本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種熒光標(biāo)記的含糖醛酸的糖分子及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

動植物和微生物中含有糖醛酸的糖分子種類較多，如動物體內(nèi)的糖胺聚糖(肝素、乙酰肝素、硫酸軟骨素abcde、硫酸角質(zhì)素等)、陸生植物中的果膠、海洋藻類中的褐藻膠、褐藻糖膠及其低聚物和衍生物等，這些酸性多糖具有多種生物學(xué)活性。如肝素和低分子肝素具有抗凝和抗血栓活性，硫酸軟骨素具有抗神經(jīng)炎和降血脂活性，柑橘果膠具有抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的功能，以褐藻膠為原料開發(fā)的海洋糖類藥物藻酸雙酯鈉、甘糖酯等具有抗腦血栓、腦缺血及高血壓、高脂血癥、冠心病、心絞痛等疾病。以巖藻聚糖硫酸酯為原料開發(fā)的海昆腎喜膠囊具有抗慢性腎功能衰竭癥等，這些糖藥物分子中均含有豐富的羧基。然而糖類化合物尤其是多糖由于結(jié)構(gòu)復(fù)雜，沒有特定的紫外吸收光譜，使得微量檢測困難，進而限制了其體內(nèi)藥代動力學(xué)研究并成為糖藥物開發(fā)的瓶頸。傳統(tǒng)的糖類藥物代謝動力學(xué)研究方法有同位素標(biāo)記法、免疫學(xué)法、色譜分析法等，由于過程繁瑣，靈敏度低，結(jié)果重復(fù)性差而受到限制。

熒光標(biāo)記及活體成像檢測技術(shù)由于靈敏度高，檢測結(jié)果直觀，已廣泛用于生命科學(xué)研究及藥物開發(fā)中。研究表明，cy7可對姜黃素進行熒光標(biāo)記，并利用活體成像技術(shù)對姜黃素在小鼠體內(nèi)分布情況進行實時檢測，表明該技術(shù)可對姜黃素在小鼠體內(nèi)代謝進行研究(孫永等，南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2011，27(6):539-541)。但是，對于糖類化合物特別是含有糖醛酸的糖分子是否能采用類似技術(shù)進行熒光標(biāo)記，并研究其在活體內(nèi)的藥代動力學(xué)特點及組織和器官分布尚無專利或文獻報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對含糖醛酸類糖分子體內(nèi)代謝和組織器官分布研究方法不靈敏的問題，本發(fā)明提供了一種熒光標(biāo)記的含糖醛酸的糖分子及其制備方法和應(yīng)用，本發(fā)明能彌補現(xiàn)有技術(shù)存在的不足之處。本發(fā)明所提供的熒光標(biāo)記及純化方法簡單，效率高，熒光信號強，檢測靈敏度高，結(jié)果重現(xiàn)性和可視性好，尤其是對于未知結(jié)構(gòu)的糖分子藥代動力學(xué)研究具有明顯的優(yōu)勢。

為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用下述技術(shù)方案予以實現(xiàn)：

本發(fā)明提供了一種熒光標(biāo)記的含糖醛酸的糖分子，所述熒光標(biāo)記的含糖醛酸的糖分子經(jīng)過如下標(biāo)記過程獲得：

其中，所述r為含有羧基的多糖、低聚糖、寡糖或糖衍生物分子，所述熒光分子為具有氨基的花青染料cy3、cy5和cy7中的至少一種。

本發(fā)明還提供了所述的熒光標(biāo)記的含糖醛酸的糖分子的制備方法，它包括以下步驟：(1)羧基活化：將含糖醛酸的糖分子溶解在2-嗎啉乙烷磺酸緩沖液中，再加入1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亞胺和n-羥基琥珀酰亞胺，混合均勻形成反應(yīng)體系，攪拌反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后用透析袋透析或凝膠色譜柱純化，透析液或糖分子洗脫組分減壓濃縮后冷凍干燥得活化的糖分子；

(2)熒光標(biāo)記：將步驟(1)活化的糖分子溶解在磷酸鹽緩沖液中，加入含有-nh2的熒光分子，形成總反應(yīng)溶液，攪拌反應(yīng)2～24h，濃縮，將濃縮液轉(zhuǎn)移至透析袋中透析脫鹽，透析內(nèi)液減壓濃縮，干燥后得熒光標(biāo)記的含糖醛酸的糖分子。

