本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及一種快速鑒定光皮梾木種群的分子檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：

光皮梾木(cornuswilsonianawanger)又名光皮樹(shù)、油樹(shù)、狗骨木、斑皮抽水樹(shù)等，屬山茱萸科梾木屬，是我國(guó)特有的多用途鄉(xiāng)土木本油料樹(shù)種。光皮梾木果油作為食用油已有100年歷史,1981年經(jīng)國(guó)家糧食部鑒定，光皮梾木油為一級(jí)食用油；2013年12月，國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)批準(zhǔn)光皮梾木果實(shí)油為我國(guó)的新食品原料。動(dòng)物和臨床試驗(yàn)結(jié)果表明光皮梾木油可顯著降低體內(nèi)膽固醇，防治高血脂癥，尤其是老年高血脂癥，同時(shí)具有減肥功效。光皮梾木是一種兼有經(jīng)濟(jì)、生態(tài)和社會(huì)效益的重要油料樹(shù)種。

但是，一般從表型特征很難區(qū)分光皮梾木的種群，尤其是在上個(gè)世紀(jì)70-80年代，曾經(jīng)在一定的區(qū)域內(nèi)進(jìn)行過(guò)人為的廣泛傳播，對(duì)于收集、選擇和建立基因庫(kù)帶來(lái)一定的難度。因此，急需解決判定種群起源的準(zhǔn)確方法，為開(kāi)展光皮梾木的育種提供必要的技術(shù)支持。

植物的基因組具有很好的穩(wěn)定性，基本上不受環(huán)境影響，且取材方便。因此，通過(guò)對(duì)植株在基因組差異性的檢測(cè)來(lái)追蹤其起源是完全可行的。

dna分子標(biāo)記是快速鑒定生物基因組差異的重要方法之一，其中微衛(wèi)星標(biāo)記具有多態(tài)性高、穩(wěn)定性好、操作便捷等諸多優(yōu)點(diǎn)，通過(guò)對(duì)目標(biāo)植物種群進(jìn)行微衛(wèi)星標(biāo)記的檢測(cè)，不僅可以區(qū)分在性狀上存在明顯差異的個(gè)體，而且能夠有效判別種群水平上的相似性。

目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)對(duì)光皮梾木種群分子快速鑒定的相關(guān)報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明提供了一種非破壞性取樣下快速鑒定光皮梾木種群的分子檢測(cè)方法及其引物對(duì)，該鑒定方法準(zhǔn)確、省時(shí)、省力。

為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采取了以下技術(shù)方案：

一種快速鑒定光皮梾木種群的分子檢測(cè)方法，包括以下步驟：

(1)、以光皮梾木的dna為模板，分別以seqidno:1～2、seqidno:3～4、seqidno:5～6、seqidno:7～8、seqidno:9～10、seqidno:11～12、seqidno:13～14、seqidno:15～16、seqidno:17～18、seqidno:19～20、seqidno:21～22、seqidno:23～24、seqidno:25～26、seqidno:27～28、以及seqidno:29～30作為引物對(duì)，進(jìn)行pcr擴(kuò)增，獲得微衛(wèi)星分子標(biāo)記數(shù)據(jù)；

(2)、對(duì)上述微衛(wèi)星分子標(biāo)記數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，鑒定歸類光皮梾木種群。

在其中一些實(shí)施例中，步驟(1)中所述pcr擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)椋?/p>

步驟s1，94℃下預(yù)變性5min；

步驟s2，94℃下變性30s；

步驟s3，57℃下退火30s；

步驟s4，72℃下延伸20s；

步驟s5，將所述步驟s2至所述步驟s4重復(fù)35次，且最后一次的所述步驟s4持續(xù)10min。

在其中一些實(shí)施例中，步驟(1)中所述pcr擴(kuò)增的反應(yīng)體系為：dna模板1.0μl、引物對(duì)0.2μl、mix10μl，加ddh2o至20μl。

本發(fā)明還提供了快速鑒定光皮梾木種群的引物對(duì)，采取了以下技術(shù)方案：

一種快速鑒定光皮梾木種群的引物對(duì)，所述引物對(duì)包括seqidno:1～2、seqidno:3～4、seqidno:5～6、seqidno:7～8、seqidno:9～10、seqidno:11～12、seqidno:13～14、seqidno:15～16、seqidno:17～18、seqidno:19～20、seqidno:21～22、seqidno:23～24、seqidno:25～26、seqidno:27～28、以及seqidno:29～30。

