本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)或生物制藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種針對于Her2的納米抗體。

背景技術(shù)：

人表皮生長因子受體-2(Her2)是迄今為止乳腺癌中研究較為透徹的基因之一，于20世紀80年代分別由三個研究小組獨立發(fā)現(xiàn)。Her2基因的過表達不僅與腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)外，還是一個重要的臨床治療監(jiān)測及預(yù)后指標，并且是腫瘤靶向治療藥物選擇的一個重要靶點。血清Her2與組織學(xué)Her2、乳腺癌患者的腫瘤負荷、淋巴結(jié)狀況均有一定關(guān)聯(lián)，并可能對化療或內(nèi)分泌治療療效產(chǎn)生一定影響，可能是一個獨立的預(yù)后因素。

人類表皮生長因子受體(human epidermal growth factor receptor)家族有4個成員：EGFR、Her2(人類表皮生長因子受體2)、ErbB3和ErbB4，廣泛表達于上皮、間質(zhì)及神經(jīng)組織，生理狀態(tài)下它們參與激活一系列復(fù)雜的細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，調(diào)控正常組織細胞的生長、分裂、分化等重要生理過程。然而研究表明某些腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及惡性生物學(xué)行為與EGFR家族的異常表達和活化關(guān)系密切(Albanell J,CodonyJ,Rovira A,Mellado B,Gascón P.Mechanism of action of anti-Her2monoclonal antibodies:scientific update on trastuzumab and2C4.Adv Exp Med Biol.2003；532:253-68)。Her2沒有天然配體，在單體狀態(tài)下無活性，當形成二聚體時可使酪氨酸激酶活化，激活MAPK和PI3K/Akt通路，最終導(dǎo)致腫瘤細胞增殖和存活(Hudis CA.Trastuzumab-mechanism of action and use in clinical practice.N Engl J Med.2007Jul5；357(1):39-51)。

1993年比利時科學(xué)家首次在Nature報道：在駱駝血液中的抗體，有一半沒有輕鏈，而且更讓人驚喜的是，這些缺失輕鏈的“重鏈抗體”能像正常抗體一樣與抗原等靶標緊密結(jié)合，另外不像scFv(人工改造的單鏈抗體片段)那樣互相粘連，甚至聚集成塊。這種抗體只包含一個重鏈可變區(qū)和兩個常規(guī)的CH2與CH3區(qū)，更重要的是單獨克隆并表達出來的VHH區(qū)(重鏈可變區(qū))具有很好的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性與抗原結(jié)合活性，分子量只是普通抗體的1/10，所以VHH也稱Nanobody(納米抗體)；與此同時納米抗體化學(xué)性質(zhì)也更加靈活，穩(wěn)定性好，可溶性高，表達容易且容易獲得，容易偶聯(lián)其他分子，因此應(yīng)用納米抗體技術(shù)研發(fā)Her2檢測試劑具有廣闊的前景。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

發(fā)明目的：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種針對Her2表位的納米抗體，同時提供該納米抗體的編碼的氨基酸序列以及核苷酸序列。

技術(shù)方案：為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的第一方面，提供了一種Her2的納米抗體的VHH鏈，選自下組的FR的氨基酸序列：SEQ ID NO：1所示的VHH1，SEQ ID NO：2所示的VHH2，SEQ ID NO：3所示的VHH3，SEQ ID NO：4所示的VHH4；或SEQ ID NO：5所示的VHH5，SEQ ID NO：6所示的VHH6，SEQ ID NO：7所示的VHH7。

本發(fā)明第2方面，提供了一種DNA分子，它編碼選自下組的蛋白質(zhì)：本發(fā)明所述的Her2的納米抗體的VHH鏈，或本發(fā)明所述的Her2納米抗體。優(yōu)選地，所述的DNA分子，其特征在于，它具有選自下組的DNA序列：SEQ ID NO：8至SEQ ID NO：14

