本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種適用于土曲霉的表達(dá)載體及其制備方法。

背景技術(shù)：

土曲霉屬于散囊菌綱，散囊菌霉目，曲霉科，拉丁名為Aspergillus terreus。菌落為土黃色，具短絨毛，似細(xì)沙分布于培養(yǎng)基上；營養(yǎng)菌絲樹根狀，叢生密集，分叉，有隔，分生孢子梗較短；生長較快。土曲霉的這些特性便于基因在其中大量且穩(wěn)定地表達(dá)。因此，土曲霉在用于基因表達(dá)的研究方面具有巨大的應(yīng)用前景。

然而，現(xiàn)有的適用于土曲霉的表達(dá)載體多為真菌通用的載體，多采用的是構(gòu)巢曲霉的3-磷酸甘油醛脫氫酶(Glyceraldehyde一3-phosphate dehydrogenase，gpd)基因的啟動子，而非專門針對土曲霉，這些表達(dá)載體在土曲霉中表達(dá)能力較弱；此外，這些表達(dá)載體沒有一個蛋白標(biāo)記，不能用作信號通路的研究。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種適用于土曲霉的表達(dá)載體及其制備方法。

本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種適用于土曲霉的表達(dá)載體，所述表達(dá)載體由在pUC19的多克隆位點(diǎn)處插入土曲霉基因中的丙酮酸脫羧酶基因的啟動子和終止子而獲得，其中啟動子序列為SEQ ID NO.1中的第2241-2990位，終止子序列為SEQ ID NO.1中的第3721-4230位。

進(jìn)一步地，所述啟動子和終止子之前插入有一段紅色熒光蛋白基因，所述紅色熒光蛋白基因的序列為SEQ ID NO.1中的第3034-3715位。

進(jìn)一步地，所述紅色熒光蛋白基因產(chǎn)生的紅色熒光由波長為500～560nm的綠光激發(fā)而得。

進(jìn)一步地，所述載體在所述啟動子序列與所述紅色熒光蛋白序列之間存在Sal I、Nru I兩個酶切位點(diǎn)。

進(jìn)一步地，所述表達(dá)載體在所述啟動子的序列的上游及所述終止子的序列的下游存在通用引物M13的結(jié)合位點(diǎn)。

進(jìn)一步地，所述表達(dá)載體的基因序列如SEQ ID NO.1所示。

本發(fā)明還提供了一種上述所述的表達(dá)載體的制備方法，包括以下步驟：

以土曲霉基因組為模板，Ppdc-F、Ppdc-R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到土曲霉基因中的丙酮酸脫羧酶基因的pdc啟動子序列；

將所述土曲霉基因中的丙酮酸脫羧酶基因的pdc啟動子序列轉(zhuǎn)化至JM109中，擴(kuò)大培養(yǎng)，并提取質(zhì)粒；

將提取的質(zhì)粒與pUC19先后通過HindIII和Sse8387I分步酶切，得到有可互補(bǔ)的粘性末端的pdc啟動子序列和pUC19；

將所述有可互補(bǔ)的粘性末端的pdc啟動子序列和pUC19進(jìn)行重組，得到含有啟動子序列的重組載體；

按照上述步驟，依次將啟動子序列、終止子序列、紅色熒光蛋白基因?qū)胨鲋亟M載體中，獲得所述表達(dá)載體。

進(jìn)一步地，所述終止子序列導(dǎo)入所述重組載體的過程為：

以土曲霉基因組為模板，Tpdc-F、Tpdc-R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到土曲霉基因中的丙酮酸脫羧酶基因的pdc終止子序列；

將土曲霉基因中的丙酮酸脫羧酶基因的pdc終止子序列轉(zhuǎn)化至JM109中，擴(kuò)大培養(yǎng)，并提取質(zhì)粒。

將提取的質(zhì)粒與已插入了啟動子的pUC19先后通過KpnI和EcoRI分步酶切，得到有可互補(bǔ)的粘性末端的pdc終止子序列和酶切載體pUC19；

將上一步得到的所述有可互補(bǔ)的粘性末端的pdc終止子和酶切載體pUC19進(jìn)行重組，得到同時含有所述啟動子和終止子序列的重組載體。

進(jìn)一步地，所述紅色熒光蛋白基因?qū)胨鲋亟M載體的過程為：

以紅色熒光蛋白為模板，DsRed-F、DsRed-R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到所述紅色熒光蛋白基因序列；

將所述紅色熒光蛋白基因序列轉(zhuǎn)化至JM109中，擴(kuò)大培養(yǎng)，并提取質(zhì)粒；

將提取的質(zhì)粒與已插入啟動子、終止子序列的pUC19先后通過SalI和Sse8387I分步酶切，得到有可互補(bǔ)的粘性末端的紅色熒光蛋白基因序列和酶切載體pUC19；