進一步的：所述步驟(1)中1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亞胺和n-羥基琥珀酰亞胺在反應(yīng)體系中的摩爾濃度均為糖分子中羧基占反應(yīng)體系的摩爾濃度的2～20倍，反應(yīng)時間為2～24h。

進一步的：所述步驟(2)中加入的熒光分子在總反應(yīng)溶液的最終摩爾濃度為羧基占反應(yīng)體系的摩爾濃度的0.1～10倍。

進一步的：將步驟(2)所述熒光標(biāo)記的含糖醛酸的糖分子進行如下純化步驟：將熒光標(biāo)記的含糖醛酸的糖分子用凝膠色譜柱純化，采用示差檢測器和熒光檢測器聯(lián)用檢測，收集示差檢測器和熒光檢測器重合信號峰；

或?qū)⒉襟E(2)所得熒光標(biāo)記的糖分子經(jīng)透析袋透析，檢測透析外液電導(dǎo)率不再變化，糖分子組分經(jīng)減壓濃縮后冷凍干燥得熒光標(biāo)記的糖分子。

進一步的：所述凝膠色譜柱填料為sephadexg-10、sephadexg-15、sephadexg-25或biogelp2、p4或p6。

進一步的：所述步驟透析袋的截留分子量為1kda～10kda。

本發(fā)明還提供了所述的熒光標(biāo)記的含糖醛酸的糖分子在制備用于檢測糖分子在體內(nèi)代謝的檢測劑中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了所述的熒光標(biāo)記的含糖醛酸的糖分子在制備用于檢測糖分子在組織器官中分布的檢測劑中的應(yīng)用。

進一步的：所述熒光標(biāo)記的含糖醛酸的糖分子的檢測時間為0.01～24h。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點及積極效果是：本發(fā)明提供的含糖醛酸類糖分子的熒光標(biāo)記技術(shù)操作簡單，適用于任一含有糖醛酸的多糖、低聚糖、寡糖及其衍生物分子，具有普遍實用性，且標(biāo)記產(chǎn)物純度高，標(biāo)記后保持分子原型。本發(fā)明制備的熒光標(biāo)記糖分子經(jīng)動物活體成像技術(shù)檢測在動物體內(nèi)的組織及器官分布證實具有熒光信號強，檢測靈敏度高，可視性強等優(yōu)點，為含糖醛酸類糖藥物活體代謝研究提供了新的方法，具有廣闊的應(yīng)用前景。

結(jié)合附圖閱讀本發(fā)明的具體實施方式后，本發(fā)明的其它優(yōu)點和特點將變得更加清晰。

附圖說明

圖1為本發(fā)明熒光標(biāo)記糖分子在小鼠體內(nèi)不同時間組織器官分布圖。

圖2為本發(fā)明熒光標(biāo)記糖分子在不同器官分布檢測圖。

具體實施方式

下面結(jié)合附圖和具體實施方式對本發(fā)明的技術(shù)方案做進一步的詳細(xì)說明。

本發(fā)明采用1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亞胺(edc)和n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)對糖分子的羧基進行活化，再與含有氨基的熒光分子縮合，獲得熒光標(biāo)記糖分子，具體標(biāo)記過程如下所示：

其中，所述r為含有糖醛酸的多糖、低聚糖、寡糖或糖衍生物分子，所述熒光分子為具有氨基的花青染料cy3、cy5和cy7中的至少一種。

實施例1：含糖醛酸類糖分子的熒光標(biāo)記

1、將50mg巖藻聚糖硫酸酯溶解在1ml0.1mol/lph＝5.0的2-嗎啉乙烷磺酸(mes)緩沖液中，再加入1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亞胺(edc)和n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)，混合均勻形成反應(yīng)體系，使edc和nhs的摩爾濃度分別均為巖藻聚糖硫酸酯分子中羧基摩爾濃度的5倍，攪拌反應(yīng)12h，反應(yīng)結(jié)束用7kda的透析袋透析脫鹽，透析內(nèi)液經(jīng)濃縮后冷凍干燥得nhs活化的糖分子。

2、取步驟1中經(jīng)nhs活化的巖藻聚糖硫酸酯適量，加入1ml0.1mol/lph＝7.2的磷酸鹽緩沖液溶解，再加入含有氨基的熒光分子cy7，攪拌反應(yīng)12h，利用糖分子中經(jīng)過活化的羧基與熒光試劑的氨基發(fā)生縮合反應(yīng)對糖分子進行熒光標(biāo)記，濃縮，將濃縮液轉(zhuǎn)移至7kda透析袋中透析脫鹽，透析內(nèi)液減壓濃縮，干燥后得熒光標(biāo)記的巖藻聚糖硫酸酯。

