技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明屬于生物學(xué)領(lǐng)域，涉及一種殺蟲真菌，具體來說是一種萊氏野村菌菌株及在防治淡劍灰翅夜蛾上的應(yīng)用。

背景技術(shù)：
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利用昆蟲病原真菌防治害蟲是有害生物防治的重要手段之一，與傳統(tǒng)化學(xué)防治相比，真菌病原物具有以下優(yōu)勢：對非靶標(biāo)生物(包括人)及環(huán)境安全、造成昆蟲病害流行、不易產(chǎn)生抗藥性。因此，真菌殺蟲劑的研究開發(fā)目前受到廣泛的關(guān)注和重視。

淡劍灰翅夜蛾spodopteradepravata(名淡劍襲夜蛾sidemiadepravata)是近年來危害多種禾本科草坪草的一種重要的鱗翅目害蟲，其在日本、韓國也均有分布。在我國，該蟲被報道在上海、江蘇、湖北、湖南、浙江、福建、河北、遼寧、安徽、天津和山東等地對草坪造成嚴(yán)重危害，蟲口密度高時，可達數(shù)百頭每平方米，對草坪造成毀滅性危害，因此，該蟲是我國東部地區(qū)最為嚴(yán)重的草坪害蟲。同時，由于因其產(chǎn)卵量大、世代重疊嚴(yán)重，化學(xué)防治難度較大，目前對該蟲的防控多依靠有機磷農(nóng)藥，并不適宜在人們休閑休憩的草坪上使用，探尋安全高效的淡劍灰翅夜蛾生物防治技術(shù)的重要性日益凸顯，但目前仍缺乏有效的生物防治制劑控制該蟲。

萊氏野村菌metarhiziumrileyi是一種極具潛力的鱗翅目幼蟲病原真菌，在一定環(huán)境條件下，能形成病害流行，有效降低害蟲種群數(shù)量。已被廣泛報道可侵染夜蛾科害蟲，對斜紋夜蛾、棉鈴蟲、甜菜夜蛾、大豆夜蛾等鱗翅目害蟲有較強的致病力。由于萊氏野村菌具有一定的遺傳多樣性，不同的萊氏野村菌菌株對不同的寄主昆蟲的毒力差別很大，即使是分離自同一種寄主昆蟲的不同菌株毒力也有顯著差異?？梢姺蛛x并篩選目標(biāo)特異的萊氏野村菌菌株對于目標(biāo)害蟲的防治十分重要。但迄今為止，未見針對草坪害蟲淡劍灰翅夜蛾生物防治的萊氏野村菌的報道，因此分離并篩選對淡劍灰翅夜蛾特異性的萊氏野村菌菌株對于此蟲的生物防治十分重要。

技術(shù)實現(xiàn)要素：
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本發(fā)明的目的在于提供一種萊氏野村菌菌株及在防治淡劍灰翅夜蛾上的應(yīng)用，所述的這種萊氏野村菌菌株及在防治淡劍灰翅夜蛾上的應(yīng)用要解決現(xiàn)有技術(shù)中采用化學(xué)農(nóng)藥防治草坪害蟲淡劍灰翅夜蛾污染環(huán)境、易產(chǎn)生抗藥性的技術(shù)問題。

本發(fā)明提供了一種萊氏野村菌菌株，其保藏編號為cgmccno.13564，屬于半知菌綱、絲孢目、淡色菌科、綠僵菌屬，分類命名metarhiziumrileyi。

本發(fā)明還提供了上述的萊氏野村菌菌株在防治淡劍灰翅夜蛾中的用途。

本發(fā)明的萊氏野村菌菌株(dt2011n7)，屬于半知菌綱、絲孢目、淡色菌科、綠僵菌屬，分類命名metarhiziumrileyi。該菌株保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(cgmcc)，地址為：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號(中國科學(xué)院微生物研究所，郵編：100101)，保藏日期為2017年2月7號，保藏編號為cgmccno.13564。

本發(fā)明從野外自然侵染的淡劍灰翅夜蛾罹病蟲體中分離純化多株真菌菌株，經(jīng)過室內(nèi)毒力篩選得到其中毒力較高的菌株dt2011n7。經(jīng)形態(tài)鑒定并結(jié)合its序列比對，將其鑒定為萊氏野村菌。進一步的野外防治實驗證明了菌株dt2011n7對草坪害蟲淡劍灰翅夜蛾的有較好的防治效果和持效期。