將上一步得到的紅色熒光蛋白基因序列、酶切載體pUC19進(jìn)行重組，得到所述表達(dá)載體。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，有益效果在于：本發(fā)明實(shí)施例提供的適用于土曲霉的表達(dá)載體無需誘導(dǎo)，可穩(wěn)定表達(dá)；解決了其他表達(dá)載體在土曲霉中表達(dá)能力弱的問題，且能夠通過觀察紅色熒光來進(jìn)行土曲霉中信號通路的研究。在大腸桿菌中穩(wěn)定性復(fù)制和保持、便于DNA純化分離操作的特質(zhì)。

附圖說明

圖1是本發(fā)明實(shí)施例提供的適用于土曲霉的表達(dá)載體構(gòu)建示意圖；

圖2是本發(fā)明實(shí)施例1提供的表達(dá)載體的構(gòu)建示意圖；

圖3是本發(fā)明實(shí)施例3提供的重組的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至土曲霉后的表達(dá)結(jié)果示意圖。

具體實(shí)施方式

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實(shí)施例，對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

參見圖1，本發(fā)明實(shí)施例提供了一種適用于土曲霉的表達(dá)載體，所述表達(dá)載體由在pUC19的多克隆位點(diǎn)處插入土曲霉(Aspergillus terreus)基因中的丙酮酸脫羧酶基因(pyruvate decarboxylase，pdc，GeneID:4320296)的啟動子和終止子而獲得，所述表達(dá)載體的基因序列如SEQ ID NO.1所示，其中啟動子序列為SEQ ID NO.1中的第2241-2990位，終止子序列為SEQ ID NO.1中的第3721-4230位。

本發(fā)明實(shí)施例提供的適用于土曲霉的表達(dá)載體，無需誘導(dǎo)，可在土曲霉中穩(wěn)定表達(dá)；解決了其他表達(dá)載體在土曲霉中表達(dá)能力弱的問題。本表達(dá)載體存在原核生物基因質(zhì)粒的復(fù)制起始位點(diǎn)(原核生物基因質(zhì)粒的復(fù)制起始位點(diǎn)為SEQ ID NO.1中的第1232-1820位)，在大腸桿菌中可穩(wěn)定復(fù)制、保持，便于質(zhì)粒DNA的分離、純化；存在氨芐青霉素的抗性基因(氨芐青霉素抗性基因?yàn)镾EQ ID NO.1中的第201-1061位)，便于挑取存在本載體的大腸桿菌。本發(fā)明所提供的表達(dá)載體用以插入需研究的目的基因，待其轉(zhuǎn)化入土曲霉中，可表達(dá)生成融合蛋白。

所述啟動子和終止子之前插入有一段紅色熒光蛋白基因，所述紅色熒光蛋白基因的序列為SEQ ID NO.1中的第3034-3715位。通過觀察轉(zhuǎn)化子的紅色熒光，確定待研究的基因在土曲霉中的作用位置，從而研究該蛋白在土曲霉中的作用。

具體地，所述紅色熒光蛋白基因產(chǎn)生的紅色熒光有波長為500～560nm的綠光激發(fā)而得。

所述載體在所述啟動子序列與所述紅色熒光蛋白序列之間存在Sal I、Nru I兩個酶切位點(diǎn)，可雙酶切，以插入目的基因。所述載體在所述啟動子的序列的上游及所述終止子的序列的下游存在通用引物M13的結(jié)合位點(diǎn)，便于重組載體構(gòu)建過程中的測序驗(yàn)證。

所述載體主要用于土曲霉中基因的功能研究，亦可用于其他絲狀真菌的研究。通過Sal I、Nru I酶切或者反向PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，Polymerase Chain Reaction)的方法使載體線性化。目的基因通過相同酶切，使其帶有對應(yīng)的粘性末端。通過連接酶使目的基因重組到載體上，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，篩選后擴(kuò)大培養(yǎng)并提取重組質(zhì)粒。轉(zhuǎn)化入土曲霉或者其他絲狀真菌中，通過500～560nm波長的綠光激發(fā)，觀察目的基因所表達(dá)的肽鏈在土曲霉中的位置(肽鏈將會產(chǎn)生紅色熒光)，從而發(fā)現(xiàn)該基因表達(dá)的肽鏈在土曲霉中的位置，進(jìn)而研究其功能。

