本發(fā)明涉及基因工程及蛋白純化技術領域，具體涉及一種pbpp蛋白及其功能驗證方法。

背景技術：

糖尿病是由遺傳因素、免疫功能紊亂、微生物感染及其毒素、自由基毒素、精神因素等等各種致病因子作用于機體導致胰島功能減退、胰島素抵抗等而引發(fā)的糖、蛋白質、脂肪、水和電解質等一系列代謝紊亂綜合征，臨床上以高血糖為主要特點。

目前，我國ⅱ型糖尿病的患病率增長較快，據(jù)1979年在我國30萬人口中的調查，糖尿病患病率為0.6％，1989年為2.02％，年均增長0.1％左右，1994年我國普查20萬人口，患病率已上升為2.5％，目前20～75歲人群中糖尿病患病率約為3％左右。糖耐量低減患者不低于3％。一般而言，在我國富裕地區(qū)的糖尿病患病率高于貧困地區(qū)，城市高于農(nóng)村，肥胖高于正常體重，高齡高于低齡。目前我國糖尿病發(fā)病率為1/1000左右，50歲以上的平均患病率為7％以上，40歲以下患病率隨著年齡的增長而升高，患者高峰年齡在50～70歲。

我國患病率以北京、遼寧、寧夏、甘肅、云南、福建較高，據(jù)1979～1997年調查結果表明為全國之首，而新疆、貴州、山西較低。發(fā)病率較高的北京、遼寧與最低的貴州、新疆之間相差達10倍，城市發(fā)病率高于農(nóng)村1～4倍，廣西地區(qū)調查證明，產(chǎn)糖地區(qū)糖尿病患病率高于非產(chǎn)糖區(qū)2倍。

盡管多種治療方法可以控制血糖濃度，但目前仍未實現(xiàn)糖尿病的根治?，F(xiàn)有技術中，藥物干預仍是糖尿病治療的主要手段，其中以glp-1類似物、dppiv抑制劑等應用較為廣泛。pbpp蛋白(promotingβ-cellproliferationprotein)，是指可誘導胰腺中β細胞增殖、進而促進胰島素分泌的一類功能性蛋白，由于其不直接參與人體糖代謝機制，因此降糖作用較為溫和，對人體副作用較小。然而，此類蛋白的規(guī)模化生產(chǎn)是目前制約其臨床應用的直接技術問題，其中人源蛋白的獲取較為困難，而其他生物來源的pbpp蛋白其藥效及安全性又難以得到保障。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明旨在針對現(xiàn)有技術的技術缺陷，提供一種pbpp蛋白及其功能驗證方法，以解決現(xiàn)有技術中pbpp蛋白難以規(guī)模化制備的技術問題。

本發(fā)明要解決的另一技術問題是以基因工程手段獲得的、由微生物所表達的重組pbpp蛋白，其純化較為困難。

本發(fā)明要解決的再一技術問題是現(xiàn)有技術中pbpp蛋白對哺乳動物血糖的調節(jié)效果難以得到準確的量化考察。

為實現(xiàn)以上技術目的，本發(fā)明采用以下技術方案：

一種pbpp蛋白，該pbpp蛋白是由以下方法制備的：

1)以斑馬魚糞便菌群的總dna為模板，以序列如seqidno.1所示和序列如seqidno.2所示的片段分別為上、下游引物執(zhí)行pcr擴增，得到序列如seqidno.3所示的dna片段，即為pbpp蛋白表達基因；

2)取步驟1)所獲得的pbpp蛋白表達基因，連接到pet28c載體上，即得到重組質粒pet28c-pbpp；

3)取步驟2)所得的重組質粒pet28c-pbpp，轉入大腸桿菌e.colitop10中，得到重組菌株；

4)培養(yǎng)步驟3)所得的重組菌株，從中提取重組質粒pet28c-pbpp，將其轉化入大腸桿菌e.colibl21，即得到重組表達菌株pet28c-pbpp-bl21；

