本發(fā)明涉及(s)-羰基還原酶異源聚合體及其在催化多苯環(huán)化合物的應(yīng)用，屬于生物催化技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

手性化合物在醫(yī)藥、農(nóng)藥、激素、食品添加劑等精細(xì)化工品的生產(chǎn)上得到了越來越廣泛的應(yīng)用，如聯(lián)苯化合物2,4-二氯二苯甲酮對南美錐蟲病的寄生蟲有抑制作用，是一種潛在的藥用化合物。而化合物2-萘乙酮作為重要的藥物中間體，利用生物法催化該化合物，從而獲得各種重要的藥物前體也具有很大的價值。

氧化還原酶催化的不對稱還原反應(yīng)常用于手性化合物的制備。目前常用的氧化還原酶大部分產(chǎn)自重組型的大腸桿菌。而立體選擇性氧化還原酶能用于工業(yè)轉(zhuǎn)化手性醇的種類和數(shù)量非常有限，尤其是生產(chǎn)(s)-型手性醇的具有anti-prelog立體選擇性氧化還原酶數(shù)量更少。因此有必要對現(xiàn)有的氧化還原酶進(jìn)行改造以獲得具有新功能的工程酶，以滿足實(shí)際需要，獲得具有更多功能的手性生物催化劑。

發(fā)明人在前期工作中構(gòu)建得到了分別表達(dá)(s)-羰基還原酶基因簇(scr，scr2和scr3)基因的重組型大腸桿菌(e.coli)，重組菌能夠催化轉(zhuǎn)化制備(s)-苯基乙二醇。(s)-羰基還原酶系基因在大腸桿菌(e.coli)中分別異源表達(dá)后，對單苯環(huán)類化合物具有較好的催化活性。但是(s)-羰基還原酶scr、scr2、scr3的底物譜較窄，無法催化多苯環(huán)類化合物。如目前報(bào)道(s)-羰基還原酶scr、scr2、scr3同源蛋白聚合體能催化直鏈潛手性醇和單苯環(huán)類潛手性醇化合物，但對于聯(lián)苯類化合物2,4-二氯二苯甲酮和2-萘乙酮等重要的藥物中間體幾乎沒有催化能力。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決上述問題，本發(fā)明得到了(s)-羰基還原酶的異源聚合體，提高了(s)-羰基還原酶系基因的底物譜。通過蛋白和蛋白的相互作用，異源羰基還原酶聚合體催化底物譜擴(kuò)大，能夠催化雙苯環(huán)類化合物，如聯(lián)苯化合物2,4-二氯二苯甲酮和2-萘乙酮。

本發(fā)明的第一個目的是提供一種能夠催化多苯環(huán)類化合物的異源羰基還原酶聚合體蛋白，所述異源羰基還原酶聚合體蛋白是(s)-羰基還原酶的異源聚合體蛋白復(fù)合物。

在一種實(shí)施方式中，所述異源聚合體蛋白復(fù)合物是兩個以上氨基酸序列不同的(s)-羰基還原酶形成的異源聚合體。

在一種實(shí)施方式中，所述(s)-羰基還原酶是來源于近平滑假絲酵母的(s)-羰基還原酶。

在一種實(shí)施方式中，所述(s)-羰基還原酶可以是：氨基酸序列如seqidno:1所示的scr、氨基酸序列如seqidno:2所示的scr2、氨基酸序列如seqidno:3所示的scr3。

在一種實(shí)施方式中，所述(s)-羰基還原酶的編碼基因可以是：scr(genbankid:dq675534)、scr2(genbankid:gq411433)、scr3(genbankid:fj939564)。

在一種實(shí)施方式中，所述異源聚合體蛋白復(fù)合物是由scr和scr2形成的異源聚合體scr/scr2，或者是由scr2和scr3形成的異源聚合體scr2/scr3。

