本發(fā)明屬于分析化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測(cè)人血清中抵抗慢加急性肝衰竭控制基因的方法。

背景技術(shù)：

肝衰竭是多種因素引起的嚴(yán)重肝臟損害，導(dǎo)致其合成、解毒、排泄和生物轉(zhuǎn)化等功能發(fā)生嚴(yán)重障礙或失代償，出現(xiàn)以凝血機(jī)制障礙和黃疸、肝性腦病、腹水等為主要表現(xiàn)的一組臨床癥候群。在我國(guó)，肝衰竭的主要是由肝炎病毒（主要是乙型肝炎病毒，hepatitisbvirus，hbv）引起的。截至目前，已經(jīng)在人血清中發(fā)現(xiàn)了幾十種基因突變位點(diǎn)，隨著越來(lái)越多的抗病毒核苷酸藥物的大量使用，將會(huì)產(chǎn)生更多的新的基因突變位點(diǎn)。有些突變利于乙肝患者的恢復(fù)，有些突變則會(huì)起到抑制作用，例如人血清中存在的少量抵抗慢加急性肝衰竭控制基因，可有效減緩發(fā)病過(guò)程，提高治療效果。因此，深入探索與研究人血清中是否含有抵抗慢加急性肝衰竭控制基因的突變的位點(diǎn)及序列，建立新的、特異性強(qiáng)的、靈敏度高的、可靠的檢驗(yàn)方法，對(duì)于肝衰竭患者的高效診斷、病情的及時(shí)治療等都具有重要意義。

目前，臨床上對(duì)肝病患者基因突變的診斷方法主要有pcr產(chǎn)物直接測(cè)序法和反向線性雜交法，這兩種方法是目前公認(rèn)的廣泛用于臨床的檢測(cè)方法。產(chǎn)物直接測(cè)序法的優(yōu)點(diǎn)是提供的信息量豐富，可以檢測(cè)已知與未知的突變，缺點(diǎn)是檢測(cè)靈敏度較低，病毒突變株比例達(dá)到20％～25％；反向線性雜交法的優(yōu)點(diǎn)是檢測(cè)靈敏度較高，可檢測(cè)到≥5％的突變株，但只能檢測(cè)已知突變，且目前技術(shù)上對(duì)同一突變位點(diǎn)（如rt184位點(diǎn)）中的多種突變形式的分辨力有限，此外，使用反向線性雜交法的試劑和配套儀器成本較高。其他檢測(cè)多位點(diǎn)突變的方法還有dna芯片法、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析法、克隆測(cè)序法、焦磷酸測(cè)序法、基質(zhì)輔助激光解吸附電離飛行時(shí)間質(zhì)譜測(cè)定法（maldi-tof-ms）等。雖然這些檢測(cè)方法具有較高的檢測(cè)準(zhǔn)確率和特異性，但是具有一些明顯的不足和缺陷，比如檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)（往往需要幾個(gè)小時(shí)、十幾個(gè)小時(shí)，乃至更長(zhǎng)時(shí)間），檢測(cè)成本高（樣本的檢測(cè)過(guò)程中耗材多且昂貴），檢測(cè)前處理復(fù)雜，對(duì)操作者的技術(shù)要求高等。因此，我們需要探索并建立一種更精確、靈敏、高效、成本低的分析方法，以期用于臨床上檢測(cè)人血清中是否含有抵抗慢加急性肝衰竭控制基因。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

臨床上對(duì)人血清中是否含有抵抗慢加急性肝衰竭控制基因突變的診斷方法主要有pcr產(chǎn)物直接測(cè)序法和反向線性雜交法，這兩種方法是目前公認(rèn)的廣泛用于臨床的檢測(cè)方法。但是這些方法往往伴隨著檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、靈敏度低、檢測(cè)成本高等缺點(diǎn)。

為了解決以上的問(wèn)題，本發(fā)明借助超分支滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)，構(gòu)建了一種靈敏度高、特異性強(qiáng)、檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠、檢測(cè)成本低等特點(diǎn)的方法用于檢測(cè)人血清中是否含有抵抗慢加急性肝衰竭控制基因的方法。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

