本發(fā)明涉及生物技術和醫(yī)學領域，具體地說，是一種長鏈非編碼rna——lnc-smad3作為初始狀cd4⁺t細胞和/或其分化而成的調節(jié)性t細胞的鑒別、成熟狀態(tài)和/或功能確定的新型特異性生物標志物中的用途和應用方法。

背景技術：

哺乳動物基因組可轉錄多種長非編碼rna(longnoncodingrna，lncrna)，然而其中僅有少數lncrna的序列和功能被明確。近年來，lncrna在生命生理過程以及疾病進程中的作用不斷受到關注，但是關于lncrna與免疫系統(tǒng)之間的研究并不多，尤其是lncrna在調節(jié)性t細胞參與的免疫穩(wěn)態(tài)維持中的報道幾乎空白。

調節(jié)性t細胞是免疫穩(wěn)態(tài)中重要的調控細胞，它可以從初始狀cd4⁺t細胞分化而來。調節(jié)性t細胞可以通過抑制效應性t細胞的活化和增殖，負向調控過激的免疫應答，控制炎癥反應，維持機體的免疫穩(wěn)態(tài)。調節(jié)性t細胞的成熟和功能狀態(tài)決定了免疫應答的走向和強度，因此在眾多免疫相關疾病如感染，炎癥，自身免疫性疾病，腫瘤的發(fā)生發(fā)展和干預治療中發(fā)揮著重要作用。

過去的研究已證實多種轉錄因子和細胞因子等(如foxp3、tgf-β)在初始狀cd4⁺t細胞往調節(jié)性t細胞的分化發(fā)育中發(fā)揮著重要作用，也確定了很多與調節(jié)性t細胞成熟和功能相關的蛋白分子(如cd25、ctla4、gitr等)。然而，若要確定由初始狀cd4⁺t細胞分化而來的調節(jié)性t細胞的功能和成熟狀態(tài)，則需要聯合檢查數個標志物，如聯合檢測到cd25⁺foxp3⁺，才能確定其已轉化為調節(jié)性t細胞并確定其功能和成熟狀態(tài)。

為方便臨床和科研應用，本領域中迫切需要研究和開發(fā)出針對初始狀cd4⁺t細胞和/或其分化而成的調節(jié)性t細胞的鑒別、成熟和功能的特異性表達生物標志物。

技術實現要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種鑒別初始狀cd4⁺t細胞和/或其分化而成的調節(jié)性t細胞的生物標志物：lnc-smad3及其雜交或同源序列。本發(fā)明的另一目的在于提供檢測lnc-smad3及其雜交或同源序列的試劑在制備鑒別初始狀cd4⁺t細胞和/或其分化而成的調節(jié)性t細胞的試劑盒中的應用。本發(fā)明的第三個目的在于提供一種鑒別初始狀cd4⁺t細胞和/或其分化而成的調節(jié)性t細胞的方法和試劑盒。

本發(fā)明從小鼠smad3的基因位點附近篩選出了由初始狀cd4⁺t細胞特異性表達的長鏈非編碼rna(longnoncodingrna，lncrna)分子lnc-smad3(loc102639582，geneid:102639582，genbankaccessionnumber:ky652933，seqidno:1)。該分子在初始狀cd4⁺t細胞中的特異性高表達，能夠將初始狀cd4⁺t細胞更好的與其他免疫細胞，如cd8⁺t細胞、b細胞、樹突狀細胞、巨噬細胞等區(qū)分開來。并且，lnc-smad3的表達量能夠反映初始狀cd4⁺t細胞往調節(jié)性t細胞方向的分化程度，并能夠反映分化出的調節(jié)性t細胞的成熟和功能狀態(tài)。這在臨床和科研中對初始狀cd4⁺t細胞和/或其分化而成的調節(jié)性t細胞的鑒定，其成熟和/或其功能狀態(tài)的判斷以及相關疾病的診斷中有廣泛的應用前景，可用于例如對象中免疫功能判斷、免疫治療方案選擇(例如針對臨床感染、炎癥、自身免疫性疾病以及腫瘤等免疫相關性疾病的治療方案選擇)和/或預后評估(例如免疫功能的預后評估)。在此基礎上，完成了本發(fā)明。