本發(fā)明的第3方面，提供了一種表達載體，它含SEQ ID NO：8至SEQ ID NO：14所示的核苷酸序列。

本發(fā)明的第4方面，提供了本發(fā)明所述的Her2納米抗體用于檢測Her2的用途。

有益效果：與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點如下：本發(fā)明將Her2抗原免疫羊駝，隨后利用該駱駝外周血淋巴細胞進行流式細胞篩選，得到陽性結(jié)果之后提取RNA，進行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。從而獲得了針對Her2特異性的納米抗體基因，將此基因轉(zhuǎn)至大腸桿菌中，從而建立了能在大腸桿菌中高效表達的納米抗體株。

附圖說明

圖1是納米抗體的基因電泳圖；其中泳道1是DL2000DNA分子標準，DL2000(2000bp,1000bp,750bp,500bp,250bp,100bp)泳道2-8是PCR擴增重鏈抗體可變區(qū)片段

圖2是表達的Her2納米抗體，經(jīng)鎳柱樹脂凝膠親和層析純化后的SDS-PAGE的電泳圖；其中泳道5是蛋白分子標準，泳道1-4以及6-8是破菌后蛋白總的粗提液樣品。蛋白分子標準是：

116.0KD,66.2KD,45.0KD,35.0KD,25.0KD,18.4KD,14.4KD.目的蛋白約為20KD。

具體實施方式

本發(fā)明將Her2抗原免疫羊駝，隨后利用該駱駝外周血淋巴細胞進行流式細胞篩選，得到陽性結(jié)果之后提取RNA，進行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。從而獲得了針對Her2特異性的納米抗體基因，將此基因轉(zhuǎn)至大腸桿菌中，從而建立了能在大腸桿菌中高效表達的納米抗體株。

下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。

實施例1：針對于Her2的納米抗體文庫的構(gòu)建：

(1)將購自ACROBiosystems公司的Her2抗原，其序列為GenBank:aaa75493，濃度為100微克每毫升，每次免疫將100微克Her2與弗氏佐劑等體積混合，免疫一只羊駝，每周一次，共免疫4次，除第一次使用完全的弗氏佐劑，剩余幾次全部使用弗式不全佐劑，免疫過程中刺激B細胞表達抗原特異性的納米抗體。

(2)4次免疫結(jié)束后，分離外周血單核細胞，流式分選陽性細胞并提取總RNA，參照QIAGEN公司提供的RNA提取試劑盒。(3)按照Super-Script III FIRST STRANDSUPERMIX試劑盒說明書，將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA并利用套式PCR擴增VHH鏈，

第一輪PCR：

上游引物：CAGGTGAAGGTCATCGARTC

下游:GATGCTCTTGTGACTCAGGAATC

擴增獲得羊駝單鏈和雙鏈的重鏈可變區(qū)-恒定區(qū)(VH-CH)，53℃退火,35個循環(huán)；

第二輪PCR：

以第一輪PCR產(chǎn)物作模板，

上游引物：

GGAATTCCATATGGATTATAAAGATGATGATAAACGCAGAGACAGTGACCAGAGT

下游引物：CCACGATTCTGCGGCCGCTTAATCCAGCTGACTCAGCC

擴增獲得羊駝單鏈VHH,53℃退火,35個循環(huán),回收目的片段，結(jié)果如圖1顯示。從左到右的DNA條帶分別是：第一為DL2000的分子Marker，第2-8泳帶為目的基因。

實施例2：納米抗體在宿主菌大腸桿菌中表達、純化：

1.構(gòu)建表達載體

將合成的納米抗體DNA片段雙酶切連入表達載體pET28a中，測序正確后在表達宿主中表達。表達載體的酶切條件為載體(1ug)35μL，10倍濃度快切酶緩沖液10μL，兩種酶NdeI、NotI各2μL，水51μL，37℃水浴20min，80℃失活10min，瓊脂糖凝膠電泳回收定量。DNA片段酶切條件為DNA片段1ug 20μL，10倍濃度快切酶緩沖液10μL，兩種酶NdeI、NotI各2μL，水66μL，37℃水浴20min，80℃失活10min，瓊脂糖凝膠電泳回收定量。表達載體與DNA片段連接條件：表達載體(50ng/μL)1μL，DNA片段(40ng/μL)1.5μL，10倍濃度的T4脫氧核糖核酸緩沖液1μL，T4脫氧核糖核酸連接酶1μL，水5.5μL，室溫1h連接，轉(zhuǎn)入BL21大腸桿菌感受態(tài)。