5)培養(yǎng)步驟4)所得的重組表達菌株pet28c-pbpp-bl21，收集菌體；

6)利用eqbuffer重懸步驟5)所得菌體，超聲破碎，而后以10000rpm的轉速離心10min，取上清；取鎳珠，懸浮于eqbuffer中，以4000rpm的轉速離心15min，收集沉淀，懸浮于eqbuffer中，再以4000rpm的轉速離心15min，收集沉淀，重懸于eqbuffer中，得到鎳珠懸液，將其加入至所述上清中，于4℃條件下保持2h，而后以4000rpm的轉速離心15min，收集沉淀，懸浮于washbuffer中，而后在旋轉混勻儀上常溫旋轉10min，而后以4000rpm的轉速離心15min，收集沉淀，重懸于eqbuffer中，再以4000rpm的轉速離心15min，收集沉淀，重懸于eqbuffer中，再以4000rpm的轉速離心15min，收集沉淀；

7)取步驟6)所得沉淀物懸浮于洗脫buffer中，在旋轉混勻儀上常溫旋轉15min，以4000rpm的轉速離心15min，收集上清，再以4000rpm的轉速離心15min收集上清；

8)取步驟7)所得的上清液，以13000rpm的轉速離心30～60min，取上清裝入透析袋，先利用1×pbs緩沖液透析3h，再用25％體積濃度的甘油水溶液透析3h，即得到所述pbpp蛋白。

作為優(yōu)選，步驟5)中用于培養(yǎng)重組表達菌株pet28c-pbpp-bl21的培養(yǎng)基是含有100μg/ml氨芐青霉素的lb培養(yǎng)基。

作為優(yōu)選，步驟5)中，初始向培養(yǎng)基中接入的重組表達菌株pet28c-pbpp-bl21菌液量為培養(yǎng)基體積的1％。

作為優(yōu)選，步驟5)中培養(yǎng)至培養(yǎng)液od值為0.6時向其中加入終濃度為1mmol/l的iptg，于25℃條件下誘導6～8h，結束培養(yǎng)。

作為優(yōu)選，步驟2)中pbpp蛋白表達基因與pet28c載體的連接是先經(jīng)ncoi和xhoi雙酶切，酶切產(chǎn)物純化后采用t4連接酶連接到pet28c上。

作為優(yōu)選，步驟6)中所述的超聲破碎，直至溶液澄清為止。

作為優(yōu)選，步驟6)中所述的以4000rpm的轉速離心15min，被離心物均是裝滿于15ml離心管中進行離心的。

作為優(yōu)選，步驟6)鎳珠在eqbuffer中的懸浮，二者的體積比為1:15。

作為優(yōu)選，步驟8)利用1×pbs緩沖液透析3h的過程中，先后更換pbs緩沖液3次。

同時，本發(fā)明還提供了一種上述pbpp蛋白的功能驗證方法，包括以下步驟：

1)取小鼠，連續(xù)5d以每天50mg/kg的劑量注射鏈脲佐菌素，得到ii型糖尿病模型小鼠；

2)取所述pbpp蛋白，以尾靜脈注射方式對步驟1)所得的ii型糖尿病模型小鼠給藥，每隔7天監(jiān)測所述ii型糖尿病模型小鼠的血糖變化。

本發(fā)明提供了一種pbpp蛋白及其功能驗證方法，該技術方案以斑馬魚糞便菌群dna為模板，擴增得到pbpp表達基因，再利用pet28c質粒為載體，先于大腸桿菌top10中擴增質粒，而后轉化入大腸桿菌bl21中進行蛋白表達。在此基礎上，本發(fā)明針對重組菌株的特性設計了適宜的蛋白表達及誘導條件，對于胞內(nèi)表達的pbpp蛋白，本發(fā)明對菌體進行超聲破碎后，先利用鎳珠結合游離的蛋白，再進行蛋白洗脫，最后分別利用pbs和甘油進行透析，從而實現(xiàn)了pbpp蛋白的有效純化。

在此基礎上，為考察pbpp蛋白的降糖效果，本發(fā)明建立了相應的功能驗證方法，該方法先利用鏈脲佐菌素構建ii型糖尿病模型小鼠，而后采用尾靜脈注射的方式進行pbpp蛋白給藥，以給藥后小鼠血糖變化情況來對pbpp蛋白的降糖效果進行分析。實驗發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明所提供的pbpp蛋白可確切誘導胰腺中β細胞的增殖，從而對因胰島β細胞損傷所導致的糖尿病起到治療效果。