在一種實(shí)施方式中，所述異源聚合體蛋白復(fù)合物是將兩個以上氨基酸序列不同的(s)-羰基還原酶在同一宿主中共表達(dá)而得到的。

本發(fā)明的第二個目的是提供所述異源聚合體蛋白復(fù)合物的制備方法。所述方法，是將兩個以上氨基酸序列不同的(s)-羰基還原酶在同一宿主中共表達(dá)而得到的。

在一種實(shí)施方式中，所述方法，是將兩個以上氨基酸序列不同的(s)-羰基還原酶的基因分別連接到表達(dá)載體上，然后轉(zhuǎn)化到同一宿主中得到重組菌，重組菌共表達(dá)這兩個以上的(s)-羰基還原酶基因，得到異源聚合體蛋白復(fù)合物。

在一種實(shí)施方式中，所述連接到表達(dá)載體上，包括每個基因單獨(dú)連接到一個表達(dá)載體上，或者將多個基因連接到同一個表達(dá)載體上。

在一種實(shí)施方式中，所述表達(dá)載體可以是以下任意一種或者多種：pet21、pet28、petduet。

在一種實(shí)施方式中，所述宿主可以是大腸桿菌。

在一種實(shí)施方式中，所述宿主為(e.colibl21(de3)。

在一種實(shí)施方式中，所述連接到表達(dá)載體上，還包括在(s)-羰基還原酶的基因前添加蛋白純化標(biāo)簽。

在一種實(shí)施方式中，所述方法還包括共表達(dá)后的純化步驟。

在一種實(shí)施方式中，所述方法具體包括：(1)獲取兩個氨基酸序列不同的(s)-羰基還原酶的基因；(2)將上一步得到的兩個基因分別連接到不同的表達(dá)載體上，并進(jìn)一步構(gòu)建帶有不同純化標(biāo)簽的含有目的基因的兩個重組質(zhì)粒；(3)將兩個重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到同一宿主大腸桿菌中，得到共表達(dá)兩個氨基酸序列不同的(s)-羰基還原酶的重組大腸桿菌；(4)重組菌發(fā)酵表達(dá)，純化得到異源聚合體蛋白復(fù)合物。

在一種實(shí)施方式中，所述純化標(biāo)簽為組氨酸標(biāo)簽或者修飾的鏈球菌抗生物素蛋白標(biāo)簽。

在一種實(shí)施方式中，所述純化，是先收集菌體、破碎細(xì)胞得到胞內(nèi)表達(dá)的蛋白，然后離心取上清，先利用ni-ntacolumn純化得到帶有組氨酸標(biāo)簽的蛋白，再將得到的帶有組氨酸標(biāo)簽的蛋經(jīng)過streptraphpcolumn的純化，即得到異源聚合體蛋白。因?yàn)楫愒淳酆象w蛋白既能親和吸附ni-ntacolumn，又能親和吸附streptraphpcolumn。

在一種實(shí)施方式中，所述純化，先利用蛋白純化儀連接鎳柱ni-nta純化帶有組氨酸標(biāo)簽的蛋白；由于所表達(dá)的這兩個氨基酸序列不同的(s)-羰基還原酶會形成異源聚合體，因此在這一步中有部分帶有strep標(biāo)簽的蛋白也會被ni-nta結(jié)合；接著將結(jié)合在ni-nta柱子上的蛋白用含有咪唑的緩沖洗脫，將獲得的收集液流經(jīng)已經(jīng)用緩沖平衡好的streptraphpcolumn上，最后用含有脫硫生物素的緩沖將目的蛋白洗脫，獲得異源聚合體蛋白。

