：大麥(aay42109.1)、小麥(bal63696.1)、山羊草(abl09481.1)、短柄草(xp003562393.1)、高粱(aeg90655.1)和水稻(bad38855.1)。通過系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，此基因與大麥、小麥、山羊草和短柄草中的同源基因親緣關(guān)系比很近，與高粱、水稻親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

實(shí)例三：燕麥oppdi基因?qū)庵芷诘姆磻?yīng)

提取長(zhǎng)日照(14hlight/10hdark)條件下處理的白燕1號(hào)和voa-8，短日照(10hlight/14hdark)條件下處理的白燕1號(hào)和voa-8第7片葉片的總rna。利用abi7500realtimepcrsystem(appliedbiosystems)和7500systemsoftwareversion1.3.1進(jìn)行real-timert-pcr分析。rna提取與cdna第一鏈的合成同實(shí)例一。按照試劑盒sybrgreenrealmastermixwithrox說明進(jìn)行real-timepcr。real-timert-pcr反應(yīng)體系為：95℃30s預(yù)變性，95℃5s，51℃30s，68℃30s，40個(gè)循環(huán)。所用引物如下：

gapdh-f5'-tgtccatgccatgactgcaa-3'

gapdh-r5'-ccagtgctgcttggaatgatg-3

18srrna-f5'-gtgacgggtgacggagaatt-3

18srrna-r5'-gacactaatgcgcccggtat-3

oppdi-f5'-accgtgacgacactatgc-3'

oppdi-r5'-ctgctccgccttgatt-3'

qrt-pcr的結(jié)果顯示日照長(zhǎng)度誘導(dǎo)該基因的表達(dá)，與長(zhǎng)日照(14hlight/10hdark)條件相比，在短日照(10hlight/14hdark)條件下該基因在voa-8品種中的表達(dá)量顯著提高。

實(shí)例四：過表達(dá)載體的構(gòu)建

(1)用高保真酶擴(kuò)增出oppdi基因的cds序列。引物設(shè)計(jì)時(shí)加入相應(yīng)酶切位點(diǎn)。

(2)把高保真擴(kuò)增的pcr產(chǎn)物回收、加a、連接pgm-t載體、轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)dh5α、pcr酶切鑒定、測(cè)序等一系列步驟，確定基因的正確性，有完整的開放閱讀框、無(wú)錯(cuò)配、無(wú)移碼。

(3)把測(cè)序正確的基因利用其設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)酶切，回收小片段(基因)。

(4)把表達(dá)載體pcambia3301以相同酶切位點(diǎn)酶切，回收大片段(載體)。

(5)把回收的載體大片段與基因小片段連接。

(6)轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)dh5α，提取質(zhì)粒進(jìn)行pcr和酶切鑒定。

(7)將連有目的基因oppdi基因的pcambia3301表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài)eha105，提取質(zhì)粒進(jìn)行pcr鑒定，完成oppdi基因的克隆與載體的構(gòu)建。

實(shí)例五：轉(zhuǎn)oppdi基因擬南芥的獲得及分子檢測(cè)

利用蘸花法對(duì)基因進(jìn)行擬南芥轉(zhuǎn)化，具體如下：

(1)將未開花的擬南芥倒置使花蕾朝下，侵入含有oppdi基因農(nóng)桿菌菌液的重懸液中2min。

(2)將轉(zhuǎn)化后的擬南芥植株平放，蓋好保鮮膜，黑暗條件下生長(zhǎng)24h后置于正常光照條件下培養(yǎng)生長(zhǎng)，一周后同上再侵染一次。

(3)轉(zhuǎn)化后植株可正常地開花生長(zhǎng)，待角果完全枯黃、欲開裂時(shí)，即可收獲種子。

(4)收獲的部分t0代種子經(jīng)basta篩選，pcr鑒定，獲得t1代轉(zhuǎn)基因植株，經(jīng)過兩次加代，獲得t3代純和擬南芥植株，用于后續(xù)的表型鑒定。