本發(fā)明的第一方面，提供選自下組的rna序列在制備鑒別初始狀cd4⁺t細胞和/或其分化而成的調節(jié)性t細胞和/或其成熟狀態(tài)以及功能的試劑或試劑盒中的應用：

(a)seqidno:1所示的長非編碼rna；

(b)在嚴格條件下與(a)限定的序列雜交的序列；

(c)與(a)或(b)中序列具有90％以上序列相同性的rna序列；和

(d)(a)或(b)中序列在非小鼠哺乳動物中的同源序列。

本發(fā)明的第二方面，提供檢測選自下組的rna序列水平的試劑在制備鑒別初始狀cd4⁺t細胞和/或其分化而成的調節(jié)性t細胞和/或其成熟狀態(tài)以及功能的試劑盒中的應用：

(a)seqidno:1所示的長非編碼rna；

(b)在嚴格條件下與(a)限定的序列雜交的序列；

(c)與(a)或(b)中序列具有90％以上序列相同性的rna序列；和

(d)(a)或(b)中序列在非小鼠哺乳動物中的同源序列。

在本發(fā)明的優(yōu)選實施方式中，所述rna序列是seqidno:1所示的長非編碼rna。

在本發(fā)明的一些實施方式中，所述初始狀cd4⁺t細胞和/或其分化而成的調節(jié)性t細胞來源于哺乳動物，優(yōu)選小鼠、人、大鼠、犬、猴、猩猩、豬、馬、?；蜓?，更優(yōu)選小鼠。

在本發(fā)明的一些實施方式中，所述成熟狀態(tài)選自：細胞表面淋巴細胞歸巢受體cd44/cd62l的表達、抑制性受體cd25/clta4/gitr的表達、免疫抑制性細胞因子il-10的產生；所述功能選自：抑制效應性細胞的增殖和活化、負向調控免疫應答、抑制炎癥、維持免疫穩(wěn)態(tài)。lnc-smad3的表達量與調節(jié)性t細胞的成熟功能狀態(tài)呈負相關。當lnc-smad3表達量降低時，代表初始狀cd4⁺t細胞往調節(jié)性t細胞方向成功分化，當lnc-smad3表達量降低85％時，代表調節(jié)性t細胞分化成熟，能有效的抑制效應性細胞的增殖和活化，維持免疫穩(wěn)態(tài)。

在本發(fā)明的一些實施方式中，所述rna序列的水平用于免疫功能判斷、免疫治療方案選擇和/或預后評估。

在本發(fā)明的一些實施方式中，若待鑒別細胞中所述rna序列的水平高于非初始狀cd4⁺t細胞，則表明該待鑒別細胞是初始狀cd4⁺t細胞；若待鑒別細胞為初始狀cd4⁺t細胞，且處理后所述rna序列的水平較處理前降低，則表明所述待鑒別細胞正往成熟調節(jié)性t細胞方向轉化，且表明所述處理能誘導向成熟調節(jié)性t細胞的轉化，并使得待鑒別細胞具有或正趨于具有選自下組的一種或多種功能：抑制效應性t細胞的增殖和活化、負向調控免疫應答、抑制炎癥、維持免疫穩(wěn)態(tài)。

在本發(fā)明的一些實施方式中，所述非初始狀cd4⁺t細胞為選自下組中的一種或兩種以上：cd8⁺t細胞、b細胞、樹突狀細胞、巨噬細胞。

在本發(fā)明的一些實施方式中，所述鑒別通過選自下組中的一種或兩種以上方法進行：qrt-pcr、rna印跡法、原位雜交、生物芯片技術、流式細胞術、二代測序rna-seq，優(yōu)選qrt-pcr。

在本發(fā)明的一些實施方式中，所述試劑為選自下組中的一種或兩種以上：針對所述rna序列的探針或引物、或其他以此序列為指示的檢測方法。

在本發(fā)明的一些實施方式中，所述引物是qrt-pcr檢測用的定量引物，優(yōu)選seqidno:2和seqidno:3所示的引物。

在本發(fā)明的一些實施方式中，所述試劑盒還包含：其它鑒別初始狀cd4⁺t細胞和/或其分化而成的調節(jié)性t細胞的試劑，例如cd4、cd62l/cd44、cd25/foxp3、ctla4、gitr檢測試劑。