2.誘導(dǎo)表達

將序列正確的樣品進行誘導(dǎo)表達，誘導(dǎo)表達步驟為：將正確序列樣本菌液與2YT培養(yǎng)基按1:100稀釋，37℃，180～200rpm進行搖菌，搖至菌液OD600值為0.6～1.0時，取出少量菌液，加入終濃度為1mmol/L的IPTG進行誘導(dǎo)表達3～4h，收集菌液，空載體pet28a菌液按照上述正確樣本菌液相同誘導(dǎo)表達步驟操作；以未誘導(dǎo)的空載體pet28a菌液、誘導(dǎo)的空載體pet28a菌液和未誘導(dǎo)的正確樣本菌液作為對照進行聚丙烯酰胺凝膠電泳試驗，結(jié)果表明IPTG能夠誘導(dǎo)抗CD3e納米抗體在pet28a菌液中的表達。

3.純化蛋白

將IPTG誘導(dǎo)、表達后的菌液于離心機中7000rpm，離心10min收集菌體，用緩沖液PBS(PH7.4)清洗一次，再次離心收集菌體；用10mL的PBS(PH7.4)將菌液吹打混勻，置于冰上，放到超聲波細胞粉碎儀中，按超聲發(fā)振時間5s，間隙時間5s，保護溫度60℃，超聲功率10％的程序超聲破碎10min，將破碎后的菌液放于離心機中7000rpm，離心10min，將上清液進行親和層析純化，保存?zhèn)溆谩?/p>

實施例3 Her2抗體酶聯(lián)免疫活性檢測

Her2抗原用包被液PH(9.6)稀釋到2ng/μL，按每孔100μL加入到酶標板中，放置于4℃冰箱中過夜，第二天進行ELISA實驗，ELISA步驟如下：

步驟1、按每孔200μL的PBS-T加入包被后的酶標板進行清洗，清洗5次，每次3min，甩掉清洗液，于紙巾上拍板確保洗液全部被吸干；

步驟2、按每孔200μL向酶標板中加入5％的脫脂奶粉，室溫封閉1h；

步驟3、按步驟1中清洗步驟進行清洗，然后，依次將100μL的空白對照液、陰性對照、純化后的Her2抗體加入到酶標板中，室溫孵育2h；

步驟4、按步驟1中清洗步驟進行清洗，然后，按每孔100μL向酶標板加入HRP標記的標簽抗體，室溫孵育1h；

步驟5按步驟1中清洗步驟進行清洗，然后向每孔加入100μL的TMB，避光放置10min；

步驟6、向每孔加入50μL的2mol/L的硫酸溶液，終止反應(yīng)，將酶標板放于酶標儀中，于450nm條件下讀數(shù)。

結(jié)果如下：

其中，陰性對照為：未連接抗體基因的空載體培養(yǎng)液

空白對照為：PBS洗液

人乳腺癌細胞系SK-br-3細胞購自國家細胞資源共享平臺

最后應(yīng)說明的是：顯然，上述實施例僅僅是為清楚地說明本申請所作的舉例，是優(yōu)選的實施例。而并非對實施方式的限定。對于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在上述說明的基礎(chǔ)上還可以做出其它不同形式的變化或變動。這里無需也無法對所有的實施方式予以窮舉。而由此所引申出的顯而易見的變化或變動仍處于本申請型的保護范圍之中。

SEQUENCE LISTING

<110> 康眾（北京）生物科技有限公司

<120> 一種抗HER2的納米抗體

<130> 0

<160> 14

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 405

<212> DNA

<213> Vicugna pacos

<400> 1

atgggtcagg tgcagctggt ggagtctggg ggaggcttgg tgcaggctgg ggactctctg 60

agactctcct gagcagcctc gggacccagt tttagtgact atgccgtggg ctggttccgc 120

caggctatag ggaaggagcg tgaatttgta ggcgctgtta gctggacgag cacagaaaca 180

tcctatgcgg acgctgtgaa ggggcgattc accatctcca gagacaacgc caagaacacg 240

gtgtatctgc aaatgaacag cctgaagcct gaggacacgg ccgtttatac ttgtgcagca 300

actagaacgt acggctttac ttcacgttat caaactaact atgagtactg gggccagggg 360

acccaggtca ccgtctcctc agaacccaag acaccaaaac cacaa 405

<210> 2

<211> 405

<212> DNA

<213> Vicugna pacos

<400> 2

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acccaggtca ccgtctcctc agaacccaag acaccaaaac cacaa 405