在一種實(shí)施方式中，所述方法具體是：將來源于近平滑假絲酵母的(s)-羰基還原酶scr、scr2、scr3中的任意兩種，分別連接到表達(dá)載體上并進(jìn)一步構(gòu)建帶有不同純化標(biāo)簽的含有目的基因的兩個重組質(zhì)粒，得到pet21-strep-scr、pet28-his-scr2、pet28-his-scr3、pet21-strep-scr2，然后將pet21-strep-scr與pet28-his-scr2，或者pet28-his-scr3與pet21-strep-scr2共同轉(zhuǎn)化到同一宿主細(xì)胞大腸桿菌中，篩選具有雙質(zhì)粒的重組大腸桿菌；重組菌發(fā)酵表達(dá)，純化得到異源聚合體蛋白復(fù)合物。

在一種實(shí)施方式中，所述發(fā)酵表達(dá)，是將重組大腸桿菌接種于lb培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，然后轉(zhuǎn)接于lb培養(yǎng)基中，于37℃，200rpm振蕩培養(yǎng)至od達(dá)到0.6-0.8時，加入一定濃度iptg誘導(dǎo)12h。

本發(fā)明的第三個目的是提供表達(dá)所述異源聚合體蛋白復(fù)合物的重組菌。

在一種實(shí)施方式中，所述重組菌是將兩個以上氨基酸序列不同的(s)-羰基還原酶的基因分別連接到表達(dá)載體上，然后共同轉(zhuǎn)化到同一宿主中而得到的。

在一種實(shí)施方式中，所述宿主是大腸桿菌。

在一種實(shí)施方式中，所述宿主為(e.colibl21(de3)。

在一種實(shí)施方式中，所述表達(dá)載體可以是以下任意一種或者多種：pet21、pet28和petduet。

在一種實(shí)施方式中，所述連接到表達(dá)載體上，還包括在(s)-羰基還原酶的基因前添加蛋白純化標(biāo)簽。

本發(fā)明的第四個目的是提供所述異源聚合體蛋白復(fù)合物的應(yīng)用。

在一種實(shí)施方式中，所述應(yīng)用，是應(yīng)用于催化領(lǐng)域。

在一種實(shí)施方式中，所述應(yīng)用，是應(yīng)用于精細(xì)化工品生產(chǎn)領(lǐng)域。

在一種實(shí)施方式中，所述應(yīng)用，是用于催化雙苯環(huán)類化合物。

在一種實(shí)施方式中，所述雙苯環(huán)類化合物包括但不限于2,4-二氯二苯甲酮、2-萘乙酮。

本發(fā)明的有益效果：

本發(fā)明通過共表達(dá)(s)-羰基還原酶基因簇中的兩個以上(s)-羰基還原酶基因，獲得了異源聚合體蛋白。本發(fā)明的異源聚合體蛋白具有新的性能，能夠催化雙苯環(huán)類化合物，且具有較好的催化活性。本發(fā)明的異源聚合體蛋白可以用于精細(xì)化工品生產(chǎn)領(lǐng)域。

本發(fā)明根據(jù)近平滑假絲酵母(c.parapsilosis)(s)-羰基還原酶基因簇序列scr(genbankid:dq675534)，scr2(genbankid:gq411433)和scr3(genbankid:fj939564)，通過構(gòu)建不同(s)-羰基還原酶的共表達(dá)菌株，并通過不同蛋白所帶有的不同標(biāo)簽，利用pulldown實(shí)驗(yàn)純化異源聚合體，從而獲得大量的異源聚合體蛋白。利用所獲得的異源聚合體蛋白復(fù)合物，測定聯(lián)苯化合物2,4-二氯二苯甲酮和2-萘乙酮的活性，相比于同源聚合體基因scr，scr2和scr3，可以得到較高的羰基還原酶催化活性。本發(fā)明的異源聚合體蛋白scr/scr2和scr2/scr3對聯(lián)苯化合物2,4-二氯二苯甲酮的酶活性分別為4.55u/mg、4.42u/mg，scr/scr2對聯(lián)苯化合物2-萘乙酮的酶活性為2.43u/mg。