本發(fā)明通過(guò)對(duì)目標(biāo)參試植株進(jìn)行dna提取，根據(jù)光皮梾木15個(gè)穩(wěn)定性好、多態(tài)性強(qiáng)的微衛(wèi)星標(biāo)記引物對(duì)進(jìn)行dna擴(kuò)增，獲得分子標(biāo)記數(shù)據(jù)后，采用統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)分子數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，從而對(duì)光皮梾木種群進(jìn)行歸類。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

1、本發(fā)明的快速鑒定光皮梾木種群的分子檢測(cè)方法在非破壞性取樣的前提下快速獲得基因組信息，工作量少且效率高，同時(shí)判別準(zhǔn)確率高達(dá)95％，具有準(zhǔn)確、省時(shí)和省力的優(yōu)勢(shì)；

2、本發(fā)明的快速鑒定光皮梾木種群的分子檢測(cè)方法對(duì)于物種種群的快速分子檢測(cè)具有重要價(jià)值和應(yīng)用前景。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明快速鑒定光皮梾木種群的分子檢測(cè)方法的流程圖；

圖2為本發(fā)明實(shí)施例1中20個(gè)光皮梾木植株種群判別二維圖，其中l(wèi)c：廣東樂(lè)昌種群；jx：江西贛州種群。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例進(jìn)一步敘述本發(fā)明，本發(fā)明未述及之處適用于現(xiàn)有技術(shù)。下面給出本發(fā)明的具體實(shí)施例，但實(shí)施例僅是為了進(jìn)一步詳細(xì)敘述本發(fā)明，并不限制本發(fā)明的權(quán)利要求。

實(shí)施例1一種快速鑒定光皮梾木種群的分子檢測(cè)方法

請(qǐng)參閱圖1，為一種快速鑒定光皮梾木種群的分子檢測(cè)方法的流程圖，檢測(cè)方法包括以下步驟：

(1)、按本領(lǐng)域常規(guī)方法對(duì)來(lái)自江西和廣東2個(gè)種群共20個(gè)光皮梾木植株的葉片樣品進(jìn)行dna提取；

(2)、分別以步驟(1)提取的dna為模板，分別以seqidno:1～2、seqidno:3～4、seqidno:5～6、seqidno:7～8、seqidno:9～10、seqidno:11～12、seqidno:13～14、seqidno:15～16、seqidno:17～18、seqidno:19～20、seqidno:21～22、seqidno:23～24、seqidno:25～26、seqidno:27～28、以及seqidno:29～30作為引物對(duì)，分別進(jìn)行pcr擴(kuò)增，獲得微衛(wèi)星分子標(biāo)記數(shù)據(jù)；

其中，引物對(duì)的序列如下：

每個(gè)pcr擴(kuò)增的反應(yīng)體系(20μl)為：

pcr擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)椋?/p>

步驟s1，將所述全基因組dna依次在94℃下預(yù)變性5min；

步驟s2，將預(yù)變性產(chǎn)物在94℃下變性30s，得到變性產(chǎn)物；

步驟s3，將所述變性產(chǎn)物在57℃下退火30s，得到退火產(chǎn)物；

步驟s4，將所述退火產(chǎn)物在72℃下延伸20s；

步驟s5，將所述步驟s2至所述步驟s4重復(fù)35次，且最后一次的所述步驟s4持續(xù)10min。

(3)、統(tǒng)計(jì)分析鑒定歸類光皮梾木種群。

采用非商業(yè)化genalex6.503軟件對(duì)上述微衛(wèi)星分子標(biāo)記數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，統(tǒng)計(jì)分析的基本運(yùn)算原理：根據(jù)同類性質(zhì)的基因組信息(本實(shí)施例中為微衛(wèi)星標(biāo)記的dna片段大小)具有相似性的原理，也就是植株的相似度越高，標(biāo)記的相似性就大，軟件根據(jù)每個(gè)植株的微衛(wèi)星標(biāo)記的特征，計(jì)算出植株與植株之間在標(biāo)記信息上的相似度，根據(jù)相似度的大小進(jìn)行歸類；得到植株的種群判別與歸類。

江西和廣東2個(gè)種群共20個(gè)植株葉片樣品的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果如圖2所示，結(jié)果表明，20個(gè)植株中7株來(lái)自廣東種群，13株來(lái)自江西種群。

