本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種用于檢測番茄灰葉斑病原菌的引物及試劑盒。

背景技術(shù)：

番茄(solanumesculentuml.)是我國最主要的蔬菜之一，深受種植者和消費(fèi)者喜愛，種植面積不斷擴(kuò)大，現(xiàn)已可以周年種植。制約番茄生產(chǎn)的因素除市場行情較難預(yù)測外，最主要的就是病蟲多、危害較重。其中，番茄灰葉斑病(tomatograyleafspotdisease，glsd)是世界性病害。近年來，番茄灰葉斑病呈現(xiàn)出暴發(fā)流行更為嚴(yán)重的趨勢，誤診或防治不及時(shí)，常造成番茄減產(chǎn)，一般減產(chǎn)20％左右，有的甚至減產(chǎn)80％以上，給種植戶造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失(曹守軍等，2011；劉國華，2012)。

番茄灰葉斑病由半知菌亞門匍柄霉屬(stemphylium)真菌引起(al-mughrabi，2003)，主要通過種子傳播，病菌可在保護(hù)地土壤中的病殘?bào)w及種子上越冬，翌年溫濕度適宜時(shí)產(chǎn)生分生孢子，進(jìn)行初侵染，孢子通過風(fēng)雨傳播，進(jìn)行再侵染。番茄灰葉斑病對(duì)番茄有致命的危害，因?yàn)榧词乖谡囟群蜐穸葪l件下，造成這種病害的病原物傳播很快，它每周可完成兩個(gè)孢子循環(huán)。該病主要為害葉片，發(fā)病初期在葉片上產(chǎn)生圓形或不規(guī)則形的灰褐色斑點(diǎn)，然后病斑沿著葉脈逐漸擴(kuò)展呈不規(guī)則形，對(duì)番茄花、莖、果及新葉造成生長緩慢，植株萎蔫，輕者產(chǎn)量、品質(zhì)降低，重者造成絕收(陳隨菊，2011；杜白海和張建英，2013)。

番茄灰葉斑病在世界范圍內(nèi)均有發(fā)生，溫暖潮濕地區(qū)發(fā)生嚴(yán)重，主要分布在美國、意大利、澳大利亞、以色列、加拿大、英國、毛里求斯、塞內(nèi)加爾、贊比亞、安哥拉、尼日利亞、塞舌爾群島、泰國、日本、巴西、印度、委內(nèi)瑞拉、利比亞、蘇丹、佛羅里達(dá)、馬來西亞等地(atherton&rudich，1989；rotemetal.,1966)。近年來，該病在中國臺(tái)灣、北京、遼寧、河北、重慶、貴州、海南、山東、浙江溫州、嘉善、余杭、海寧、杭州等地均有發(fā)生，嚴(yán)重影響番茄生產(chǎn)，并在逐步擴(kuò)延和加劇。因此，加強(qiáng)番茄灰葉斑病菌的防治對(duì)于保證番茄穩(wěn)產(chǎn)、高產(chǎn)有著重要的作用。建立高效、快速、準(zhǔn)確的病菌檢測技術(shù)，這些可對(duì)制定正確的抗病育種策略和合理布局品種都具有極其重要的參考價(jià)值。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種用于檢測番茄灰葉斑病原菌的引物，特異性強(qiáng)，檢測準(zhǔn)確性高，對(duì)于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中番茄灰葉斑病原菌引起的病害防治具有重要的實(shí)用價(jià)值。

本發(fā)明還提供了一種包含上述引物的試劑盒。

本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是：

一種用于檢測番茄灰葉斑病原菌的引物，包括上游引物和下游引物，具體序列如下：

上游引物：5’-ctgaacccaccgcttttgccatgtc-3’；

下游引物：5’-cgaacatgggagcgtcggcggaa-3’。

上述引物特異性強(qiáng)，檢測準(zhǔn)確性高，適用于番茄灰葉斑病原菌pcr檢測。用上述引物對(duì)待測樣品進(jìn)行pcr擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物有489bp大小的條帶，則樣品中含有番茄灰葉斑病原菌。

一種用于檢測番茄灰葉斑病原菌的試劑盒，該試劑盒包括盒體和4支pcr管，在2支pcr管中分別裝有2×taqpcrmastermix和ddh2o；在另外2支pcr管中分別裝有用于檢測番茄灰葉斑病原菌的上游引物及用于檢測番茄灰葉斑病原菌的下游引物。

作為優(yōu)選，用于檢測番茄灰葉斑病原菌的上游引物序列為：5’-ctgaacccaccgcttttgccatgtc-3’；用于檢測番茄灰葉斑病原菌的下游引物序列為：5’-cgaacatgggagcgtcggcggaa-3’。

本發(fā)明的有益效果是：適用于植物組織中番茄灰葉斑病原菌的快速檢測，引物特異性強(qiáng)，檢測準(zhǔn)確性高，對(duì)于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中番茄灰葉斑病原菌引起的病害防治具有重要的實(shí)用價(jià)值。

附圖說明

圖1為本發(fā)明引物特異性檢測樣品dna擴(kuò)增后的凝膠電泳圖。

圖2為本發(fā)明田間病株上分離菌株dna擴(kuò)增后的凝膠電泳圖。

具體實(shí)施方式

下面通過具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的具體說明。

本發(fā)明中，若非特指，所采用的原料和設(shè)備等均可從市場購得或是本領(lǐng)域常用的。下述實(shí)施例中的方法，如無特別說明，均為本領(lǐng)域的常規(guī)方法。