3、取步驟1所述巖藻聚糖硫酸酯，以及步驟2所述熒光標(biāo)記的巖藻聚糖硫酸酯進行分子量分析，色譜柱為ohpaksb-802.5hq與ohpaksb-804hq凝膠色譜柱串聯(lián)，以0.1mol/l硫酸鈉水溶液為流動相，采用示差檢測器-多角激光散射儀聯(lián)用在線檢測，計算巖藻聚糖硫酸酯標(biāo)記過程中的重均分子量和數(shù)均分子量。

本實施例所述的含有氨基的熒光分子cy7可改用具有氨基的熒光分子cy3、cy5或其它可用于動物活體成像檢測的熒光試劑；所述純化用透析袋的截留分子量可改用1kda～10kda的任意一種；所述分子量測定用的凝膠色譜柱可改用ohpaksb-802hq、ohpaksb-806hq、tsk-gelg3000pw/g3000pwxl或splaquagel-ohmixed中的一種或兩種串聯(lián)。

本發(fā)明將糖醛酸類糖分子的羧基基團通過nhs活化，進一步與熒光試劑分子中的氨基發(fā)生縮合反應(yīng)，從而將熒光分子引入糖分子而實現(xiàn)糖分子的熒光標(biāo)記，由于反應(yīng)產(chǎn)物水溶性強，可以通過透析或凝膠柱層析純化，反應(yīng)效率高，操作簡單。

實施例2：熒光標(biāo)記的含糖醛酸的糖分子在檢測糖分子的代謝動力學(xué)和組織及器官分布中的應(yīng)用

1、將熒光標(biāo)記的糖分子用生理鹽水配制為5mg/ml水溶液，生理鹽水作為空白對照組，按照0.1ml/10g體重劑量裸鼠尾靜脈注射。

2、在步驟1注射后分別于0、15min、30min、45min、1h、1.5h、2h、2.5h和3h麻醉實驗裸鼠，使用小動物活體成像系統(tǒng)對各實驗組受試藥在小鼠體內(nèi)的組織分布情況進行觀察，分別拍照記錄裸鼠腹部和背部不同時間的熒光信號。

3、活體成像觀察結(jié)束后將各組實驗裸鼠處死后解剖，分別取腦、心臟、肺臟、肝臟和腎臟采用活體成像系統(tǒng)觀察拍照，記錄不同器官熒光信號。

本發(fā)明中熒光標(biāo)記糖分子不同時間在實驗鼠體內(nèi)分布情況如圖1所示，從圖1可以看出標(biāo)記的糖分子靜脈注射進入小鼠體內(nèi)后，15min～3h內(nèi)均可以檢測到熒光信號，且隨著時間的延長，信號逐漸向腎臟聚集，呈現(xiàn)腎排泄的特征。同時發(fā)現(xiàn)標(biāo)記糖分子在3h以內(nèi)，糖分子與熒光分子未發(fā)生脫離，表明該熒光標(biāo)記方法適合代謝過程中藥物分子的示蹤檢測。本發(fā)明標(biāo)記糖分子在各器官的熒光信號分布檢測結(jié)果如圖2所示。從圖2結(jié)果可進一步說明標(biāo)記糖分子3h以后主要集中于腎臟部位。根據(jù)需要，標(biāo)記糖分子的代謝和組織器官分布情況可以連續(xù)檢測24小時。

綜上，本發(fā)明所述方法通過對糖分子的羧基進行活化，再與熒光分子中的氨基發(fā)生縮合反應(yīng)，并通過透析及凝膠柱層析純化，實現(xiàn)了對含糖醛酸的糖分子的快速熒光標(biāo)記，利用動物活體成像技術(shù)實現(xiàn)了標(biāo)記糖分子在動物體內(nèi)的藥代動力學(xué)特征及組織和器官分布分析。

本發(fā)明建立的熒光標(biāo)記方法適用于任何含有糖醛酸的糖分子，具有普適性強，靈敏度高，結(jié)果直觀可靠等特點，應(yīng)用前景廣闊。

以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對其進行限制；盡管參照前述實施例對本發(fā)明進行了詳細(xì)的說明，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，依然可以對前述實施例中所記載的技術(shù)方案進行修改，或者對其中部分技術(shù)特征進行等同替換；而這些修改或替換，并不使相應(yīng)技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明所要求保護的技術(shù)方案的精神和范圍。