具體地，所述載體的全長為4631bp，GC含量為51.5％。

所述表達(dá)載體的基因序列如下：

GACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTA ACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTTCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAAGCTTGTACAGACAAGAAACGCGTCAGATTAGCGCTGGTTGGTTCGGTCGATGATATGACCAGGATGGAGCAGAGACGGTAGTTCTCCGATGGTCTGTGGACAATCGCAGGTGGTGATGCTCCGCGGGCGGAAGAATCGATAAATTGCAGAGGAGCAGCTGTCCCGTTTGGGACTAGGGCGGGGCCATCATCCCACCCCGGCACATTAAGGATGATTTTCATCCATGCCACCATGAGCTGACAGTCATCCGATGATCATGGATCCAATATACCAGTGGCTGGCCCCATTGCCTTTAAACCAGAAGGCTCTAGGCCCGTCGTATTGGATTCC AGACATCTGATCTGCGGGTAGCTGTGATGATCGGCCTACGTCTACAGGTTCGGTCTCACCACGGCTTCTATTCCGGCCGAATCACTACGGGCCGAAGTTCTACGGAGTACATAGGATGGTCTTATTCGGGATGTCTTATCGTGGTAGGTAATTATAGCAGTTGCTCCAATCGTACGGTGTATACGCATGGTAACTCCCGAAGTATCACCTTGTTGATGGGAGAAGACACTCACCGGGGCATGACATCACGGTGTCTCCATGACGTACAACACAACAGAAAGCCCCTCCGAAAGCAGTATTATGGCTGACTTGCTATATATTCTCTCACTCACTCCCCTTCTCATATTCCTTCTCACTCAGGGGCAACTTTCCATCTGACCCAAAATCTCATTCCCCTTTCCCAACTTATTTAGAAACCTCGTGATCGCGACTCCAGAGCTCTGTCTTCTTCCCACCTGCAGGTCGACATGGTGCGCTCCTCCAAGAACGTCATCAAGGAGTTCATGCGCTTCAAGGTGCGCATGGAGGGCACCGTGAACGGCCACGAGTTCGAGATCGAGGGCGAGGGCGAGGGCCGCCCCTACGAGGGCCACAACACCGTGAAGCTGAAGGTGACCAAGGGCGGCCCCCTGCCCTTCGCCTGGGACATCCTGTCCCCCCAGTTCCAGTACGGCTCCAAGGTGTACGTGAAGCACCCCGCCGACATCCCCGACTACAAGAAGCTGTCCTTCCCCGAGGGCTTCAAGTGGGAGCGCGTGATGAACTTCGAGGACGGCGGCGTGGTGACCGTGACCCAGGACTCCTCCCTGCAGGACGGCTGCTTCATCTACAAGGTGAAGTTCATCGGCGTGAACTTCCCCTCCGACGGCCCCGTAATGCAGAAGAAGACCATGGGCTGGGAGGCCTCCACCGAGCGCCTGTACCCCCGCGACGGCGTGCTGAAGGGCGAGATCCACAAGGCCCTGAAGCTGAAGGACGGCGGCCACTACCTGGTGGAGTTCAAGTCCATCTACATGGCCAAGAAGCCCGTGCAGCTGCCCGGCTACTACTACGTGGACTCCAAGCTGGACATCACCTCCCACAACGAGGACTACACCATCGTGGAGCAGTACGAGCGCACCGAGGGCCGCCACCACCTGTTCCTGTAGGGTACCTCGGCGGAATAGTGTCGGACCCCCGGTGTTTTAAGAATCTTTTTTCTCTCCTCCTGTTTGTCTATCTTAATATGAAACGGAACACGGCCAGGGTATACGCCCGCATTGTCATAGAAAACGTCTCAATCAGAACATCATGACCACCATGGAGTACAGCTAAAATGGAGCCGAGTTGAAAGCTCAGCATGAGCATGTTTACAGCTACTGATTAAAATTCATACGAGTTGATGCATCCTTCTCTTCGCGTAGTGAAATAAACATATATATATATATACCTTATGCAACTGGGTTGTAAAGTTCCGATAGGAGATACAGGGACCTGAAGCCTTTTATCGCTTGTCCCGAGAAGCTC ACCACGGCTTGAAGAGTATCGTGACGGCTTATTGTGATAGATCTTATATTAACTCTTCCTTTGTTTCAGTTTTGCCTCACCACTGCATATACACAGGGGTTGCTTGGCATCTTGGGTAAATTTACGATTATTTTCTCCAGACTGTATATTAATCCAGAGAATTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAAACGCGCGA。

本發(fā)明實(shí)施例提供的適用于土曲霉的表達(dá)載體，可使需要研究的基因在土曲霉中大量且穩(wěn)定的表達(dá)，并使其表達(dá)的肽鏈中存在一段紅色熒光蛋白，易于觀察研究基因的功能。重組載體構(gòu)建簡單且便于篩選、保存。