具體實施方式

以下將對本發(fā)明的具體實施方式進行詳細描述。為了避免過多不必要的細節(jié)，在以下實施例中對屬于公知的結構或功能將不進行詳細描述。除有定義外，以下實施例中所用的技術和科學術語具有與本發(fā)明所屬領域技術人員普遍理解的相同含義。

以下實施例中所用的試驗試劑耗材，如無特殊說明，均為常規(guī)生化試劑；所述實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法；以下實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，結果取平均值；以下實施例中的％，如無特別說明，均為質量百分含量。

以下實施例中，所用到的e.colitop10，e.colibl21，pet28c載體質粒購自生工生物工程(上海)股份有限公司；所用到的限制性內(nèi)切酶、t4dna連接酶、dna連接酶購自neb公司；所用到的lb固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基由本實驗室自行配制。

以下實施例中，各緩沖液配方如下：

4leqbuffer：nah2po4.h2o1.46g；na2hpo4.7h2o:50.76g；最后加水到4l，過濾除菌，調ph為8.0，滅菌。

washbuffer：加0.34g咪唑在500mleqbuffer中，調ph為8.0.滅菌。(現(xiàn)配現(xiàn)用)。

洗脫buffer：加1.7g咪唑到eqbuffer，終體積為100ml，調ph為8.0，滅菌(現(xiàn)配現(xiàn)用)。

100mmiptg：2.4giptg溶于100ml水中，過濾除菌。

實施例1

1、pbpp蛋白重組表達系統(tǒng)的構建

以斑馬魚糞便菌群dna為模板，以seqidno.1和seqidno.2序列為引物，pcr擴增獲得seqidno.3所示的pbpp片段，命名為pbpp。

已獲得的pbpp片段和質粒pet28c，經(jīng)ncoi和xhoi雙酶切，酶切產(chǎn)物純化后，采用t4連接酶連接到pet28c(seqidno.4)質粒中，重組質粒命名為pet28c-pbpp，并轉化進入e.colibl21中，獲得的重組表達菌株命名為pet28c-pbpp-bl21。

2、pbpp蛋白的表達與純化

(1)pbpp蛋白表達：配制200mllb培養(yǎng)基，待冷卻后加入200ul氨芐母液，使其終濃度為100ug/ml；挑選pet28c-pbpp-bl21單菌落進行過夜搖瓶培養(yǎng)；按1％接種量接入新鮮含有氨芐抗生素的lb培養(yǎng)基中；待其od為0.6時加入終濃度為1mmiptg進行誘導，25℃連續(xù)誘導培養(yǎng)6-8h后離心菌體，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

(2)pbpp蛋白純化：

a結合蛋白：將步驟(1)中收獲的菌體35mleqbuffer懸浮，超聲破碎呈現(xiàn)澄清透亮的溶液后，10000rpm/min離心10min，收集上清備用；取1ml鎳珠，用15ml離心管重懸鎳珠(裝滿15ml)，4000rpm離心15分鐘，重復兩次；用1mleqbuffer重懸鎳珠；將洗滌好的鎳珠加入蛋白上清中，置于4度中令鎳珠和蛋白結合2h；4000rpm離心15分鐘，棄上清。用washbuffer重懸鎳珠，將其置于15ml離心管中，加washbuffer至15ml，置于旋轉儀器上于常溫旋轉10分鐘，4000rpm離心15分鐘。重復該操作3次。

b洗脫蛋白：將步驟a中收獲的沉淀用1ml洗脫buffer懸浮，并在常溫下于旋轉儀上旋轉15分鐘，4000轉離心15分鐘，本步驟重復兩次，回收總體積為2ml蛋白溶液，同時回收鎳珠。

c洗滌：將洗脫的上清轉移到1.5ml離心管中，最大轉速13000rpm離心30-60min，小心取上清，裝于透析袋中，采用1×pbs透析3h，更換pbs溶液重復3次；最后采用25％的甘油透析3h，小心吸取蛋白上清，測定濃度后，分裝，-80凍存?zhèn)溆茫⒉捎胹ds-page膠驗證蛋白大小及純度；