所設(shè)計(jì)的基因序列如下：

本發(fā)明中所用到的dna引物序列（primer）由生工生物工程有限公司（中國(guó)，上海）合成并純化，具體序列如下：

p1：cccgaatacacaaag，p2：ctagttaagtacgct，鎖式探針plp：aaacagagttggcccgaatacacaaagagcgtacttaactagttgaggatggtg。

檢測(cè)人血清中抵抗慢加急性肝衰竭控制基因的方法，將目標(biāo)dna和40nmol/l鎖式探針plp溶液在37℃條件下雜交反應(yīng)1h，使鎖式探針5’端和3’端無(wú)限接近；再向上述溶液中加入6ue.colidna連接酶，0.05%bsa和0.024mmol/lnad⁺，在e-colidna連接酶作用下鎖式探針封閉成環(huán)；溶液中加入核酸外切酶i、iii，37℃反應(yīng)2h，接著將體系升溫至95℃環(huán)境中10min滅活；上述溶液中接著加入40nmol/lp1、p2，以及9.6ubstdna聚合酶和0.2mmol/ldntp，在63℃下進(jìn)行超分支滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)1小時(shí)，之后95℃加熱10min終止擴(kuò)增反應(yīng)；利用sybrgreeni作為熒光指示劑，最終進(jìn)行熒光檢測(cè)。

所述的方法如下：

（1）選擇合適的信號(hào)放大技術(shù)：根據(jù)控制肝衰竭基因的突變位點(diǎn)及序列均不同，以及堿基間的相互作用等特點(diǎn)，選擇超分支滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)用于放大檢測(cè)信號(hào)，提高檢測(cè)靈敏度，構(gòu)建檢測(cè)人血清中是否含有抵抗慢加急性肝衰竭控制基因的新方法。

（2）設(shè)計(jì)可準(zhǔn)確檢測(cè)人血清中是否含有抵抗慢加急性肝衰竭控制基因的新方法：根據(jù)基因測(cè)序等方法，確定常見的突變位點(diǎn)，設(shè)計(jì)合適的探針dna，采用超分支滾環(huán)擴(kuò)增放大技術(shù)，設(shè)計(jì)可高效診斷血清中是否含有抵抗慢加急性肝衰竭控制基因的新方法。

（3）可行性分析：為了確保所構(gòu)建方法的合理行，采用熒光分析儀等手段對(duì)方法進(jìn)行表征，并研制方法檢測(cè)的可行性。

（4）繪制線性曲線：在所構(gòu)建的新型檢測(cè)方法切實(shí)可行的基礎(chǔ)上，通過(guò)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，檢測(cè)不同濃度的目標(biāo)dna，繪制線性曲線，計(jì)算檢出限及檢測(cè)范圍。

（5）臨床實(shí)際樣本的檢測(cè)結(jié)果：我們直接收集臨床實(shí)際樣本，用于驗(yàn)證該方法的檢測(cè)靈敏度、準(zhǔn)確度、可信度等指標(biāo)。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：

1）設(shè)計(jì)了一種檢測(cè)靈敏度高、特異性好的新方法，用于準(zhǔn)確檢測(cè)人血清中是否含有抵抗慢加急性肝衰竭控制基因的新方法。

2）采用低成本、耗時(shí)短的超分支滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)，構(gòu)建檢測(cè)人血清中是否含有抵抗慢加急性肝衰竭控制基因的新方法。

3）本發(fā)明的檢測(cè)范圍為0.1~40nmol/l，檢測(cè)限可以達(dá)到0.05nmol/l，且能較好地識(shí)別完全互補(bǔ)、單堿基錯(cuò)配、雙堿基錯(cuò)配等序列，可以實(shí)現(xiàn)臨床上對(duì)人血清中是否含有抵抗慢加急性肝衰竭控制基因的準(zhǔn)確檢測(cè)。