本發(fā)明的第三方面，提供一種用于鑒別初始狀cd4⁺t細胞和/或其分化而成的調節(jié)性t細胞的試劑盒，其包含：

i)檢測選自下組的rna序列水平的試劑：

(a)seqidno:1所示的長非編碼rna；

(b)在嚴格條件下與(a)限定的序列雜交的序列；

(c)與(a)或(b)中序列具有90％以上序列相同性的rna序列；和

(d)(a)或(b)中序列在非小鼠哺乳動物中的同源序列；

ii)容納所述試劑的容器。

在本發(fā)明的一些實施方式中，所述鑒別通過選自下組中的一種或兩種以上方法進行：qrt-pcr、rna印跡法、原位雜交、生物芯片技術、流式細胞術、二代測序rna-seq，優(yōu)選qrt-pcr。

在本發(fā)明的一些實施方式中，所述試劑為選自下組中的一種或兩種以上：針對所述rna序列的探針或引物、或其他以此序列為指示的檢測方法。

在本發(fā)明的一些實施方式中，所述引物是qrt-pcr檢測用的定量引物，優(yōu)選seqidno:2和seqidno:3所示的引物。

在本發(fā)明的一些實施方式中，所述試劑盒還包含：其它鑒別初始狀cd4⁺t細胞和/或其分化而成的調節(jié)性t細胞的試劑，例如cd4、cd62l/cd44、cd25/foxp3、ctla4、gitr檢測試劑。

本發(fā)明的第四方面，提供一種鑒別初始狀cd4⁺t細胞和/或其分化而成的調節(jié)性t細胞的方法、或鑒別能誘導產生調節(jié)性t細胞或使其成熟的試劑或體系的方法，所述方法包括檢測待鑒別細胞中選自下組的rna序列的水平的步驟：

(a)seqidno:1所示的長非編碼rna；

(b)在嚴格條件下與(a)限定的序列雜交的序列；

(c)與(a)或(b)中序列具有90％以上序列相同性的rna序列；和

(d)(a)或(b)中序列在非小鼠哺乳動物中的同源序列；

在本發(fā)明的一些實施方式中，所述方法還包括：

將待鑒別細胞中所述rna序列的水平與非初始狀cd4⁺t細胞中所述rna序列的水平比較，或將處理前的待鑒別細胞中所述rna序列的水平與不同時間段或處理階段的待鑒別細胞中的所述rna序列水平比較；

其中，若待鑒別細胞中所述rna序列的水平高于非初始狀cd4⁺t細胞，則表明該所測細胞是初始狀cd4⁺t細胞；

若待鑒別細胞為初始狀cd4⁺t細胞，該所測細胞中所述rna序列的水平較處理前降低，則表明該所測細胞趨于往調節(jié)性t細胞方向分化；

若采用候選試劑或體系處理初始狀cd4⁺t細胞后，所測細胞中的所述rna序列水平與處理前相比降低，則表明所述候選試劑或體系能誘導初始狀cd4⁺t細胞往調節(jié)性t細胞方向分化成熟。

lnc-smad3的表達量與調節(jié)性t細胞的分化、成熟和功能狀態(tài)呈負相關。當lnc-smad3表達量降低時，代表初始狀cd4⁺t細胞成功往調節(jié)性t細胞分化，分化產生的調節(jié)性t細胞更加成熟，更能有效的抑制效應性t細胞應答，負向調控免疫應答。

本文中提供的所有數值范圍旨在清楚地包括落在范圍端點之間的所有數值及它們之間的數值范圍?？蓪Ρ景l(fā)明提到的特征或實施例提到的特征進行組合。本說明書所揭示的所有特征可與任何組合物形式并用，說明書中所揭示的各個特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特別說明，所揭示的特征僅為均等或相似特征的一般性例子。

如本文所用，“含有”、“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……構成”、“基本上由……構成”、和“由……構成”；“主要由……構成”、“基本上由……構成”和“由……構成”屬于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。

如本文所用，術語“表達”在描述lnc-smad3是指其rna水平。

lnc-smad3及其雜交和同源序列

如本文所用，術語“l(fā)nc-smad3”是指(a)由初始狀cd4⁺t細胞特異性表達的長鏈非編碼rna分子(lncrna)，其序列如seqidno:1所示；(b)在嚴格條件下與(a)限定的序列雜交的序列；(c)與(a)或(b)中序列具有90％以上序列相同性的rna序列；和(d)(a)或(b)中序列在非小鼠哺乳動物中的同源序列。