本發(fā)明菌株dt2011n7的rdna(核糖體脫氧核糖核酸)its(內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū))序列全長619bp(堿基)，如seqidno.1所示，在ncbi數(shù)據(jù)庫中blast比對，未發(fā)現(xiàn)完全相同的序列。與其its序列最相近的種為萊氏野村菌metarhiziumrileyi，相似度達99％。結(jié)合菌株的形態(tài)特征，將菌株dt2011n7鑒定為萊氏野村菌metarhiziumrileyi的一株新菌株。

本發(fā)明和已有技術(shù)相比，其技術(shù)效果是積極和明顯的。前人利用萊氏野村菌多用于防治斜紋夜蛾，未見有利用此菌防治草坪害蟲淡劍灰翅夜蛾的報道。本發(fā)明通過室內(nèi)毒力試驗，從5株分離純化的萊氏野村菌菌株中篩選出毒力最高的菌株dt2011n7，25℃下其對淡劍灰翅夜蛾的致死中時為4.47d。野外防治試驗表明菌株dt2011n7藥后7d開始表現(xiàn)出明顯的防治效果，校正防效達到78.53％，藥后10d達到最好防效89.85％，藥后20d仍具有46.17％的防效。表明本發(fā)明菌株dt2011n7對淡劍灰翅夜蛾具有良好的殺蟲活性和持效性，具有很好的開發(fā)利用潛力。

說明書附圖：

圖1是本發(fā)明的一種萊氏野村菌菌株dt2011n7的菌落形態(tài)照片。

圖2是本發(fā)明的一種萊氏野村菌菌株dt2011n7的菌絲體和孢子形態(tài)的顯微照片。

具體實施方式：

實施例1侵染淡劍灰翅夜蛾的萊氏野村菌菌株的分離與鑒定

1.1菌株分離

罹病淡劍灰翅夜蛾采集自上海。接種環(huán)蘸取少量罹病蟲體體表孢子，采用平板劃線分離法于含0.3％乳酸的pda平板進行病原菌分離，25℃恒溫培養(yǎng)3～5d，挑取單菌落，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2供試培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(potatodextroseagar，pda)：去皮馬鈴薯200g煮沸后過濾取濾液、葡萄糖20g、瓊脂粉16g，加水定容至1000ml；

薩氏麥芽糖酵母浸粉培養(yǎng)基(sabouraudmaltoseagarwithyeastextract，smay)：麥芽糖提取物40g、蛋白胨10g、酵母粉10g、瓊脂粉16g，加水定容至1000ml。

1.3病原菌的回接試驗及形態(tài)學(xué)觀察

將4℃冰箱保存的菌株于smay平板25℃恒溫培養(yǎng)7～10d，產(chǎn)孢待用。

用含0.05％吐溫80的無菌水洗脫孢子，制備濃度為1×10⁸個/ml的孢子懸浮液。取淡劍灰翅夜蛾3齡幼蟲10頭，采用孢子懸浮液浸漬法回接試蟲。將試蟲放入已配好的待測孢子懸浮液中浸蘸10s后，置于無菌濾紙上，任其爬行晾干水分，移入滅菌的養(yǎng)蟲盒中，每蟲1盒。用含0.05％吐溫80的無菌水處理對照試蟲。將上述試蟲置于l:d＝14:10光照，溫度25℃，濕度75％的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。試蟲感染死亡后，對罹病蟲體再次分離病原菌。

將菌株轉(zhuǎn)接至smay平板上25℃恒溫培養(yǎng)5d，肉眼觀察菌落特征；7～10d產(chǎn)孢后，制備臨時玻片，在光學(xué)顯微鏡下觀察菌絲及孢子形態(tài)特征；拍攝分生孢子照片，選取不同大小分生孢子100個，測量分生孢子的長度和寬度。

1.4病原菌的分子鑒定

用l型玻棒蘸取孢子懸浮液，均勻涂布于smay平板，25℃恒溫培養(yǎng)5～7d至菌絲長滿平板。在平板上倒入液氮，用滅菌載玻片刮取平板表面菌絲，轉(zhuǎn)移至研缽，加入少量滅菌石英砂，研磨菌絲至細(xì)粉狀，依據(jù)改良ctab法提取dna。