3、pbpp蛋白的功能性驗證

試劑配置：0.1m枸櫞酸緩沖液(ph4.5)：0.1m枸櫞酸液4.5ml(0.21014枸櫞酸溶于10ml蒸餾水中)+0.1m枸櫞酸鈉液5.5ml(0.29412枸櫞酸鈉溶于10ml蒸餾水中)；7.5mg/ml無菌stz溶液(取37.5mgstz溶于5ml枸櫞酸緩沖液，與超凈臺0.22um濾器過濾，分裝存于-20℃即可)(注意避光)

實驗流程：

(1)劑量及給藥方式：陽性組：50mg/kg/天stz溶液；陰性組：與陽性組同等劑量枸櫞酸緩沖液；

給藥方式：腹腔注射；

(2)取12只健康雄性老鼠，觀察24h，無異常后進行試驗；小鼠隨機分為2組，稱重；第一次給藥前饑餓處理24h，禁食不禁水；稱重后，按照陽性組劑量換算后，與超凈臺中腹腔注射stz藥物，打完后，正常給予飼料，無菌水喂養(yǎng)，連續(xù)5天同一時間注射stz藥物；并于打完第3，7，10，14，21，28天用試紙測定小鼠空腹8h后的血糖和接著喂食2h后的血糖，若陽性組大于11.1mmol/l，則造模成功；

(3)造模成功后，每日尾靜脈注射pbpp蛋白，頻率2天一次，正常飲食；陰性組，尾靜脈注射無菌pbs作為對照；

(4)在第7天，第14天，第21天檢測小鼠空腹8h后的血糖及接著喂食2h后的血糖，觀察血糖有無下降；

實施例2

一種pbpp蛋白，該pbpp蛋白是由以下方法制備的：

1)以斑馬魚糞便菌群的總dna為模板，以序列如seqidno.1所示和序列如seqidno.2所示的片段分別為上、下游引物執(zhí)行pcr擴增，得到序列如seqidno.3所示的dna片段，即為pbpp蛋白表達基因；

2)取步驟1)所獲得的pbpp蛋白表達基因，連接到pet28c載體上，即得到重組質粒pet28c-pbpp；

3)取步驟2)所得的重組質粒pet28c-pbpp，轉入大腸桿菌e.colitop10中，得到重組菌株；

4)培養(yǎng)步驟3)所得的重組菌株，從中提取重組質粒pet28c-pbpp，將其轉化入大腸桿菌e.colibl21，即得到重組表達菌株pet28c-pbpp-bl21；

5)培養(yǎng)步驟4)所得的重組表達菌株pet28c-pbpp-bl21，收集菌體；

6)利用eqbuffer重懸步驟5)所得菌體，超聲破碎，而后以10000rpm的轉速離心10min，取上清；取鎳珠，懸浮于eqbuffer中，以4000rpm的轉速離心15min，收集沉淀，懸浮于eqbuffer中，再以4000rpm的轉速離心15min，收集沉淀，重懸于eqbuffer中，得到鎳珠懸液，將其加入至所述上清中，于4℃條件下保持2h，而后以4000rpm的轉速離心15min，收集沉淀，懸浮于washbuffer中，而后在旋轉混勻儀上常溫旋轉10min，而后以4000rpm的轉速離心15min，收集沉淀，重懸于eqbuffer中，再以4000rpm的轉速離心15min，收集沉淀，重懸于eqbuffer中，再以4000rpm的轉速離心15min，收集沉淀；

7)取步驟6)所得沉淀物懸浮于洗脫buffer中，在旋轉混勻儀上常溫旋轉15min，以4000rpm的轉速離心15min，收集上清，再以4000rpm的轉速離心15min收集上清；

8)取步驟7)所得的上清液，以13000rpm的轉速離心30～60min，取上清裝入透析袋，先利用1×pbs緩沖液透析3h，再用25％體積濃度的甘油水溶液透析3h，即得到所述pbpp蛋白。