本發(fā)明實(shí)施例還提供了上述表達(dá)載體的制備方法，包括以下步驟：

以土曲霉基因組為模板，Ppdc-F、Ppdc-R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到土曲霉基因中的丙酮酸脫羧酶基因的pdc啟動子序列；

將所述土曲霉基因中的丙酮酸脫羧酶基因的pdc啟動子序列轉(zhuǎn)化至JM109(感受態(tài)細(xì)胞)中，擴(kuò)大培養(yǎng)，并提取質(zhì)粒；

將提取的質(zhì)粒與pUC19先后通過HindIII和Sse8387I分步酶切，得到有可互補(bǔ)的粘性末端的pdc啟動子序列和pUC19；

將所述有可互補(bǔ)的粘性末端的pdc啟動子序列和pUC19進(jìn)行重組，得到含有啟動子序列的重組載體；

按照上述步驟，依次將所述終止子序列、紅色熒光蛋白基因?qū)胨鲋亟M載體中，獲得所述表達(dá)載體。

所述制備方法具體包括以下步驟：

1、以土曲霉基因組為模板，Ppdc-F、Ppdc-R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到土曲霉基因中的丙酮酸脫羧酶基因的pdc啟動子序列(Ppdc-F、Ppdc-R、土曲霉基因組各1μl，Premix Taq 10μl、ddH₂O 7μl；92℃變性，55℃退火，72℃延伸，35循環(huán))；

2、將上述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物使用omega膠回收試劑盒進(jìn)行回收，得到濃度約為50ng/μl的CRE溶液；

3、將pdc啟動子溶液、pMD-19、DNA Ligation Kit溶液I以4:1:5的比例混勻，于16℃反應(yīng)30min；

4、熱激法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至JM109中，擴(kuò)大培養(yǎng)，并提取質(zhì)粒；

5、提取的質(zhì)粒與pUC19先后通過HindIII和Sse8387I分步酶切，得到有可互補(bǔ)的粘性末端的pdc啟動子序列和pUC19；

6、將第5步得到的pdc啟動子、pUC19和DNA Ligation Kit溶液I以4:1:5的比例混勻，于16℃反應(yīng)30min。重復(fù)第4步，得到重組的表達(dá)載體。

pdc終止子及紅色熒光蛋白序列的插入同以上一步驟，使用引物和酶切位點(diǎn)見表1。

表格1 pUC-PR載體構(gòu)建所用引物及酶切位點(diǎn)

具體地，所述終止子序列導(dǎo)入所述重組載體的過程為：

以土曲霉基因組為模板，Tpdc-F、Tpdc-R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到土曲霉基因中的丙酮酸脫羧酶基因的pdc終止子序列；

將土曲霉基因中的丙酮酸脫羧酶基因的pdc終止子序列轉(zhuǎn)化至JM109中，擴(kuò)大培養(yǎng)，并提取質(zhì)粒；

將提取的質(zhì)粒與已插入了啟動子的pUC19先后通過KpnI和EcoRI分步酶切，得到有可互補(bǔ)的粘性末端的pdc終止子序列和酶切載體pUC19；

將上一步得到的所述有可互補(bǔ)的粘性末端的pdc終止子和酶切載體pUC19進(jìn)行重組，得到同時含有所述啟動子和終止子序列的重組載體。

上述過程具體為：

1、以土曲霉基因組為模板，Tpdc-F、Tpdc-R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到土曲霉中的丙酮酸脫羧酶基因的pdc終止子序列(Tpdc-F、Tpdc-R、土曲霉基因組各1μl，Premix Taq 10μl、ddH₂O 7μl；92℃變性，55℃退火，72℃延伸，35循環(huán))；

2、將上述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物使用omega膠回收試劑盒進(jìn)行回收，得到濃度約為50ng/μl的CRE溶液；

3、將pdc終止子溶液、pMD-19、DNA Ligation Kit溶液I以4:1:5的比例混勻，于16℃反應(yīng)30min；

4、熱激法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至JM109中，擴(kuò)大培養(yǎng)，并提取質(zhì)粒；

5、提取的質(zhì)粒與已插入了啟動子的pUC19先后通過KpnI和EcoRI分步酶切，得到有可互補(bǔ)的粘性末端的pdc終止子序列和pUC19；

6、將第5步得到的pdc終止子、上一步的酶切載體和DNA Ligation Kit溶液I以4:1:5的比例混勻，于16℃反應(yīng)30min；重復(fù)第4步，得到重組的表達(dá)載體。