在本發(fā)明中，“嚴格條件”是指：(1)在較低離子強度和較高溫度下的雜交和洗脫，如0.2×ssc,0.1％sds,60℃；或(2)雜交時加有變性劑,如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％ficoll，42℃等；或(3)僅在兩條序列之間的相同性至少在90％以上,更好是95％以上時才發(fā)生雜交。

本發(fā)明的rna全長序列或其片段通常可以用pcr擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。當序列較長時，常常需要進行兩次或多次pcr擴增，然后再將各次擴增出的片段按正確次序拼接在一起。一旦獲得了有關的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關序列。

試劑盒

本發(fā)明中還提供了用于鑒別初始狀cd4⁺t細胞和/或其分化而成的調節(jié)性t細胞的試劑盒，其中包含(i)檢測本發(fā)明分子標志物lnc-smad3的一種或多種試劑；和(ii)容納所述試劑的容器。

用于本發(fā)明中的檢測方法可采用本領域中常用的rna檢測方法，只要該方法可檢測出lnc-smad3的水平或水平變化，這些方法包括但不限于：qrt-pcr、rna印跡法、原位雜交、生物芯片技術、流式細胞術等檢測方法，本領域技術人員可根據需要進行選擇。

可根據多種檢測原理和方法，按照需要在試劑盒中配備檢測lnc-smad3平的試劑或試劑組。在本發(fā)明中，“試劑組”是指包含了檢測所需的多種試劑的試劑組合。

此外，本發(fā)明的試劑盒還可根據需要包括：容器、對照物(包括陽性或陰性對照)、使用說明書、緩沖劑等，本領域技術人員可根據具體情況對其進行選擇。

本發(fā)明優(yōu)點在于：

1、確定了一種能鑒別初始狀cd4⁺t細胞和/或其分化而成的調節(jié)性t細胞和/或其成熟及功能狀態(tài)的特異性分子標志物——lnc-smad3；

2、為臨床和科研中涉及初始狀cd4⁺t細胞和/或其分化而成的調節(jié)性t細胞的應用和研究提供了簡便而有效的工具和方法，具有廣泛的應用前景。

附圖說明

圖1：lnc-smad3在各類免疫細胞中的表達量的qrt-pcr檢測。圖中，一個點代表一個樣品重復。

圖2：lnc-smad3在初始狀cd4⁺t細胞向成熟調節(jié)性t細胞分化成熟過程中表達量的qrt-pcr檢測。圖中所示結果為平均值±標準差(n＝3)。

圖3：qrt-pcr檢測初始狀cd4⁺t細胞分化來的調節(jié)性t細胞中l(wèi)nc-smad3的rna水平，從而證實lnc-smad3慢病毒(lenti-lnc-smad3)的過表達效率；結果顯示為平均值±標準差(n＝3)。

圖4：qrt-pcr檢測初始狀cd4⁺t細胞分化來的調節(jié)性t細胞中foxp3的rna水平，從而證實在利用lnc-smad3慢病毒增加了lnc-smad3的表達后，調節(jié)性t細胞的關鍵轉錄因子的表達受到明顯抑制；結果顯示為平均值±標準差(n＝3)。

圖5：流式檢測初始狀cd4⁺t細胞分化來的調節(jié)性t細胞中foxp3的蛋白水平，從而證實在利用lnc-smad3慢病毒增加了lnc-smad3的表達后，初始狀cd4⁺t細胞往調節(jié)性t細胞的分化發(fā)育受阻礙。

圖6：流式檢測調節(jié)性t細胞表面受體的表達，證實在利用lnc-smad3慢病毒增加了lnc-smad3的表達后，調節(jié)性t細胞功能相關的表面受體的表達受到明顯抑制；結果顯示為平均值±標準差(n＝3)。

圖7.elisa檢測在利用lnc-smad3慢病毒增加了lnc-smad3的表達后，調節(jié)性t細胞分泌的il-10的水平降低；結果顯示為平均值±標準差(n＝3)。

圖8.調節(jié)性t細胞抑制實驗檢測調節(jié)性t細胞在過表達lnc-smad3后抑制效應性t細胞增殖的能力；結果顯示為平均值±標準差(n＝3)。

以上圖中，lenti-ctr＝對照。

具體實施方式

下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。本領域技術人員可對本發(fā)明做出適當的修改、變動，這些修改和變動都在本發(fā)明的范圍之內。