在以上技術方案的基礎上，滿足以下條件：

步驟5)中用于培養(yǎng)重組表達菌株pet28c-pbpp-bl21的培養(yǎng)基是含有100μg/ml氨芐青霉素的lb培養(yǎng)基。

步驟5)中，初始向培養(yǎng)基中接入的重組表達菌株pet28c-pbpp-bl21菌液量為培養(yǎng)基體積的1％。

步驟5)中培養(yǎng)至培養(yǎng)液od值為0.6時向其中加入終濃度為1mmol/l的iptg，于25℃條件下誘導6～8h，結束培養(yǎng)。

步驟2)中pbpp蛋白表達基因與pet28c載體的連接是先經(jīng)ncoi和xhoi雙酶切，酶切產(chǎn)物純化后采用t4連接酶連接到pet28c上。

步驟6)中所述的超聲破碎，直至溶液澄清為止。

步驟6)中所述的以4000rpm的轉速離心15min，被離心物均是裝滿于15ml離心管中進行離心的。

步驟6)鎳珠在eqbuffer中的懸浮，二者的體積比為1:15。

步驟8)利用1×pbs緩沖液透析3h的過程中，先后更換pbs緩沖液3次。

一種上述述pbpp蛋白的功能驗證方法，其特征在于包括以下步驟：

1)取小鼠，連續(xù)5d以每天50mg/kg的劑量注射鏈脲佐菌素，得到ii型糖尿病模型小鼠；

2)取所述pbpp蛋白，以尾靜脈注射方式對步驟1)所得的ii型糖尿病模型小鼠給藥，每隔7天監(jiān)測所述ii型糖尿病模型小鼠的血糖變化。

實施例3

一種pbpp蛋白，該pbpp蛋白是由以下方法制備的：

1)以斑馬魚糞便菌群的總dna為模板，以序列如seqidno.1所示和序列如seqidno.2所示的片段分別為上、下游引物執(zhí)行pcr擴增，得到序列如seqidno.3所示的dna片段，即為pbpp蛋白表達基因；

2)取步驟1)所獲得的pbpp蛋白表達基因，連接到pet28c載體上，即得到重組質粒pet28c-pbpp；

3)取步驟2)所得的重組質粒pet28c-pbpp，轉入大腸桿菌e.colitop10中，得到重組菌株；

4)培養(yǎng)步驟3)所得的重組菌株，從中提取重組質粒pet28c-pbpp，將其轉化入大腸桿菌e.colibl21，即得到重組表達菌株pet28c-pbpp-bl21；

5)培養(yǎng)步驟4)所得的重組表達菌株pet28c-pbpp-bl21，收集菌體；

6)利用eqbuffer重懸步驟5)所得菌體，超聲破碎，而后以10000rpm的轉速離心10min，取上清；取鎳珠，懸浮于eqbuffer中，以4000rpm的轉速離心15min，收集沉淀，懸浮于eqbuffer中，再以4000rpm的轉速離心15min，收集沉淀，重懸于eqbuffer中，得到鎳珠懸液，將其加入至所述上清中，于4℃條件下保持2h，而后以4000rpm的轉速離心15min，收集沉淀，懸浮于washbuffer中，而后在旋轉混勻儀上常溫旋轉10min，而后以4000rpm的轉速離心15min，收集沉淀，重懸于eqbuffer中，再以4000rpm的轉速離心15min，收集沉淀，重懸于eqbuffer中，再以4000rpm的轉速離心15min，收集沉淀；

7)取步驟6)所得沉淀物懸浮于洗脫buffer中，在旋轉混勻儀上常溫旋轉15min，以4000rpm的轉速離心15min，收集上清，再以4000rpm的轉速離心15min收集上清；

8)取步驟7)所得的上清液，以13000rpm的轉速離心30～60min，取上清裝入透析袋，先利用1×pbs緩沖液透析3h，再用25％體積濃度的甘油水溶液透析3h，即得到所述pbpp蛋白。

以上對本發(fā)明的實施例進行了詳細說明，但所述內(nèi)容僅為本發(fā)明的較佳實施例，并不用以限制本發(fā)明。凡在本發(fā)明的申請范圍內(nèi)所做的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。

sequencelisting

<110>南昌大學

<120>一種pbpp蛋白及其功能驗證方法

<130>2017

<160>4

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>36

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

cgtgccatggggatgaacaagcgtaactggttgctg36

<210>2

<211>31

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

taagctcgaggcggctcgtttcagtcaagtc31

<210>3

<211>783

<212>dna

<213>天然序列（斑馬魚）

<400>3

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cgc783

<210>4

<211>5367

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

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