具體地，所述紅色熒光蛋白基因?qū)胨鲋亟M載體的過程為：

以紅色熒光蛋白為模板，DsRed-F、DsRed-R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到所述紅色熒光蛋白基因序列；

將所述紅色熒光蛋白基因序列轉(zhuǎn)化至JM109中，擴(kuò)大培養(yǎng)，并提取質(zhì)粒；

將提取的質(zhì)粒與已插入啟動子、終止子序列的pUC19先后通過SalI和Sse8387I分步酶切，得到有可互補(bǔ)的粘性末端的紅色熒光蛋白基因序列和酶切載體pUC19；

將上一步得到的紅色熒光蛋白基因序列、酶切載體pUC19進(jìn)行重組，得到所述表達(dá)載體。

上述過程具體為：

1、以紅色熒光蛋白為模板，DsRed-F、DsRed-R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到所述紅色熒光蛋白基因序列(DsRed-F、DsRed-R、土曲霉基因組各1μl，Premix Taq 10μl、ddH₂O 7μl；92℃變性，55℃退火，72℃延伸，35循環(huán))；

2、將上述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物使用omega膠回收試劑盒進(jìn)行回收，得到濃度約為50ng/μl的CRE溶液；

3、將所述CRE溶液、pMD-19、DNA Ligation Kit溶液I以4:1:5的比例混勻，于16℃反應(yīng)30min；

4、熱激法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至JM109中，擴(kuò)大培養(yǎng)，并提取質(zhì)粒；

5、提取的質(zhì)粒與已插入啟動子、終止子序列的pUC19先后通過SalI和Sse8387I分步酶切，得到有可互補(bǔ)的粘性末端的紅色熒光蛋白基因序列和pUC19；

6、將第5步得到的紅色熒光蛋白基因序列、酶切載體和DNA Ligation Kit溶液I以4:1:5的比例混勻，于16℃反應(yīng)30min；重復(fù)第4步，得到所述表達(dá)載體。

本發(fā)明實(shí)施例提供的上述所述的適用于土曲霉的表達(dá)載體的制備方法，可以輕松獲得本發(fā)明實(shí)施例提供的適用于土曲霉的表達(dá)載體，由此獲得相應(yīng)的功能。

本發(fā)明實(shí)施例還提供了一種將上述所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至土曲霉的方法，包括以下步驟：

以目的基因引物序列為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到目的基因序列；

將所述目的基因序列轉(zhuǎn)化至JM109中，擴(kuò)大培養(yǎng)，并提取質(zhì)粒；

將提取的質(zhì)粒與土曲霉基因先后通過SalI和NruI分步酶切，得到有可互補(bǔ)粘性末端的目的基因序列和pUC-PR；

將有可互補(bǔ)粘性末端的目的基因序列和pUC-PR進(jìn)行重組。

以下結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行詳細(xì)說明。

實(shí)施例1將土曲霉cre基因插入到該表達(dá)載體中

材料：CRE-F(10μM/L)，CRE-R(10μM/L)，DNA聚合酶(Premix Taq，購自takara)，土曲霉基因組溶液(約200ng/μL)，核酸內(nèi)切酶(NruI、SalI，購自takara)，T載體(pMD19，購自takara)，DNA連接酶(DNA Ligation Kit，購自takara)，大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞JM109，omega膠回收試劑盒，omega質(zhì)粒小提試劑盒。

過程如下：

1、以土曲霉基因組為模板，CRE-F、CRE-R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到土曲霉CRE基因序列(CRE-F、CRE-R、土曲霉基因組各1μl，Premix Taq 10μl、ddH₂O 7μl；92℃變性，55℃退火，72℃延伸，35循環(huán))

2、將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物使用omega膠回收試劑盒進(jìn)行回收，得到濃度約為50ng/μl的CRE溶液。

3、將CRE溶液、pMD-19、DNA Ligation Kit溶液I以4:1:5的比例混勻，于16℃反應(yīng)30min。

4、熱激法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至JM109中，擴(kuò)大培養(yǎng)，并提取質(zhì)粒。

5、提取的質(zhì)粒與本載體先后通過SalI和NruI分步酶切，得到有可互補(bǔ)的粘性末端的CRE基因序列和pUC-PR。

6、將第5步得到的CRE基因、pUC-PR和DNA Ligation Kit溶液I以4:1:5的比例混勻，于16℃反應(yīng)30min。重復(fù)第4步，得到重組的表達(dá)載體(見附圖2)。