具體實(shí)施方案

異源聚合體蛋白對不同底物的酶活力測定方法：

(1)原理：輔酶nadph被還原后，會引起340nm的吸光度的降低。因此可以通過測定反應(yīng)過程中340nm處吸光度的變化來檢測氧化還原酶的活力。

(2)測定還原酶活的條件：總反應(yīng)體積為250ul，分別加入0.5mmol/lnadph，5mmol/l底物2,4-二氯二苯甲酮或者2-萘乙酮。30℃水浴恒溫2min，加入適量酶液后開始掃描340nm處吸光度的變化。

(3)計(jì)算方法與酶活力定義

酶活計(jì)算公式：酶活(u)＝ew×v×10³/(6220×0.15)

比活的計(jì)算公式：比活(u/mg)＝酶活(u)/蛋白量(mg)

其中，ew：1min內(nèi)340nm處吸光度的變化；v:反應(yīng)液的體積(ml)；6220:摩爾消光系數(shù)(lmol^-1cm^-1)；0.15:光程距離(cm)。

羰基還原酶酶活力的定義：在上述條件下，每分鐘催化氧化1umolnadph的酶量為1個酶活單位。

下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此。

實(shí)施例1

近平滑假絲酵母(c.parapsilosis)cctccm203011的菌體培養(yǎng)，其生長培養(yǎng)基組成為：葡萄糖2％，酵母膏1％，蛋白胨2％。將近平滑假絲酵母接種于5ml試管中于28℃，200rpm振蕩培養(yǎng)16-18h。

實(shí)施例2

近平滑假絲酵母(c.parapsilosis)基因組的提?。簩?shí)施例1培養(yǎng)的菌體于6,000rpm，5min下離心，用生理鹽水洗滌兩次后，收集細(xì)胞利用基因組dna提取試劑盒g(shù)enomicdnaminipreparationkit(takara公司)提取基因組。

實(shí)施例3

從近平滑假絲酵母中調(diào)取目的基因序列，包括scr(氨基酸序列如seqidno:1所示)，scr2(氨基酸序列如seqidno:2所示)和scr3(氨基酸序列如seqidno:3所示)。

合成兩端引物(序列如seqidno:4～seqidno:11所示)

b-s-scr-f1:atcggatccgtggtctcatcctcaatttgaaaagggttctatgggcgaaatcgaatctta

x-s-scr-r1：tgactctcgagctatggacacgtgtatccacc

b-s-scr2-f1：atcggatccgtggtctcatcctcaatttgaaaagggttctatgggcgaaatcgaatctta

x-s-scr2-r1：tgactctcgagctatggacaagtgtaaccaccat

b-his-scr2-f1：cgcggatccgaaaatttatatttccagagtatgggcgaaatcgaatctta

x-his-scr2-r1：tgactctcgagctatggacacgtgtatccacc

e-his-scr3-f1：ccggaattcgaaaatttatatttccagagtatgggcgaaatcgaatctta

x-his-scr3-r1：gcccgctcgagctatggacaggtgaatccaccatc

實(shí)施例4

scr、scr2和scr3基因的獲得：采用pcr反應(yīng)體系50ul：1ul基因組，1ul引物(上下游分別1ul)，primestarhspremix25ul，滅菌的超純水22ul。pcr條件為：98℃熱變性10s；98℃10s，52℃15s，72℃1min。經(jīng)過30個循環(huán)后，最后72℃再延伸10min。利用3sspinagarosegeldnapurificationkit(上海申能博彩生物科技有限公司)純化dna片斷。

利用引物b-s-scr-f1和x-s-scr-r1擴(kuò)增得到了氮端具有修飾的鏈球菌抗生物素蛋白標(biāo)簽strep的scr基因，即strep-scr基因。利用引物b-s-scr2-f1和x-s-scr2-r1擴(kuò)增得到了氮端具有修飾的鏈球菌抗生物素蛋白標(biāo)簽的strep-scr2基因。利用引物b-his-scr2-f1和x-his-scr2-r1擴(kuò)增得到了氮端具有組氨酸標(biāo)簽的his-scr2基因。利用引物e-his-scr3-f1和x-his-scr3-r1擴(kuò)增得到了氮端具有組氨酸標(biāo)簽的his-scr3基因。