下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，可采用本領域中的常規(guī)方法，例如參考《分子克隆實驗指南》(第三版，紐約，冷泉港實驗室出版社，newyork：coldspringharborlaboratorypress，1989)或按照供應商所建議的條件。dna的測序方法為本領域常規(guī)的方法，也可由商業(yè)公司提供測試。

除非另外說明，否則百分比和份數按重量計算。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學用語與本領域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內容相似或均等的方法及材料皆可應用于本發(fā)明方法中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。

實施例1.初始狀cd4⁺t細胞分化成調節(jié)性t細胞的培養(yǎng)過程

根據文獻記載在體外使小鼠來源的初始狀cd4⁺t細胞分化培養(yǎng)成調節(jié)性t細胞(roychoudhuri,r.etal.bach2represseseffectorprogramstostabilizet(reg)-mediatedimmunehomeostasis.nature498,506-510(2013).)。

利用初始狀cd4⁺t細胞分離試劑盒(stemcell)從小鼠脾臟細胞中分離出初始狀cd4⁺t細胞。將分選得到的初始狀cd4⁺t細胞培養(yǎng)于37℃的細胞培養(yǎng)箱中[24孔板，1×10⁶個細胞/孔，1ml/孔rpmi-1640(paa)細胞培養(yǎng)液，其中含10％(v/v)fcs(paa)，外加anti-cd3(1μg/ml)，anti-cd28mabs(1μg/ml)，anti-ifn-γ(10μg/ml)，anti–il-4(10μg/ml)，il-2(5ng/ml)以及重組人tgf-β(10ng/ml)]。培養(yǎng)置第三天時，初始狀cd4⁺t細胞分化成成熟的調節(jié)性t細胞。

實施例2：lnc-smad3及其基因組附近基因的定量實時pcr(qrt-pcr)檢測

取實施例1中利用試劑盒分選得到的初始狀cd4⁺t細胞(圖1)或往調節(jié)性t細胞分化培養(yǎng)的各個時間點的細胞(圖2)，采用trizol(invitrogen公司)提取其中的rna樣品。qrt-pcr使用sybrrt-pcr試劑盒(takara公司，sybrgreenrealtimepcrmastermixcode：qpk-201)，并在lightcycler(roche公司)實時定量pcr儀上進行操作。

lnc-smad3的qrt-pcr檢測用的定量引物為：

5'-aggccaacgatccaggttta-3'(上游，seqidno:2)；

5'-acatgtctggaggcaatgga-3'(下游，seqidno:3)。

作為無變化對照的lnc-smad3基因組附近基因iqchqrt-pcr檢測用的定量引物為：

5'-tgggcatgttaacaatcggtg-3'(上游，seqidno:4)；

5'-tcttcctcctctttgctctgt-3'(下游，seqidno:5)。

反轉錄反應參數：42℃20分鐘，99℃5分鐘。

qrt-pcr反應參數：95℃15秒，57℃10秒，68℃2秒讀板，72℃30秒，40循環(huán)。

rna的相對定量使用2-δδct法計算(以gapdh為內參)。

gapdhqrt-pcr檢測用的定量引物為：

5'-aggtcggtgtgaacggatttg-3'(上游，seqidno:6)；

5'-tgtagaccatgtagttgaggtca-3'(下游，seqidno:7)。

測試結果如圖1和圖2所示。

圖1中的數據顯示：lnc-smad3僅在初始狀cd4⁺t細胞中高表達，而在其它免疫細胞亞群中不表達或表達量很低。

cd8⁺t細胞是采用抗cd8磁珠(miltenyibiotech)從小鼠脾臟細胞中分離而出；b細胞是采用抗b220磁珠(miltenyibiotech)從小鼠脾臟細胞中分離而出；樹突狀細胞是利用小鼠骨髓細胞外加100ng/ml小鼠gm-csf和10ng/ml小鼠il-4細胞因子(r&dsystems，minneapolis,mn)培養(yǎng)七天而獲得；巨噬細胞是往小鼠腹腔注射肉湯，三天后抽取腹水而獲得。