實(shí)例六：t3代轉(zhuǎn)oppdi基因擬南芥的光周期反應(yīng)鑒定

為了驗(yàn)證oppdi基因的生物學(xué)功能，將野生型與轉(zhuǎn)oppdi基因的擬南芥種子播種在營(yíng)養(yǎng)土上。然后將野生型和t3代轉(zhuǎn)基因擬南芥分別置于光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行長(zhǎng)日照(14hlight/10hdark)和短日照(10hlight/14hdark)處理，21℃，記錄開花時(shí)間。結(jié)果表明在長(zhǎng)日照處理下，野生型和t3代轉(zhuǎn)基因擬南芥開花時(shí)間沒有明顯差別，植株經(jīng)過34day-35day都開花了，轉(zhuǎn)基因擬南芥比野生型延遲1day。但是在短日照條件下，與野生型擬南芥相比，t3代轉(zhuǎn)基因擬南芥在65day-70day后開花了，開花時(shí)間要快于野生型植株，野生型植株還未抽薹(表2)。由此說明，oppdi基因降低了擬南芥對(duì)光照的敏感性，促使開花時(shí)間提前，出現(xiàn)了明顯早花現(xiàn)象，可推斷oppdi基因可能與燕麥的光照不敏感性有關(guān)。如將該基因?qū)胙帑溒贩N中，對(duì)選育燕麥光照不敏感品種、利用分子標(biāo)記輔助手段創(chuàng)造材料，提高燕麥的適應(yīng)性以及有效擴(kuò)大燕麥的種植范圍都具有重要的經(jīng)濟(jì)效益和實(shí)踐意義。

表2.野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥株系line1、line2和line3中在不同光照處理下的開花時(shí)間的差異

seqidno.1的序列

(i)序列特征：(a)長(zhǎng)度：2749bp；(b)類型：核苷酸；(c)鏈性：?jiǎn)捂湥?d)1-274::5’-utr

(e)2258-2749：3’-utr。

(ii)分子類型：核苷酸

(iii)序列描述：seqidno.1

(i)序列特征：(a)長(zhǎng)度：660個(gè)氨基酸；(b)類型：氨基酸；(c)鏈性：?jiǎn)捂湣?/p>

(ii)分子類型：多肽

(iii)序列描述：seqidno.2

　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　序列表

seqidno.1的序列

（i）序列特征：（a）長(zhǎng)度：2749bp；（b）類型：核苷酸；（c）鏈性：?jiǎn)捂?；（d）1-274::5’-utr（e）2258-2749：3’-utr。

　　?。╥i）分子類型：核苷酸

　　?。╥ii）序列描述：seqidno.1

1cccgcaccactcctcctcctcagacatcagcggcctcctctccctccggtccggtgtcgc

61gccatgccgccgccttcctcctcccgctgaaaccaagcgatacagatactgctgctgcta

121tactagcgctctcctttttgttcccaatctgttcggtttgctgtgcacgacgcggagttc

181ggccgatttcgtggcctgctatgtgcgcgcctccctcctctcctccagaaaatctcgtcg

241gcagcccccacctcccgcacagccacaccacctgatggagcagccgcagccgccgccgcc

301cgcgcaggcccagccgctctgctgggagcagttcctgcacaagaagaccatcagggtcct

361gctcgtggagaccgatgactccaccaggcagatcgtcaccgccctgcttcgacactgcat

421gtaccaagttatccctgccgagaatggccagcaagcatgggcttgcctccaaagcgcgca

481gagcaacatcgacatcgtcctcaccgagatcgtgccttgcgcatctgggaattctctgct

541cgacaagatcatgacccacagcgtctgcaaggacatcccagtcatcatgatgtcttccaa

601cgactccatgagcacggtcttcgaatgcctgtcaaagggtgccgccgacttcttagtcaa

661gcccatacgtaagaacgagctcaagaacctttggcagcatgtgtggagacggtgccacag

721ctccagtggcagtggaagtggaggtggaagtgaaatccagacgcagaagtgtaccaaatc

781aaagagtggggatgaatccaataacaacagtggcagcaatgatcgcaacggtgatacgag

841catggggcttaacgcaagggatggcagcgataatggcagtggcactcaagcgcagagctc

901ttggacgaagcgtgctgtggaaatcgacagcccacaggctatgtctccaaatcagtcaaa

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1021tgggcggttacaaggtacagacaacaaaaaatgcaagaacaaagaaactaatgacgaatt