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<212> DNA

<213> Vicugna pacos

<400> 3

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caggtcaccg tctcctcagc gcaccacagc gaagacccca gc 402

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<212> DNA

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acccaggtca ccgtctcctc agaacccaag acaccaaaac cacaa 405

<210> 8

<211> 134

<212> PRT

<213> Vicugna pacos

<400> 8

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Gly Asp Ser Leu Arg Leu Ser Ala Ala Ser Gly Pro Ser Phe Ser Asp

20 25 30

Tyr Ala Val Gly Trp Phe Arg Gln Ala Ile Gly Lys Glu Arg Glu Phe

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Val Gly Ala Val Ser Trp Thr Ser Thr Glu Thr Ser Tyr Ala Asp Ala

50 55 60

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65 70 75 80

Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Thr

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Tyr Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Glu Pro

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130

<210> 9

<211> 134

<212> PRT

<213> Vicugna pacos

<400> 9

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1 5 10 15

Gly Asp Ser Leu Arg Leu Ser Ala Ala Ser Gly Pro Ser Phe Ser Asp

20 25 30

Tyr Ala Val Gly Trp Phe Arg Gln Ala Ile Gly Lys Glu Arg Glu Phe

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Val Gly Ala Val Ser Trp Thr Ser Thr Glu Thr Ser Tyr Ala Asp Ala

50 55 60

Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val

65 70 75 80

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<212> PRT

<213> Vicugna pacos

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Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser

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<212> PRT

<213> Vicugna pacos

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Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Ala Ala Ser Gly Ser Ile Ser Thr Val

20 25 30

Asp Ile Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Val Gly Lys Gln Arg Glu Leu

35 40 45

Val Ala Val Val Thr Arg Ser Ala Gly Ala Arg Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

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65 70 75 80

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100 105 110

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Pro Ser Glu Pro Lys Thr

115 120 125

Pro Lys Pro Gln

130

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<211> 135

<212> PRT

<213> Vicugna pacos

<400> 12

Met Gly Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala

1 5 10 15

Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser

20 25 30

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Phe Val Ala Ala Ile Ser Trp Ser Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Gly Asp

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Leu

65 70 75 80

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85 90 95

Tyr Cys Ala Ala Gly Arg Asn Ile Tyr Phe Ser Asn Ser Pro Leu Ala

100 105 110

Gly Ser Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Glu

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Pro Lys Thr Pro Lys Pro Gln

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<210> 13

<211> 135

<212> PRT

<213> VICUGNA PACOS

<400> 13

Met Gly Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala

1 5 10 15

Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser

20 25 30

Ala Tyr Asp Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu

35 40 45

Phe Val Ala Ala Ile Ser Trp Ser Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Gly Asp

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Leu

65 70 75 80

Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr

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Tyr Cys Ala Ala Gly Arg Asn Ile Tyr Phe Ser Asn Ser Pro Leu Ala

100 105 110

Gly Ser Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Glu

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Pro Lys Thr Pro Lys Pro Gln

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<210> 14

<211> 135

<212> PRT

<213> Vicugna pacos

<400> 14

Met Gly Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala

1 5 10 15

Gly Asp Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Pro Ser Phe Ser

20 25 30

Asp Tyr Ala Val Gly Trp Phe Arg Gln Ala Ile Gly Lys Glu Arg Glu

35 40 45

Phe Val Gly Ala Val Ser Trp Thr Ser Thr Glu Thr Ser Tyr Ala Asp

50 55 60

Ala Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr

65 70 75 80

Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr

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100 105 110

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Pro Lys Thr Pro Lys Pro Gln

130 135