本發(fā)明的引物由上海生物技術(shù)有限公司合成，所有序列測定工作均由上海生物技術(shù)有限公司完成。

實(shí)施例1：

根據(jù)genbank中三磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase，gpd)的保守序列(genbank編號(hào)kf921502.1、ku599919.1、kc796690.1、ay278821.1、dq000654.1、af081398.1、af443883.1、af443886.1、kf479194.1)，設(shè)計(jì)引物stem-f與stem-r，擴(kuò)增長度為489bp，對(duì)其片段進(jìn)行克隆、測序和分析。番茄灰葉斑病原菌特異性的引物序列如下：

上游引物(stem-f)：5’-ctgaacccaccgcttttgccatgtc-3’(序列表中seqidno：1)；

下游引物(stem-r)：5’-cgaacatgggagcgtcggcggaa-3’(序列表中seqidno：2)。

序列表中的seqidno：1由25個(gè)堿基組成，seqidno：2由23個(gè)堿基組成，擴(kuò)增片段長度為489bp。

實(shí)施例2：

一種用于檢測番茄灰葉斑病原菌的試劑盒，該試劑盒包括盒體和4支pcr管，在2支pcr管中分別裝有2×taqpcrmastermix和ddh2o；在另外2支pcr管中分別裝有用于檢測番茄灰葉斑病原菌的上游引物及用于檢測番茄灰葉斑病原菌的下游引物。

用本發(fā)明的引物對(duì)番茄灰葉斑病原菌進(jìn)行常規(guī)pcr檢測

本例所述菌株：由浙江省農(nóng)科院植微所提供的番茄灰葉斑病原菌。

檢測方法按以下步驟進(jìn)行：

1、菌絲dna的提?。河脺缇篮瀼钠桨迳瞎稳【z約0.1克，置于2.0ml離心管中，按常規(guī)ctab法提取dna后，分別保存，備用；

2、pcr擴(kuò)增：在各pcr管中分別加入步驟1提取的各樣品dna1μl后，再依次加入2×taqpcrmastermix5μl(市售，天根生化)，上下游引物各0.25μl(終濃度0.25μm)，加ddh2o至10μl后，按pcr反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性3min，94℃50seconds，58℃退火45seconds，72℃50seconds，35個(gè)循環(huán)進(jìn)行擴(kuò)增，72℃延伸10min，產(chǎn)物4℃保存；上游引物序列為seqidno：1，下游引物序列為seqidno：2。

3、pcr擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳分析：各樣品分別取擴(kuò)增產(chǎn)物10μl和由0.25％溴酚蘭加40％蔗糖配制而成的上樣緩沖液2μl，混勻，將混合物在1.5％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳分離，至溴酚蘭到達(dá)凝膠的2/3位置處停止電泳，凝膠經(jīng)eb染色后用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行觀察、照相。

4、番茄灰葉斑病原菌的檢測：根據(jù)凝膠電泳結(jié)果，分析判斷被檢測樣品(見圖1)：番茄灰葉斑病原菌擴(kuò)增出489bp條帶，與預(yù)期結(jié)果相符，表明本發(fā)明的引物可用于番茄灰葉斑病原菌的常規(guī)pcr檢測。

用本發(fā)明的引物對(duì)從番茄灰葉斑病株上分離的菌株進(jìn)行常規(guī)pcr檢測

本例所述菌株：由浙江番茄主栽區(qū)番茄灰葉斑病株上分離獲得的菌株。

檢測方法按以下步驟進(jìn)行：

1、菌絲dna的提?。河脺缇篮瀼钠桨迳瞎稳【z約0.1克，置于2.0ml離心管中，按常規(guī)ctab法提取dna后，分別保存，備用；

2、pcr擴(kuò)增：在各pcr管中分別加入步驟(1)提取的各樣品dna1μl后，再依次加入2×taqpcrmastermix5μl，上下游引物各0.25μl，加ddh2o至10μl后，按pcr反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性3min，94℃50seconds，58℃退火45seconds，72℃50seconds，35個(gè)循環(huán)進(jìn)行擴(kuò)增，72℃延伸10min，產(chǎn)物4℃保存；上游引物序列為seqidno：1，下游引物序列為seqidno：2。

3、pcr擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳分析：各樣品分別取擴(kuò)增產(chǎn)物10μl和由0.25％溴酚蘭加40％蔗糖配制而成的上樣緩沖液2μl，混勻，將混合物在1.5％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳分離，至溴酚蘭到達(dá)凝膠的2/3位置處停止電泳，凝膠經(jīng)eb染色后用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行觀察、照相。

4、番茄灰葉斑病原菌的檢測：根據(jù)凝膠電泳結(jié)果，分析判斷被檢測樣品(見圖2)：番茄灰葉斑病原菌擴(kuò)增出489bp條帶，表明本發(fā)明的引物可用于番茄灰葉斑病原菌的常規(guī)pcr檢測。

以上所述的實(shí)施例只是本發(fā)明的一種較佳的方案，并非對(duì)本發(fā)明作任何形式上的限制，在不超出權(quán)利要求所記載的技術(shù)方案的前提下還有其它的變體及改型。

sequencelisting

<110>浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院

<120>用于檢測番茄灰葉斑病原菌的引物及試劑盒

<130>2017.03

<160>2

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

ctgaacccaccgcttttgccatgtc25

<210>2

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

cgaacatgggagcgtcggcggaa23