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1141tccaaacgggagttccgtcaaaccaacagatacacggtgtgagtatccgccacagaacaa

1201ctccgagggtaaaattgtggaaaatttggaggatcgaatggttcgagctgctgacctcat

1261tggttcaatggcgaaaaacatggacgctcaacaggcggcaagagccaaagctgctcctaa

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1621aggctcaaacggcagtagcaacaacaacgacatgggttctactacgatgaacatggcgac

1681aaagcctgtttgcaacaaggtttcccctattaacggaagaacgcacacatcggcgttcca

1741tcgcgtgcagcagtggacaccagcagcagcagccggtaaagacaaggccgatgaagtggg

1801caagaagaatgccgcagcagcagcagcaggagggaacgacaaggctggcgaagcagagag

1861caaacgtccctgtggggtccatgatgggaatggtggatctgcaggggtccctcagtccaa

1921tgttagtgatccttcggctccggtcgaaggtcatgcggccaactacggtagcaactcggg

1981cagtaacaacaatactaacaacgggagcaccgctgctactgctgctgctgcaaatgtgga

2041gaccggtggcatcgacaagagaagtggacacgccatgtatttgaaacgggagcgtcgagt

2101ggccgccgtgaacaagttcagagagaagaggaaagagcggaacttcgggaagaaggtgag

2161gtaccagagcaggaagcggctggcggagcagcgcccacgggtgcgcgggcagtttgtgaa

2221gcagccgcccccgccgccggcggtggtggagagataacctcccgccacacacctagcccc

2281tctcctagcttgagctccgactccaccttcgcctctagcaagattgctttggactccaaa

2341cagttgacaattagacggtgatgattcttccttggtttgtgtgatccgatacgtttcatc

2401attgatttcttcatatctaggatctactacctaaattaaccaggaaagaataaacgagga

2461actcctatatatatatatataacatacatgcatgtatgcattccaaagcatgtagaagaa

2521tgtgtgtcttgactctagatgggctgtaatcctaggtggagtcatgctcggtcctactag

2581taactaaactactattgtgtgctgtcatgtatggttggatcaactgtcagtagaattgaa

2641ctgaacagcatttgtgttagcttacggcggagttgctgctagtgccgtgtgtcagtttca

2701gtcaatatattatatcgtggcgttccttgataaaaaaaaaaaaaaaaaa

seqidno.2的序列

　　?。╥）序列特征：（a）長(zhǎng)度：660個(gè)氨基酸；(b)類型：氨基酸；（c）鏈性：?jiǎn)捂湣?/p>

　　?。╥i）分子類型：多肽

　　?。╥ii）序列描述：seqidno.2

1meqpqppppaqaqplcweqflhkktirvllvetddstrqivtallrhcmyqvipaengqq

61awaclqsaqsnidivlteivpcasgnslldkimthsvckdipvimmssndsmstvfecls

121kgaadflvkpirknelknlwqhvwrrchsssgsgsgggseiqtqkctksksgdesnnnsg

181sndrngdtsmglnardgsdngsgtqaqsswtkraveidspqamspnqsndppdstcahvi

241ypksgicsngrlqgtdnkkcknketndefkgkqleigapsnlntkdqsspngssvkptdt

301rceyppqnnsegkivenledrmvraadligsmaknmdaqqaarakaapncsskvpegket

361drddtmpslelslkrtrstgdgenaiqeeqrnvfrrsdlsaftryntcmvsnqggagfmg

421scspdgnsseaakadynmksgsdaalmkqgsngssnnndmgsttmnmatkpvcnkvspin

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541gsagvpqsnvsdpsapveghaanygsnsgsnnntnngstaataaaanvetggidkrsgha

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