采用真菌通用引物its1/its4擴增核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internaltranscribedspacer，its)序列。its1(5′tccgtaggtgaacctgcgg3′)，its4(5′tcctccgcttattgatatgc3′)。pcr反應(yīng)體系總體積25μl，包括：10×pcrbuffer2.5μl、dntpmix(各25mm)2μl、mgcl2(25mmol/l)1.5μl、引物its1-fungl/its4(20μmol/l)各0.5μl、dna模板0.5μl(50ng/μl)、rtaq(5u/μl)0.125μl。反應(yīng)程序為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性15s，50℃退火45s，72℃延伸45s，35個循環(huán)；72℃延伸5min。

擴增后用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測pcr產(chǎn)物，并用dna凝膠回收試劑盒回收純化，純化后dna片段通過pmd19-tvector載體轉(zhuǎn)入到j(luò)m109大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中進行克隆，藍白斑篩選后獲得陽性單克隆。將單克隆送往上海生工生物技術(shù)有限公司測序。將its基因片段的測序結(jié)果在ncbi數(shù)據(jù)庫中進行blast比對。

1.5形態(tài)鑒定及致病性測定結(jié)果

dt2011n7在smay培養(yǎng)基上，菌落早期為白色，產(chǎn)孢后菌絲上密布淡綠色孢子(圖1)。顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，菌絲光滑有分隔，分生孢子梗呈穗狀，每個分支上有數(shù)個瓶梗，瓶梗短圓柱形，近基部略膨大，頂部短尖。分生孢子著生于頂部短尖處(圖2)，多為橢圓形，光滑，大小為3.5～5.5×2.0～2.8μm。形態(tài)特征與前人對萊氏野村菌的描述基本一致。

采用浸漬接種法處理試蟲3～8d后，其受侵染死亡，體僵硬，表面密布白色菌絲，后期表面密布淡綠色孢子；從罹病蟲體分離獲得菌株與保存菌株dt2011n7形態(tài)特征一致。

1.6分子鑒定結(jié)果

測序獲得來自菌株dt2011n7的長度為619bp的its序列，將此序列在ncbi數(shù)據(jù)庫進行blast比對，結(jié)果顯示菌株dt2011n7的its序列與m.rileyi一致性達99％。

1.7菌株鑒定結(jié)果

結(jié)合形態(tài)鑒定及分子鑒定結(jié)果，將菌株dt2011n7鑒定為一株可使草坪害蟲淡劍灰翅夜蛾致病的萊氏野村菌m.rileyi。

菌株dt2011n7保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(cgmcc)，保藏日期為2017年2月7號，保藏編號為cgmccno.13564。

實施例2室內(nèi)毒力測定篩選對淡劍灰翅夜蛾高毒力菌株dt2011n7

2.1供試材料

供試菌株：野外采集罹病淡劍灰翅夜蛾，按照前述1.1的方法進行菌株分離。隨機挑選其中5株分離獲得的萊氏野村菌菌株dt2011n7，xw-dsn6，dt2014-1，dt2014-3，xw-dsn1進行對淡劍灰翅夜蛾的室內(nèi)毒力測定。

供試?yán)ハx：野外采集淡劍灰翅夜蛾蟲卵，自然孵化后，將幼蟲轉(zhuǎn)移至養(yǎng)蟲盒，置于光照培養(yǎng)箱中，光照l:d＝14:10，濕度75％，溫度25℃，以禾本科草坪草為飼料人工飼養(yǎng)，至成蟲羽化后交尾產(chǎn)卵，取下一代3齡幼蟲作為供試蟲。

2.2室內(nèi)毒力測定

在smay平板上活化供試菌株，10～15d待孢子長滿平板后，用含0.05％吐溫80的無菌水洗脫孢子，制備濃度為1×10⁸個/ml的孢子懸浮液。采用浸漬法接種供試3齡淡劍灰翅夜蛾幼蟲，每個處理3個重復(fù)，每個重復(fù)接種20頭試蟲。將上述試蟲置于l:d＝14:10光照，溫度25℃，濕度75％的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每天觀察記錄試蟲的死亡情況，計算校正死亡率。使用統(tǒng)計軟件sas8.1計算致死中時lt50。