附：CRE-F引物序列：5’-GTCGACATGCCGCCACCAGCCTCTGC-3’；

CRE-R引物序列：5’-TCGCGATCACTGGCACCCAGAGGCCG-3’。

實(shí)施例2重組載體轉(zhuǎn)化至土曲霉

材料：土曲霉孢子培養(yǎng)基：葡萄糖20g/L、麥芽汁10g/L。蛋白胨1g/L、吐溫80 2g/L。

STC溶液：山梨醇109.3g，1M Tris·HCL溶液5mL，1M CaCl₂溶液25mL，去離子水定容至500mL，121℃高壓滅菌20min。

1M MgSO4溶液：硫酸鎂60g，用去離子水定容至500mL，121℃高壓滅菌20min。

60％PEG4000溶液：1M氯化鈣溶液1mL，1M Tris·HCL溶液200μl。

1、取約10⁸個孢子接種于50mL孢子培養(yǎng)基中，于250mL錐形瓶中28℃，250r/min，培養(yǎng)8小時。

2、將培養(yǎng)液于50mL離心管中5000rpm離心10min，去上清液。

3、加入20mL的1M MgSO4溶液，并吹打均勻，5000rpm離心10min，取上清液。

4、重復(fù)上一步。

5、加入10mL溶壁酶(2g溶壁酶溶解于10mL 1M MgSO4溶液中)，并吹打均勻，于250mL的錐形瓶中28℃，80r/min培養(yǎng)12h。

6、取培養(yǎng)液于50mL離心管中，加入20mL的STC，輕柔吹打均勻，于4℃，5000rpm離心10min，去上清。

7、加入30mL的STC，輕柔吹打均勻，再次離心。

8、棄上清液，加入700μl的STC，輕柔吹打均勻，取200μl加入已滅菌的1.5mL的離心管中。

9、加入質(zhì)粒Ppdc-DsRed-Tpdc和pAN7-1各1μg后，于冰上靜置30min。

10、48℃熱激2min后，加入5μl 60％的PEG4000，混勻后靜置20min。

11、將溶液轉(zhuǎn)移至50mL離心管中，加入2mL 60％的PEG4000，混勻后靜置5min。

12、加入30mL的STC，4℃，5000rpm離心10min，去上清液。

13、吹打均勻后加入10mL原生質(zhì)體再生培養(yǎng)基(5mL的2倍濃度STC，1mL的10倍濃度葡萄糖，4mL的2.5倍濃度基本培養(yǎng)基)。于250mL的錐形瓶張紅，28℃，70r/min培養(yǎng)12小時。

14、培養(yǎng)液加入20mL的STC溶液于50mL的離心管中，5000rpm離心10min。

15、加入1mL的STC溶液，吹打均勻，取200μl涂布于土曲霉抗性平板上，28℃培養(yǎng)2～3d后挑取單菌落，于土曲霉抗性平板再次篩選。

16、培養(yǎng)2～3d后挑取單菌落于土曲霉平板28℃培養(yǎng)7天后，用無菌水洗脫孢子保存。

實(shí)施例3重組的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至土曲霉后觀察

參見圖3，其中，A為用可見光觀察轉(zhuǎn)化子，可見光下找到菌絲，作為實(shí)驗(yàn)組；B為可見光觀察未轉(zhuǎn)化土曲霉，可見光下找到菌絲，作為陰性對照；C為用綠光激發(fā)轉(zhuǎn)化子，可觀察到整個菌絲體表達(dá)紅色熒光；D為用綠光激發(fā)未轉(zhuǎn)化土曲霉，整個視野無法觀察到紅色熒光。從圖3中可以看出：圖B和D作為陰性對照說明土曲霉本身在綠光激發(fā)下不能被激發(fā)紅光；圖A和C作為實(shí)驗(yàn)組經(jīng)pUC-PR-CRE轉(zhuǎn)化入土曲霉中，土曲霉在綠光激發(fā)下激發(fā)紅光，并在土曲霉菌絲體各個部位表達(dá)。由圖3可得出結(jié)論，土曲霉基因CRE編碼的表達(dá)產(chǎn)物可在土曲霉整個菌絲體中進(jìn)行表達(dá)，pUC-PR可通過觀察紅色熒光來進(jìn)行土曲霉中信號通路研究。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

SEQUENCE LISTING

<110> 深圳大學(xué)