圖2中的數據顯示：lnc-smad3在初始狀cd4⁺t細胞分化為調節(jié)性t細胞的過程中(第0天～第3天)表達量顯著下調，在調節(jié)性t細胞分化成熟時(第3天)達到最低值，低于初始狀cd4⁺t細胞(第0天)中表達量的10％。而作為無關對照的其它基因iqch的表達量在cd4⁺t細胞分化為調節(jié)性t細胞的過程沒有明顯變化。

以上結果表明：

lnc-smad3可以作為鑒別初始狀cd4⁺t細胞的特異性生物標記物，其表達水平可用于區(qū)別初始狀cd4⁺t細胞與其它免疫細胞。

并且，lnc-smad3也可以作為鑒別調節(jié)性t細胞成熟狀態(tài)的特異性生物標記物，其表達水平的高低，可用于確定調節(jié)性t細胞的成熟狀態(tài)，并可進一步用于確定與調節(jié)性t細胞成熟狀態(tài)相對應的免疫功能。

實施例3：lnc-smad3的定量實時pcr(qrt-pcr)檢測

用小鼠cd4⁺t細胞的cdna為模板，設計引物分別pcr擴增出小鼠lnc-smad3序列；將擴增片段引入pcdh-cmv-mcs-ef1-puroegfp載體中，利用lentivectors表達體系(systembiosciences)構建表達lnc-smad3的慢病毒(lenti-lnc-smad3)。

在初始狀cd4⁺t細胞分化發(fā)育為調節(jié)性t細胞的過程中，用表達lnc-smad3的慢病毒及其對照載體(lenti-ctr)感染細胞(moi＝100)。第三天收細胞采用trizol(invitrogen公司)提取其中的rna樣品。qrt-pcr使用sybrrt-pcr試劑盒(takara公司，sybrgreenrealtimepcrmastermixcode：qpk-201)，并在lightcycler(roche公司)實時定量pcr儀上進行操作。

lnc-smad3的qrt-pcr檢測用的定量引物為：

5'-aggccaacgatccaggttta-3'(上游，seqidno:2)；

5'-acatgtctggaggcaatgga-3'(下游，seqidno:3)。

反轉錄反應參數：42℃20分鐘，99℃5分鐘。

qrt-pcr反應參數：95℃15秒，57℃10秒，68℃2秒讀板，72℃30秒，40循環(huán)。

rna的相對定量使用2-δδct法計算(以gapdh為內參)。

gapdhqrt-pcr檢測用的定量引物為：

5'-aggtcggtgtgaacggatttg-3'(上游，seqidno:6)；

5'-tgtagaccatgtagttgaggtca-3'(下游，seqidno:7)。

測試結果如圖3所示。

實施例4：foxp3的定量實時pcr(qrt-pcr)檢測

在初始狀cd4⁺t細胞分化發(fā)育為調節(jié)性t細胞的過程中，用表達lnc-smad3的慢病毒及其對照載體(lenti-ctr)感染細胞(moi＝100)。第三天收細胞采用trizol(invitrogen公司)提取其中的rna樣品。qrt-pcr使用sybrrt-pcr試劑盒(takara公司，sybrgreenrealtimepcrmastermixcode：qpk-201)，并在lightcycler(roche公司)實時定量pcr儀上進行操作。

foxp3的qrt-pcr檢測用的定量引物為：

5'-cccatccccaggagtcttg-3'(上游，seqidno:8)；

5'-accatgactaggggcactgta-3'(下游，seqidno:9)。

反轉錄反應參數：42℃20分鐘，99℃5分鐘。

qrt-pcr反應參數：95℃15秒，57℃10秒，68℃2秒讀板，72℃30秒，40循環(huán)。

rna的相對定量使用2-δδct法計算(以gapdh為內參)。

gapdhqrt-pcr檢測用的定量引物為：

5'-aggtcggtgtgaacggatttg-3'(上游，seqidno:6)；

5'-tgtagaccatgtagttgaggtca-3'(下游，seqidno:7)。

測試結果如圖4所示。

實施例5：調節(jié)性t細胞內foxp3的流式檢測

在初始狀cd4⁺t細胞分化發(fā)育為調節(jié)性t細胞的過程中，用表達lnc-smad3的慢病毒及其對照載體(lenti-ctr)感染細胞(moi＝100)。第三天收細胞，并采用流式細胞術檢測細胞胞內foxp3的蛋白水平。

所用細胞流式抗體標記是cytofix/cytoperm試劑盒(ebioscience)，按照其標準操作流程進行。流式細胞檢測用的是facslsrii流式細胞儀，軟件為facsiva(bdbiosciences)。具體步驟可參見本實驗室之前發(fā)表的論文(liu,j.等rhbdd3controlsautoimmunitybysuppressingtheproductionofil-6bydendriticcellsviak27-linkedubiquitinationoftheregulatornemo.natureimmunology.2014；15:612-622.)