實(shí)施例5

pet21-strep-scr、pet28-his-scr2、pet28-his-scr3和pet21-strep-scr2重組質(zhì)粒的獲得scr，scr2，scr3及空質(zhì)粒pet21和pet28的酶切反應(yīng)體系。

利用bamhi、xhoi酶切pet21和strep-scr基因，酶切產(chǎn)物純化后進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化、驗(yàn)證，得到陽性質(zhì)粒pet21-strep-scr。利用bamhi、xhoi酶切pet21和strep-scr2基因，酶切產(chǎn)物純化后進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化、驗(yàn)證，得到陽性質(zhì)粒pet21-strep-scr2。利用bamhi、xhoi酶切pet28和his-scr2基因，酶切產(chǎn)物純化后進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化、驗(yàn)證，得到陽性質(zhì)粒pet28-his-scr2。利用bamhi、xhoi酶切pet28和his-scr3基因，酶切產(chǎn)物純化后進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化、驗(yàn)證，得到陽性質(zhì)粒pet28-his-scr3。

實(shí)施例6

異源表達(dá)(s)-羰基還原酶和(s)-羰基還原酶2，以及(s)-羰基還原酶2和(s)-羰基還原酶3的大腸桿菌重組菌的獲得：

利用質(zhì)粒提取試劑盒plasmidminikiti(200)(omega)從e.colijm109中提取質(zhì)粒pet21-strep-scr、pet21-strep-scr2、pet28-his-scr2和pet28-his-scr3。

在100μle.colibl21(de3)感受態(tài)細(xì)胞懸液中分別加入0.5μlpet21-strep-scr和pet28-his-scr2，同時在另外一管100μle.colibl21(de3)感受態(tài)細(xì)胞懸液中分別加入0.5μlpet21-strep-scr2和pet28-his-scr3。輕輕混勻，冰浴中靜置30min。轉(zhuǎn)入42℃水浴中，熱擊90s?？焖俎D(zhuǎn)移至冰浴冷卻2min。每管中加入700μllb液體培養(yǎng)基，37℃100rpm搖床溫育培養(yǎng)1h。培養(yǎng)后菌液5,000rpm離心2min，棄上清600μl，剩余菌液混勻后涂布到含有100μg/ml氨芐青霉素和50μg/ml卡那霉素lb雙抗性平板上，37℃倒置培養(yǎng)過夜。次日挑選單菌落進(jìn)行試管培養(yǎng)，篩選得到具有雙質(zhì)粒的重組大腸桿菌e.coli/pet21-strep-scr/pet28-his-scr2和e.coli/pet21-strep-scr2/pet28-his-scr3。

實(shí)施例7

重組菌株大腸桿菌e.coli/pet21-strep-scr/pet28-his-scr2和e.coli/pet21-strep-scr2/pet28-his-scr3的培養(yǎng)和菌體獲得：

重組菌株培養(yǎng)基(lb)組成為：1％氯化鈉、1％蛋白胨、0.5％酵母膏。重組型的大腸桿菌培養(yǎng)還需添加100μg/ml的氨芐青霉素和50μg/ml卡那霉素。

挑取陽性克隆單菌落接種于5ml含氨芐青霉素(100μg/ml)和卡那霉素(50μg/ml)的lb試管培養(yǎng)基中，于37℃，200rpm振蕩培養(yǎng)過夜。取3ml培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接于150mllb培養(yǎng)基中，于37℃，200rpm振蕩培養(yǎng)至od達(dá)到0.6-0.8時，加入iptg的濃度為0.1、0.2、0.5和1.0mm，30℃誘導(dǎo)12h。培養(yǎng)后的重組型大腸桿菌細(xì)胞于12,000rpm離心10min并用生理鹽水洗滌三次后收集。

