本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種博來霉素族衍生物的微生物發(fā)酵制備方法。

背景技術(shù)：

博來霉素為廣譜抗腫瘤藥，對鱗癌，包括頭頸部、皮膚、食道、肺、宮頸、陰莖和甲狀腺等癌腫以及惡性淋巴瘤等有效，對腦瘤、惡性黑色素瘤和纖維肉瘤等也具有一定療效。博來霉素有獨特的分子結(jié)構(gòu)和生物活性，能夠介導(dǎo)激活氧分子，并選擇性的引起單鏈和雙鏈dna的斷裂從而抑制腫瘤細胞的dna合成和復(fù)制。此外，博來霉素還可以選擇性的裂解rna從而抑制蛋白質(zhì)的合成。博來霉素的活性機理決定了其不會抑制骨髓造血系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)，因此對人體白細胞，機體免疫功能和造血系統(tǒng)等的副作用較為輕微。博來霉素屬于細胞周期非特異性藥物，從上世紀80年代其被開發(fā)成一種重要的有效抗腫瘤藥物，在臨床上廣泛應(yīng)用。目前博來霉素一般與其他抗腫瘤藥物或輔助藥物聯(lián)合應(yīng)用，以降低其毒性和獲得更好的抗腫瘤效果。

博來霉素自被發(fā)現(xiàn)后便因其強效的抗腫瘤活性迅速成為治療多種腫瘤的特效化療藥物，近年來博來霉素族抗生素在抗病毒研究中的應(yīng)用，更加拓寬了其應(yīng)用范圍。但是博來霉素導(dǎo)致的劑量依賴性肺纖維化以及一些腫瘤細胞逐漸形成的耐藥性極大的限制了其臨床應(yīng)用和推廣。因此，合成新型的高效低毒的博來霉素族衍生物一直都是開發(fā)博來霉素類抗腫瘤藥物的關(guān)鍵和熱點。雖然博來霉素的化學(xué)合成已經(jīng)完成，但是通過傳統(tǒng)化學(xué)修飾獲取少量的博來霉素衍生物并未展示出更好的活性和更低的毒性，同時博來霉素及其復(fù)雜的分子結(jié)構(gòu)也導(dǎo)致相關(guān)的合成過程繁瑣且效率低下，無法滿足臨床研究的需要和工業(yè)化生產(chǎn)的應(yīng)用。為此，我們提出了一種博來霉素族衍生物的微生物發(fā)酵制備方法投入使用，以解決上述問題。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種博來霉素族衍生物的微生物發(fā)酵制備方法，以解決上述背景技術(shù)中提出的通過傳統(tǒng)化學(xué)修飾獲取少量的博來霉素衍生物并未展示出更好的活性和更低的毒性，同時博來霉素及其復(fù)雜的分子結(jié)構(gòu)也導(dǎo)致相關(guān)的合成過程繁瑣且效率低下，無法滿足臨床研究的需要和工業(yè)化生產(chǎn)的應(yīng)用的問題。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：一種博來霉素族衍生物的微生物發(fā)酵制備方法，該博來霉素族衍生物的微生物發(fā)酵制備方法的具體步驟如下：

s1：在輪枝鏈霉菌菌種的新鮮斜面加入10ml無菌水，刮下白色孢子層后，所得的懸浮液經(jīng)過濾后振蕩2min，制得單孢子溶液；

s2：利用滴定管吸取10ml單孢子溶液于無菌平板中，采用紫外線照射后，將其均勻涂布于無菌平板中培養(yǎng)，制備出耐性菌株；

s3：將耐性菌株接種至含有發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中，搖瓶發(fā)酵；

s4：將發(fā)酵后產(chǎn)生的發(fā)酵液經(jīng)過過濾后用微量注射器各取上清液15μl，并滴于圓形層析濾紙小片上，且紙片貼在鑒定菌的培養(yǎng)板上，在37℃環(huán)境下培養(yǎng)14～20h，并取抑菌圈較大者進行復(fù)篩；

s5：利用hplc色譜分析方法選取目標產(chǎn)物生產(chǎn)能力較高的菌株，并轉(zhuǎn)接于發(fā)酵培養(yǎng)基中，裝液量為50ml的三角瓶，在30℃、170r·min^-1的條件下?lián)u床培養(yǎng)60～70h，得到作為發(fā)酵培養(yǎng)的種子液；

s6：以10％接種量將所得種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中進行搖床培養(yǎng)，發(fā)酵體系為300ml三角瓶裝液量為50ml，在30℃、200r·min^-1的條件下?lián)u床培養(yǎng)6d；

s7：發(fā)酵結(jié)束后，收集發(fā)酵液，用10倍體積甲醇振蕩浸提24h后，將甲醇浸提液放入真空干燥箱中烘干后既得。

優(yōu)選的，所述步驟s2中，在采用紫外線照射時，紫外線發(fā)光光源為30w，260a，紫外線光源的照射距離為30cm。

優(yōu)選的，所述步驟s3中，發(fā)酵培養(yǎng)基為淀粉、糊精、大豆粉、葡萄糖、玉米漿、黃豆粉、酵母粉、硫酸銅和硫酸鋅的混合物，其ph值為6.5～7.0。