實驗結果如圖5所示。結果顯示：過表達lnc-smad3后調節(jié)性t細胞的關鍵性轉錄因子foxp3的表達有明顯的降低，說明調節(jié)性t細胞的分化發(fā)育受到阻礙。

實施例6：調節(jié)性t細胞表面抑制性受體cd25/ctla-4/gitr的流式檢測

在初始狀cd4⁺t細胞分化發(fā)育為調節(jié)性t細胞的過程中，用表達lnc-smad3的慢病毒及其對照載體(lenti-ctr)感染細胞(moi＝100)。第三天收細胞，并采用流式細胞術檢測細胞表面抑制性受體cd25/ctla-4/gitr的水平。檢測方法同實施例5。

實驗結果如圖6所示。結果顯示：過表達lnc-smad3后調節(jié)性t細胞的表面抑制性受體cd25/ctla-4/gitr的水平均有明顯的降低，說明調節(jié)性t細胞的成熟受到阻礙。

實施例7：調節(jié)性t細胞分泌il-10的功能檢測

在初始狀cd4⁺t細胞分化發(fā)育為調節(jié)性t細胞的過程中，用表達lnc-smad3的慢病毒及其對照載體(lenti-ctr)感染細胞(moi＝100)。第三天收細胞培養(yǎng)上清，采用elisa(r&d公司)檢測il-10，具體步驟參照elisa試劑盒說明書。

實驗結果如圖7所示。該結果顯示：lnc-smad3過表達后調節(jié)性t細胞分泌il-10的能力明顯下降。

由于分泌il-10以及表達抑制性受體cd25/ctla-4/gitr是調節(jié)性t細胞成熟并具有免疫抑制功能的顯著特征，因此上述結果表明lnc-smad3參與抑制調節(jié)性t細胞的成熟和功能。

實施例8：調節(jié)性t細胞抑制效應性t細胞增殖功能的檢測

5×10⁴cfse標記后的cd4⁺效應t細胞(來自cd45.1小鼠)與1×10⁴cd11c⁺dc共培養(yǎng)于96孔圓底板中。按照實例3-7處理的調節(jié)性t細胞以2.5×10⁴的細胞量加入體系中。給予anti-cd3(1μg/ml)刺激3天后，用流式細胞術通過檢測cd45.2⁺的t細胞數量，來分析t細胞的增殖情況，從而評估體系中調節(jié)性t細胞所發(fā)揮的抑制作用。

實驗結果如圖8所示。結果顯示：過表達lnc-smad3后調節(jié)性t細胞抑制效應性t細胞增殖的能力明顯減弱。

綜上所述，實施例3-8中的結果表明，在初始狀cd4⁺t細胞往調節(jié)性t細胞分化發(fā)育的過程中，lnc-smad3表達的下降是調節(jié)性t細胞正常分化、成熟和具備功能是必需的。對lnc-smad3進行過表達后能夠實現對調節(jié)性t細胞成熟和功能的調控，以及對調節(jié)性t細胞介導的相關免疫應答的調控。因此，lnc-smad3可作為鑒定初始狀cd4⁺t細胞和/或其分化而成的調節(jié)性t細胞和/或其成熟狀態(tài)以及功能的特異性生物標志物，且可應用于免疫相關性疾病的診斷、干預和預后檢測。

以上已對本發(fā)明創(chuàng)造的較佳實施例進行了具體說明，但本發(fā)明創(chuàng)造并不限于所述實施例，熟悉本領域的技術人員在不違背本發(fā)明創(chuàng)造精神的前提下還可做出種種的等同的變型或替換，這些等同的變型或替換均包含在本申請權利要求所限定的范圍內。

sequencelisting

<110>中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學

<120>一種初始狀cd4+t細胞和/或其分化而成的調節(jié)性t細胞的特異性生物標志物

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