2.3室內(nèi)毒力測定結(jié)果

表1.萊氏野村菌不同菌株室內(nèi)毒力測定結(jié)果

表1結(jié)果表明，5株萊氏野村菌菌株接種淡劍灰翅夜蛾后，均在4～5d達到對試蟲的致死中時，其中dt2011n7的致死中時最短，為4.47d，表明dt2011n7對淡劍灰翅夜蛾具有較強的致病力。

實施例3dt2011n7對淡劍灰翅夜蛾的野外防治效果

3.1供試材料

dt2011n7于smay培養(yǎng)基上25℃下恒溫培養(yǎng)10～15天。用含0.05％吐溫80的無菌水洗脫孢子，制備濃度為1×10⁸個/ml的孢子懸浮液，用此孢子懸浮液10稀釋制備1×10⁷個/ml的孢子懸浮液。對照供試藥劑為1000倍48％毒死蜱乳油(陶氏益農(nóng))。

3.2試驗設(shè)置

野外試驗于2016年9月在上海辰山植物園矮生百慕達草坪上進行。3個處理(1000倍48％毒死蜱乳油稀釋液、1×10⁸個/ml萊氏野村菌孢子懸浮液、1×10⁷個/ml萊氏野村菌孢子懸浮液)，每處理3個重復(fù)，每個小區(qū)20m²，小區(qū)內(nèi)9點棋盤式取樣，每樣方20cm*20cm，計數(shù)樣方內(nèi)的活蟲數(shù)量。設(shè)置清水空白對照。施藥前調(diào)查各處理小區(qū)內(nèi)蟲口基數(shù)，藥后3d、7d、10d、20d再分別調(diào)查樣區(qū)內(nèi)活蟲數(shù)，計算各處理的蟲口減退率及校正防效，同時記錄實驗期間氣溫變化情況。應(yīng)用excel2007計算蟲口減退率及校正防效，使用sas8.1數(shù)據(jù)處理軟件進行單因素方差分析。

3.3試驗結(jié)果

萊氏野村菌dt2011n7對淡劍灰翅夜蛾防效的野外防治結(jié)果見表2，dt2011n7在藥后3d無效果，藥后7d開始表現(xiàn)出明顯的防治效果，1×10⁸個/ml和1×10⁷個/ml孢子懸浮液的校正防效分別達到78.53％和54.29％。藥后10d達到最好防效，1×10⁸個/ml和1×10⁷個/ml孢子懸浮液的校正防效分別達到79.33％和89.85％。藥后20d后dt2011n7對淡劍灰翅夜蛾仍有一定的防效，1×10⁸個/ml和1×10⁷個/ml孢子懸浮液的校正防效分別為46.17％和41.55％。

表2dt2011n7對淡劍灰翅夜蛾的野外防治效果

注：表中數(shù)據(jù)為三次重復(fù)的平均值，同列不同字母代表不同處理間有顯著性差異(p＜0.05)。

上述結(jié)果表明，在適溫條件下，萊氏野村菌dt2011n7表現(xiàn)出對淡劍灰翅夜蛾良好的殺蟲活性和持效性，具有很好的開發(fā)利用的潛力。

序列表

<110>上海市園林科學(xué)規(guī)劃研究院

<120>一種萊氏野村菌菌株及在防治淡劍灰翅夜蛾上的應(yīng)用

<160>3

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>619

<212>dna

<213>dt2011n7真菌核糖體脫氧核糖核酸內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)

<400>1

tccgtaggtgaacctgcggagggatcattaccgagtttacaactcccaaaccccatgtga60

acttatacccttttcctgttgcctcggcgggtcatttgccccggaccgggctcgtccaga120

gcccgcccggaaacaggcgcccgccgcgggaccgaaactctgtatctcttagcctttggc180

acgtctgagtggaatcatacaaaaatgaatcaaaactttcaacaacggatctcttggttc240

tggcatcgatgaagaacgcagcgaaatgcgataagtaatgtgaattgcagaattcagtga300

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gggccgctcaggcggttccctgcggcgccgcccccgaaatgaattggcggccccgtcgcg480

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<400>2

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<400>3

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