<120> 一種適用于土曲霉的表達(dá)載體及其制備方法

<130> 9

<160> 9

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 4631

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> 適用于土曲霉的表達(dá)載體的基因序列

<400> 1

gacgaaaggg cctcgtgata cgcctatttt tataggttaa tgtcatgata ataatggttt 60

cttagacgtc aggtggcact tttcggggaa atgtgcgcgg aacccctatt tgtttatttt 120

tctaaataca ttcaaatatg tatccgctca tgagacaata accctgataa atgcttcaat 180

aatattgaaa aaggaagagt atgagtattc aacatttccg tgtcgccctt attccctttt 240

ttgcggcatt ttgccttcct gtttttgctc acccagaaac gctggtgaaa gtaaaagatg 300

ctgaagatca gttgggtgca cgagtgggtt acatcgaact ggatctcaac agcggtaaga 360

tccttgagag ttttcgcccc gaagaacgtt ttccaatgat gagcactttt aaagttctgc 420

tatgtggcgc ggtattatcc cgtattgacg ccgggcaaga gcaactcggt cgccgcatac 480

actattctca gaatgacttg gttgagtact caccagtcac agaaaagcat cttacggatg 540

gcatgacagt aagagaatta tgcagtgctg ccataaccat gagtgataac actgcggcca 600

acttacttct gacaacgatc ggaggaccga aggagctaac cgcttttttg cacaacatgg 660

gggatcatgt aactcgcctt gatcgttggg aaccggagct gaatgaagcc ataccaaacg 720

acgagcgtga caccacgatg cctgtagcaa tggcaacaac gttgcgcaaa ctattaactg 780

gcgaactact tactctagct tcccggcaac aattaataga ctggatggag gcggataaag 840

ttgcaggacc acttctgcgc tcggcccttc cggctggctg gtttattgct gataaatctg 900

gagccggtga gcgtgggtct cgcggtatca ttgcagcact ggggccagat ggtaagccct 960

cccgtatcgt agttatctac acgacgggga gtcaggcaac tatggatgaa cgaaatagac 1020

agatcgctga gataggtgcc tcactgatta agcattggta actgtcagac caagtttact 1080

catatatact ttagattgat ttaaaacttc atttttaatt taaaaggatc taggtgaaga 1140

tcctttttga taatctcatg accaaaatcc cttaacgtga gttttcgttc cactgagcgt 1200

cagaccccgt agaaaagatc aaaggatctt cttgagatcc tttttttctg cgcgtaatct 1260

gctgcttgca aacaaaaaaa ccaccgctac cagcggtggt ttgtttgccg gatcaagagc 1320

taccaactct ttttccgaag gtaactggct tcagcagagc gcagatacca aatactgttc 1380

ttctagtgta gccgtagtta ggccaccact tcaagaactc tgtagcaccg cctacatacc 1440

tcgctctgct aatcctgtta ccagtggctg ctgccagtgg cgataagtcg tgtcttaccg 1500

ggttggactc aagacgatag ttaccggata aggcgcagcg gtcgggctga acggggggtt 1560

cgtgcacaca gcccagcttg gagcgaacga cctacaccga actgagatac ctacagcgtg 1620

agctatgaga aagcgccacg cttcccgaag ggagaaaggc ggacaggtat ccggtaagcg 1680

gcagggtcgg aacaggagag cgcacgaggg agcttccagg gggaaacgcc tggtatcttt 1740

atagtcctgt cgggtttcgc cacctctgac ttgagcgtcg atttttgtga tgctcgtcag 1800

gggggcggag cctatggaaa aacgccagca acgcggcctt tttacggttc ctggcctttt 1860

gctggccttt tgctcacatg ttctttcctg cgttatcccc tgattctgtg gataaccgta 1920

ttaccgcctt tgagtgagct gataccgctc gccgcagccg aacgaccgag cgcagcgagt 1980

cagtgagcga ggaagcggaa gagcgcccaa tacgcaaacc gcctctcccc gcgcgttggc 2040

cgattcatta atgcagctgg cacgacaggt ttcccgactg gaaagcgggc agtgagcgca 2100

acgcaattaa tgtgagttag ctcactcatt aggcacccca ggctttacac tttatgcttc 2160

cggctcgtat gttgtgtgga attgtgagcg gataacaatt tcacacagga aacagctatg 2220

accatgatta cgccaagctt gtacagacaa gaaacgcgtc agattagcgc tggttggttc 2280

ggtcgatgat atgaccagga tggagcagag acggtagttc tccgatggtc tgtggacaat 2340

cgcaggtggt gatgctccgc gggcggaaga atcgataaat tgcagaggag cagctgtccc 2400

gtttgggact agggcggggc catcatccca ccccggcaca ttaaggatga ttttcatcca 2460

tgccaccatg agctgacagt catccgatga tcatggatcc aatataccag tggctggccc 2520

cattgccttt aaaccagaag gctctaggcc cgtcgtattg gattccagac atctgatctg 2580

cgggtagctg tgatgatcgg cctacgtcta caggttcggt ctcaccacgg cttctattcc 2640