優(yōu)選的，所述步驟s4中，鑒定菌為枯草桿菌。

優(yōu)選的，所述步驟s5中，在采用hplc定量分析中，液相色譜條件為色譜柱ywg，c18，10μm，250×4.6mm。

優(yōu)選的，所述步驟s7中，真空干燥箱的功率為3～5kw，烘干溫度為90～110℃。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明提高了博來霉素的生產(chǎn)周期，進一步的提高其產(chǎn)量，并簡化了發(fā)酵培養(yǎng)基的成分，降低了生產(chǎn)成本，且制備出的博來霉素能夠展現(xiàn)出更好的活性和更低的毒性。

附圖說明

圖1為本發(fā)明制備流程圖。

具體實施方式

下面將結(jié)合本發(fā)明實施例中的附圖，對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。

請參閱圖1，本發(fā)明提供一種技術(shù)方案：一種博來霉素族衍生物的微生物發(fā)酵制備方法，該博來霉素族衍生物的微生物發(fā)酵制備方法的具體步驟如下：

s1：在輪枝鏈霉菌菌種的新鮮斜面加入10ml無菌水，刮下白色孢子層后，所得的懸浮液經(jīng)過濾后振蕩2min，制得單孢子溶液；

s2：利用滴定管吸取10ml單孢子溶液于無菌平板中，采用紫外線照射后，將其均勻涂布于無菌平板中培養(yǎng)，制備出耐性菌株，在采用紫外線照射時，紫外線發(fā)光光源為30w，260a，紫外線光源的照射距離為30cm；

s3：將耐性菌株接種至含有發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中，搖瓶發(fā)酵，發(fā)酵培養(yǎng)基為淀粉、糊精、大豆粉、葡萄糖、玉米漿、黃豆粉、酵母粉、硫酸銅和硫酸鋅的混合物，其ph值為6.5～7.0；

s4：將發(fā)酵后產(chǎn)生的發(fā)酵液經(jīng)過過濾后用微量注射器各取上清液15μl，并滴于圓形層析濾紙小片上，且紙片貼在鑒定菌的培養(yǎng)板上，在37℃環(huán)境下培養(yǎng)14～20h，并取抑菌圈較大者進行復(fù)篩，鑒定菌為枯草桿菌；

s5：利用hplc色譜分析方法選取目標產(chǎn)物生產(chǎn)能力較高的菌株，并轉(zhuǎn)接于發(fā)酵培養(yǎng)基中，裝液量為50ml的三角瓶，在30℃、170r·min^-1的條件下?lián)u床培養(yǎng)60～70h，得到作為發(fā)酵培養(yǎng)的種子液，在采用hplc定量分析中，液相色譜條件為色譜柱ywg，c18，10μm，250×4.6mm；

s6：以10％接種量將所得種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中進行搖床培養(yǎng)，發(fā)酵體系為300ml三角瓶裝液量為50ml，在30℃、200r·min^-1的條件下?lián)u床培養(yǎng)6d；

s7：發(fā)酵結(jié)束后，收集發(fā)酵液，用10倍體積甲醇振蕩浸提24h后，將甲醇浸提液放入真空干燥箱中烘干后既得，真空干燥箱的功率為3～5kw，烘干溫度為90～110℃。

在菌種選育過程中，在含有博來霉素和前體的斜面培養(yǎng)基中，隨著博來霉素、前體濃度的增加，菌落變小并喪失產(chǎn)生孢子的能力，但是把此菌落轉(zhuǎn)移到不含有博來霉素和前體的斜面培養(yǎng)基中培養(yǎng)，則恢復(fù)產(chǎn)孢子的能力，對于博來霉素產(chǎn)生菌而言，其斜面的培養(yǎng)時間以7～8天為宜，種齡為48hr，發(fā)酵周期為8天時，博來霉素的產(chǎn)量較高。博來霉素結(jié)構(gòu)的多肽部分由許多氨基酸結(jié)合而成，并且從博來霉素的搖床發(fā)酵的代謝曲線可以看出，初級代謝與次級代謝階段區(qū)分明顯，在發(fā)酵培養(yǎng)基中，利用糊精作碳源代替部分淀粉，可使培養(yǎng)液的黏度大為下降，有利于溶氧濃度的提高，進而促進博來霉素的合成，另外通過對培養(yǎng)條件的正交實驗，以50ml裝量并于30℃培養(yǎng)，菌體產(chǎn)博來霉素的能力相對較強。

在博來霉素的發(fā)酵過程中，胺基類化合物可結(jié)合進入博來霉素結(jié)構(gòu)，構(gòu)成博來霉素的末端胺基，不同種類的有機氮源，因為含有不同的胺基類化合物，既可直接影響發(fā)酵單位的高低，也影響發(fā)酵產(chǎn)物中博來霉素的組分。在發(fā)酵培養(yǎng)基中，玉米漿可提高博來霉素a5的相對產(chǎn)量。

盡管已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實施例，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員而言，可以理解在不脫離本發(fā)明的原理和精神的情況下可以對這些實施例進行多種變化、修改、替換和變型，本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求及其等同物限定。