附圖說(shuō)明

圖1本發(fā)明所設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)原理。

圖2本發(fā)明的可行性分析。

圖3本發(fā)明檢測(cè)目標(biāo)dna時(shí)繪制的線性曲線。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

1）所設(shè)計(jì)的基因序列如下：

本發(fā)明中所用到的dna引物序列（primer）由生工生物工程有限公司（中國(guó)，上海）合成并純化，具體序列如下：

e.colidna連接酶(包含e-colidna連接酶,10×連接酶緩沖溶液,10×牛血清白蛋白(0.05%))購(gòu)自大連寶生物有限公司，核酸外切酶i、iii(exoi、exoiii)及其相應(yīng)緩沖液購(gòu)自thermo公司，三磷酸脫氧核糖核苷混合液(dntps)購(gòu)自生工生物工程有限公司（中國(guó)，上海），bstdna聚合酶及其相應(yīng)緩沖液購(gòu)自鈕英倫生物技術(shù)（北京）有限公司。sybrgreeni購(gòu)自下廈門百維信生物公司。thequalitycontrolcornsampleswerepurchasedfromclovertechnologygroup.inc(beijing,china).所用試劑均為ar級(jí)別，實(shí)驗(yàn)所用蒸餾水均由milli-q超純水系統(tǒng)凈化。dna緩沖液：50mmol·l^-1tris-hcl（ph7.4）。

2）實(shí)驗(yàn)儀器及實(shí)驗(yàn)參數(shù)設(shè)置：

本發(fā)明中所設(shè)計(jì)的檢測(cè)方法主要用到的儀器有：

milli-q超純水系統(tǒng)（millipore，bedford，usa），實(shí)驗(yàn)用水均為其凈化的超純水；

phs-3c型精密酸度計(jì)（上海大普儀器有限公司）；

finnpipette可調(diào)式移液器（上海熱電儀器有限公司）；

caryeclipse熒光光度計(jì)（varian,usa）；

通過(guò)熒光分析儀給出信號(hào)檢測(cè)值，具體的檢測(cè)參數(shù)設(shè)置為：

激發(fā)波長(zhǎng)：488nm，發(fā)射波長(zhǎng)500~600nm。狹縫寬度：10.0nm.我們?nèi)?18nm處得熒光強(qiáng)度作為定量分析的依據(jù)。

3）基于超分支滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)設(shè)計(jì)的方法的原理：

在目標(biāo)物突變型乙肝耐藥性基因存在下，鎖式探針plp和目標(biāo)基因發(fā)生特異性結(jié)合。同時(shí)使得鎖式探針plp的5’端和3’端無(wú)限接近，在e-colidna連接酶的作用下封閉成環(huán)，在外切酶以及bst酶的催化作用下發(fā)生滾環(huán)擴(kuò)增延伸，形成一條具有大量重復(fù)序列且與鎖式探針互補(bǔ)的線狀單鏈。p2和該線狀單鏈結(jié)合在bst酶的催化下從其3’開始延伸，延伸產(chǎn)生的長(zhǎng)鏈dna則作為p1結(jié)合的模板，在dna聚合酶的作用下延伸并置換下游引物的延伸產(chǎn)物，被置換的延伸產(chǎn)物又可以作為互補(bǔ)模板,由鎖式探針的滾環(huán)擴(kuò)增起始引物進(jìn)行延伸。最終，在溶液形成大量的長(zhǎng)度分布不連續(xù)的雙鏈dna。這里，以sybrgreeni作為熒光指示劑，利用sybrgreeni可以嵌入雙鏈dna結(jié)構(gòu)中并發(fā)光的特點(diǎn)，通過(guò)熒光強(qiáng)度的變化來(lái)測(cè)定目標(biāo)dna的含量。