ggccgaatca ctacgggccg aagttctacg gagtacatag gatggtctta ttcgggatgt 2700

cttatcgtgg taggtaatta tagcagttgc tccaatcgta cggtgtatac gcatggtaac 2760

tcccgaagta tcaccttgtt gatgggagaa gacactcacc ggggcatgac atcacggtgt 2820

ctccatgacg tacaacacaa cagaaagccc ctccgaaagc agtattatgg ctgacttgct 2880

atatattctc tcactcactc cccttctcat attccttctc actcaggggc aactttccat 2940

ctgacccaaa atctcattcc cctttcccaa cttatttaga aacctcgtga tcgcgactcc 3000

agagctctgt cttcttccca cctgcaggtc gacatggtgc gctcctccaa gaacgtcatc 3060

aaggagttca tgcgcttcaa ggtgcgcatg gagggcaccg tgaacggcca cgagttcgag 3120

atcgagggcg agggcgaggg ccgcccctac gagggccaca acaccgtgaa gctgaaggtg 3180

accaagggcg gccccctgcc cttcgcctgg gacatcctgt ccccccagtt ccagtacggc 3240

tccaaggtgt acgtgaagca ccccgccgac atccccgact acaagaagct gtccttcccc 3300

gagggcttca agtgggagcg cgtgatgaac ttcgaggacg gcggcgtggt gaccgtgacc 3360

caggactcct ccctgcagga cggctgcttc atctacaagg tgaagttcat cggcgtgaac 3420

ttcccctccg acggccccgt aatgcagaag aagaccatgg gctgggaggc ctccaccgag 3480

cgcctgtacc cccgcgacgg cgtgctgaag ggcgagatcc acaaggccct gaagctgaag 3540

gacggcggcc actacctggt ggagttcaag tccatctaca tggccaagaa gcccgtgcag 3600

ctgcccggct actactacgt ggactccaag ctggacatca cctcccacaa cgaggactac 3660

accatcgtgg agcagtacga gcgcaccgag ggccgccacc acctgttcct gtagggtacc 3720

tcggcggaat agtgtcggac ccccggtgtt ttaagaatct tttttctctc ctcctgtttg 3780

tctatcttaa tatgaaacgg aacacggcca gggtatacgc ccgcattgtc atagaaaacg 3840

tctcaatcag aacatcatga ccaccatgga gtacagctaa aatggagccg agttgaaagc 3900

tcagcatgag catgtttaca gctactgatt aaaattcata cgagttgatg catccttctc 3960

ttcgcgtagt gaaataaaca tatatatata tataccttat gcaactgggt tgtaaagttc 4020

cgataggaga tacagggacc tgaagccttt tatcgcttgt cccgagaagc tcaccacggc 4080

ttgaagagta tcgtgacggc ttattgtgat agatcttata ttaactcttc ctttgtttca 4140

gttttgcctc accactgcat atacacaggg gttgcttggc atcttgggta aatttacgat 4200

tattttctcc agactgtata ttaatccaga gaattcactg gccgtcgttt tacaacgtcg 4260

tgactgggaa aaccctggcg ttacccaact taatcgcctt gcagcacatc cccctttcgc 4320

cagctggcgt aatagcgaag aggcccgcac cgatcgccct tcccaacagt tgcgcagcct 4380

gaatggcgaa tggcgcctga tgcggtattt tctccttacg catctgtgcg gtatttcaca 4440

ccgcatatgg tgcactctca gtacaatctg ctctgatgcc gcatagttaa gccagccccg 4500

acacccgcca acacccgctg acgcgccctg acgggcttgt ctgctcccgg catccgctta 4560

cagacaagct gtgaccgtct ccgggagctg catgtgtcag aggttttcac cgtcatcacc 4620

gaaacgcgcg a 4631

<210> 2

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> Ppdc-F引物序列

<400> 2

aagcttgtac agacaagaaa cgcgtca 27

<210> 3

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> Ppdc-R引物序列

<400> 3

cctgcaggtg ggaagaagac agagctctg 29

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> Tpdc-F引物序列

<400> 4

ggtacctcgg cggaatagtg tcg 23

<210> 5

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> Tpdc-R引物序列

<400> 5

gaattctctg gattaatata cagtctggag aaa 33

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> DsRed-F引物序列

<400> 6

gtcgacatgg tgcgctcctc c 21

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> DsRed-R引物序列

<400> 7

ggtaccctac aggaacaggt ggtgg 25

<210> 8

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> CRE-F引物序列

<400> 8

gtcgacatgc cgccaccagc ctctgc 26

<210> 9

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> CRE-R引物序列

<400> 9

tcgcgatcac tggcacccag aggccg 26