實(shí)施例8

重組菌株大腸桿菌e.coli/pet21-strep-scr/pet28-his-scr2和e.coli/pet21-strep-scr2/pet28-his-scr3的細(xì)胞破碎：將收集好并洗滌干凈的大腸桿菌利用ni-ntacolumn的純化緩沖a液(20mmtris，150nacl，ph8.0)以1:20的比例稀釋并懸浮，然后利用磁力攪拌器把菌體充分打散，接著利用超聲破碎儀(sonic)破碎細(xì)胞(破碎2s，停4s，工作時間30min，工作強(qiáng)度40％)，釋放胞內(nèi)表達(dá)的(s)-羰基還原酶系。利用冷凍離心機(jī)將細(xì)胞破碎液以12,000rpm離心40min，然后將破碎液上清過0.22um的水系濾膜，并轉(zhuǎn)移至干凈的離心管，作為蛋白純化的樣品備用。

實(shí)施例9

異源聚合體蛋白scr/scr2和scr2/scr3的ni-ntacolumn純化：

將過膜后的細(xì)胞破碎上清液先用ni-nta純化。利用aktapurifer進(jìn)行樣品的純化，樣品流經(jīng)柱子后，先用平衡液沖洗柱子，直到紫外吸收值降低并保持平衡，接著先用40mm的咪唑緩沖液洗雜帶，然后再用200mm咪唑緩沖液將帶有組氨酸標(biāo)簽的蛋白復(fù)合物洗脫并接收相關(guān)樣品。

實(shí)施例10

異源聚合體蛋白scr/scr2和scr2/scr3的streptraphpcolumn純化：將ni-nta純化后收集的樣品繼續(xù)使用streptraphpcolumn純化。利用aktapurifer進(jìn)行樣品的純化，樣品流經(jīng)柱子后，先用平衡液沖洗柱子，直到紫外吸收值降低并保持平衡，接著先用2.5mm的脫硫生物素緩沖液將帶有strep標(biāo)簽的蛋白復(fù)合物洗脫并接收。

實(shí)施例11

異源聚合體蛋白scr/scr2和scr2/scr3對聯(lián)苯化合物2,4-二氯二苯甲酮的酶活測定。測定還原酶活的條件：總反應(yīng)體積為250ul，分別加入0.5mmol/lnadph，5mmol/l底物2,4-二氯二苯甲酮。30℃水浴恒溫2min，加入適量酶液后開始掃描340nm處吸光度的變化。最后計(jì)算得scr/scr2酶活性為4.55u/mg、scr2/scr3酶活性為4.42u/mg，而同源聚合體scr、scr2和scr3并未測到任何活性。

實(shí)施例12

異源聚合體蛋白scr/scr2和scr2/scr3對聯(lián)苯化合物2-萘乙酮的酶活測定。測定還原酶活的條件：總反應(yīng)體積為250ul，分別加入0.5mmol/lnadph，5mmol/l底物2-萘乙酮。30℃水浴恒溫2min，加入適量酶液后開始掃描340nm處吸光度的變化。最后計(jì)算得scr/scr2酶活性為2.43u/mg，而同源聚合體scr、scr2和scr3并未測到任何活性。

此外，發(fā)明人采用類似的方法，得到了異源聚合體蛋白scr2/scr3和scr/scr3，結(jié)果顯示，這兩種異源聚合體蛋白也具有一定的催化雙苯環(huán)類化合物的活性。

雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準(zhǔn)。

序列表

<110>江南大學(xué)

<120>(s)-羰基還原酶異源聚合體及其在催化多苯環(huán)化合物的應(yīng)用

<160>11

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>279

<212>prt

<213>scr

<400>1

metglygluileglusertyrcysasnlysgluleuglyproleupro

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