以上所述實(shí)施例的各技術(shù)特征可以進(jìn)行任意的組合，為使描述簡(jiǎn)潔，未對(duì)上述實(shí)施例中的各個(gè)技術(shù)特征所有可能的組合都進(jìn)行描述，然而，只要這些技術(shù)特征的組合不存在矛盾，都應(yīng)當(dāng)認(rèn)為是本說(shuō)明書(shū)記載的范圍。

以上所述實(shí)施例僅表達(dá)了本發(fā)明的幾種實(shí)施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能因此而理解為對(duì)發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。因此，本發(fā)明專利的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。

序列表

＜110＞廣東省林業(yè)科學(xué)研究院

＜120＞快速鑒定光皮梾木種群的分子檢測(cè)方法

＜130＞30

＜170＞patentinversion3.1

＜210＞1

＜211＞22

＜212＞dna

＜213＞人工序列

＜400＞1

catcgattaaggcagataagaa22

＜210＞2

＜211＞22

＜212＞dna

＜213＞人工序列

＜400＞2

tcaaatttcagagtctccacaa22

＜210＞3

＜211＞22

＜212＞dna

＜213＞人工序列

＜400＞3

gtggtggtgattaggaagctat22

＜210＞4

＜211＞22

＜212＞dna

＜213＞人工序列

＜400＞4

gtgacactggaatgaagagaga22

＜210＞5

＜211＞22

＜212＞dna

＜213＞人工序列

＜400＞5

aacgaaattgaaaccctagaaa22

＜210＞6

＜211＞22

＜212＞dna

＜213＞人工序列

＜400＞6

cagagacaaaattcaaaaagca22

＜210＞7

＜211＞22

＜212＞dna

＜213＞人工序列

＜400＞7

atggctatgatccaagttcttt22

＜210＞8

＜211＞22

＜212＞dna

＜213＞人工序列

＜400＞8

tcaaactgatcataaaacaggc22

＜210＞9

＜211＞22

＜212＞dna

＜213＞人工序列

＜400＞9

ggcggaagaactctatctttgt22

＜210＞10

＜211＞22

＜212＞dna

＜213＞人工序列

＜400＞19

tcagaacaacgtacgtacaaca22

＜210＞11

＜211＞22

＜212＞dna

＜213＞人工序列

＜400＞11

ggggtttatgttcttcagtagc22

＜210＞12

＜211＞22

＜212＞dna

＜213＞人工序列

＜400＞12

taccaccatcaatttctaaccc22

＜210＞13

＜211＞22

＜212＞dna

＜213＞人工序列

＜400＞13

tgtttcaagttaaggtcgattg22

＜210＞14

＜211＞22

＜212＞dna

＜213＞人工序列

＜400＞14

cttcaggtagaagtacccaagg22

＜210＞15

＜211＞22

＜212＞dna

＜213＞人工序列

＜400＞15

taaacaaaactgctgctgctat22

＜210＞16

＜211＞22

＜212＞dna

＜213＞人工序列

＜400＞16

agtccagaataaaaccactgct22

＜210＞17

＜211＞22

＜212＞dna

＜213＞人工序列

＜400＞17

caggctggtgtaactcataaaa22

＜210＞18

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＜212＞dna

＜213＞人工序列

＜400＞18

cactctcactacattgccctaa22

＜210＞19

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＜213＞人工序列

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agaagtattcctgtcctcatgc22

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＜212＞dna

＜213＞人工序列

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aacccaagtaaacagaggaaac22

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＜213＞人工序列

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ataatggctaacctacccaaga22

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＜212＞dna

＜213＞人工序列

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cggtttgtaatagcactccac21

＜210＞23

＜211＞22

＜212＞dna

＜213＞人工序列

＜400＞23

ctgggacttcacacaagtagaa22

＜210＞24

＜211＞22

＜212＞dna

＜213＞人工序列

＜400＞24

aggtagagcattctggttccta22

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＜212＞dna

＜213＞人工序列

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gatgatgacgattgattgagg21

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＜210＞27

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＜212＞dna

＜213＞人工序列

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＜210＞29

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＜212＞dna

＜213＞人工序列

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acaagcacgggcttatttatac22

＜210＞30

＜211＞22

＜212＞dna

＜213＞人工序列

＜400＞30

gttttcacagtgatcaaacgac22