4）本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)步驟：

首先，將一定濃度的目標(biāo)dna和40nmol/l鎖式探針plp溶液在37℃條件下雜交反應(yīng)1h，使鎖式探針5’端和3’端無(wú)限接近。再向上述溶液中加入6ue.colidna連接酶，0.05%bsa和0.024mmol/lnad⁺（煙酰胺腺苷二核苷酸），在e-colidna連接酶作用下鎖式探針封閉成環(huán)。溶液中加入核酸外切酶i、iii(exoi、exoiii)，37℃反應(yīng)2h，接著將體系升溫至95℃環(huán)境中10min滅活。hrca反應(yīng)：上述溶液中接著加入40nmol/lp1、p2，以及9.6ubstdna聚合酶和0.2mmol/ldntp，在63℃下進(jìn)行超分支滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)1小時(shí)，之后95℃加熱10min終止擴(kuò)增反應(yīng)。利用sybrgreeni作為熒光指示劑，最終進(jìn)行熒光檢測(cè)。

5）方法的可行性分析：

為了驗(yàn)證本發(fā)明設(shè)計(jì)的原理準(zhǔn)確性，我們做了以下對(duì)比實(shí)驗(yàn)。比較了無(wú)目標(biāo)物的空白背景和在目標(biāo)物突變型dna、野生型dna存在下經(jīng)過(guò)hrca擴(kuò)增后熒光強(qiáng)度的變化。當(dāng)體系無(wú)目標(biāo)物存在下，hrca擴(kuò)增無(wú)法啟動(dòng)，體系的熒光較弱，當(dāng)目標(biāo)物野生型dna存在時(shí)，hrca擴(kuò)增無(wú)法啟動(dòng)，產(chǎn)生較弱的熒光，當(dāng)目標(biāo)物突變型dna存在時(shí)，經(jīng)hrca擴(kuò)增后，產(chǎn)生較強(qiáng)的熒光。這是由于目標(biāo)突變型dna可以與鎖式探針發(fā)生特異性結(jié)合并封閉成環(huán)，在酶的催化下發(fā)生超分支滾環(huán)擴(kuò)增。以上結(jié)果表明，該發(fā)明可以對(duì)目標(biāo)dna突變型基因給出準(zhǔn)確的檢測(cè)。

6）線性曲線的繪制：

經(jīng)驗(yàn)證，本發(fā)明設(shè)計(jì)的方法完全可行，經(jīng)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件后，我們對(duì)不同濃度的目標(biāo)dna野生型基因進(jìn)行定量檢測(cè)。體系的熒光強(qiáng)度隨著目標(biāo)dna濃度的增加而逐漸增大。同時(shí)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在0.1~40nmol/l范圍內(nèi)，熒光強(qiáng)度與野生型dna的濃度的對(duì)數(shù)成良好的線性關(guān)系，其檢測(cè)限可以達(dá)到0.05nmol/l，其線性方程為：

y=0.61x-508.11r=0.99985

（其中y為熒光強(qiáng)度；x為野生型dna濃度的對(duì)數(shù)；r為相關(guān)系數(shù)。）

7）實(shí)際樣品的檢測(cè)

通過(guò)收集臨床實(shí)際樣本，對(duì)比臨川檢測(cè)數(shù)據(jù)，通過(guò)本發(fā)明所述方法可以快速、準(zhǔn)確鑒定人血清中是否含有抵抗慢加急性肝衰竭控制基因，檢測(cè)結(jié)果如可行性分析結(jié)果（圖2）。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，凡依本發(fā)明申請(qǐng)專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明的涵蓋范圍。

sequencelisting

<110>福建醫(yī)科大學(xué)

<120>一種檢測(cè)人血清中抵抗慢加急性肝衰竭控制基因的方法

<130>9

<160>9

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>15

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

cccgaatacacaaag15

<210>2

<211>15

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

ctagttaagtacgct15

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<212>dna

<213>人工序列

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<212>dna

<213>人工序列

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ccaactctgtttcaccatcctcaa24

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<211>54

<212>dna

<213>人工序列

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<212>dna

<213>人工序列

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ccaactctgtaccaccatcctcaa24

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<212>dna

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ccaactctgatccaccatcctcaa24

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ccaactctcttccaccatcctcaa24

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<212>dna

<213>人工序列

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cctactctgttccaccatcctcaa24