本發(fā)明涉及dna氧化損傷檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，涉及一種檢測氧化損傷dna的方法。

背景技術(shù)：

dna(deoxyribonucleicacid，脫氧核糖核酸)是真核生物遺傳信息載體，其完整性對生物生存、正常繁衍至關(guān)重要。dna氧化損傷在疾病形成和人體衰老中扮演重要角色，研究發(fā)現(xiàn)，dna氧化損傷和阿爾茲海默病、帕金森癥、糖尿病、代謝綜合征、動(dòng)脈粥樣硬化等老年疾病有關(guān)。自身引發(fā)dna損傷的機(jī)制主要是由于細(xì)胞線粒體有氧呼吸產(chǎn)生atp過程中伴隨著氧化磷酸化，氧氣作為最終的電子受體被還原成水，在電子傳遞過程中，電子結(jié)合氧分子產(chǎn)生超氧自由基，對dna造成氧化損傷。由于人細(xì)胞的基因組提取濃度很低，損傷的堿基濃度更低，造成檢測不便，其次，在檢測過程中，存在樣本堿基的干擾，根據(jù)損傷程度不同檢測信號也有區(qū)別，所以建立一種高靈敏度和特異性的dna氧化損傷程度檢測方法非常重要。

現(xiàn)有技術(shù)中對氧化損傷dna的檢測主要是利用共價(jià)反應(yīng)探針和非共價(jià)反應(yīng)探針檢測材料進(jìn)行檢測。

1、共價(jià)反應(yīng)探針檢測：

核糖殘基上醛基基團(tuán)與酰肼/異亞硝基上氨基基團(tuán)發(fā)生縮合反應(yīng)，將與后者相連接的標(biāo)記分子結(jié)合到脫堿基位點(diǎn)上。根據(jù)標(biāo)記分子的不同，采用相應(yīng)的檢測方法。如果標(biāo)記分子是熒光、電化學(xué)等信號基團(tuán)，則可直接進(jìn)行信號檢測。

(1)醛基反應(yīng)探針(arp)

脫堿基位點(diǎn)的醛基反應(yīng)探針arp(n-(aminooxyacetyl)-n'-(d-biotinoyl)hydrazine,trifluoroaceticacidsalt，n’-氨氧基甲基羰基肼-d-生物素)由生物素酰肼與對-羧甲基羥胺在碳化二亞胺存在下反應(yīng)生成對-烷基羥胺衍生物，然后將生物素酰肼的聯(lián)氨轉(zhuǎn)換為羥胺而得到。arp的羥胺與普通脫堿基位點(diǎn)的醛基進(jìn)行縮合反應(yīng)，將生物素共價(jià)標(biāo)記在脫堿基位點(diǎn)。標(biāo)記上的生物素利用生物素/親和素-辣根過氧化物酶檢測。

(2)arp氨氧基處引入疏水或親水基團(tuán)

以此增加堿基堆積效應(yīng)或靜電引力，從而提高arp分子與脫堿基位點(diǎn)的作用強(qiáng)度及率。在arp分子內(nèi)引入萘及胍基團(tuán)，由于萘與脫堿基位點(diǎn)臨近堿基或堿基對的堆積力強(qiáng)，胍基團(tuán)與磷酸骨架的氫鍵作用及靜電作用，提高了羥胺與醛基結(jié)合效率，改善了arp探針檢測脫堿基位點(diǎn)的靈敏度。

(3)熒光性arp探針

模仿arp標(biāo)記方式，基于氨醛縮合反應(yīng)，合成了連接著羥亞胺基的farp(熒光性arp)探針。farp與脫堿基位點(diǎn)發(fā)生氨醛縮合反應(yīng)后，將熒光分子(麗絲胺-羅丹明b-羥亞胺、丹酰)共價(jià)標(biāo)記到脫堿基位點(diǎn)上，根據(jù)熒光信號變化來實(shí)現(xiàn)對脫堿基位點(diǎn)的檢測。

(4)熒光共振能量轉(zhuǎn)移檢測

同時(shí)將兩個(gè)farp探針分別共價(jià)連接到位置臨近的兩個(gè)脫堿基位點(diǎn)，其中一個(gè)farp基團(tuán)(熒光供體)的發(fā)射波譜與另一個(gè)farp基團(tuán)(熒光受體)的激發(fā)波譜重疊。用供體的激發(fā)波長激發(fā)時(shí)，如果有相臨的脫堿基位點(diǎn)存在，檢測得到受體的發(fā)射波譜。

2、非共價(jià)反應(yīng)探針檢測：

堿基脫落后形成的脫堿基位點(diǎn)使局部氫鍵作用力、堿基堆積力失衡，導(dǎo)致dna局部結(jié)構(gòu)甚至整體結(jié)構(gòu)趨于不穩(wěn)定。小分子進(jìn)入脫堿基位點(diǎn)形成的空腔后，能夠彌補(bǔ)這些弱相互作用力，從而利于dna結(jié)構(gòu)趨于穩(wěn)定。非共價(jià)探針進(jìn)入脫堿基位點(diǎn)空腔，參與分子間氫鍵、范德華力、靜電引力、堿基堆積力等非共價(jià)弱相互作用，導(dǎo)致探針信號發(fā)生變化，實(shí)現(xiàn)脫堿基位點(diǎn)的檢測。

(1)c5-呋喃環(huán)的嘧啶衍生物

檢測脫堿基位點(diǎn)的一種典型非共價(jià)熒光探針。使用c5-呋喃環(huán)衍生物取代dna序列中的正常堿基形成c5-呋喃環(huán)衍生物修飾dna序列。此修飾序列與互補(bǔ)dna序列互不配對形成雙螺旋結(jié)構(gòu)時(shí)，c5-呋喃環(huán)衍生物對面位置為腺嘌呤a時(shí)，其熒光信號被淬滅。而當(dāng)互補(bǔ)堿基脫落成脫堿基位點(diǎn)，其熒光信號相比于對面為腺嘌呤時(shí)增強(qiáng)7倍，根據(jù)此熒光信號變化可檢測脫堿基位點(diǎn)。

(2)電化學(xué)活性的雷德蒙紅

固定在金電極表面dna序列含有脫堿基位點(diǎn)時(shí)，雷德蒙紅進(jìn)入空腔結(jié)構(gòu)，參與堿基堆積作用，產(chǎn)生穩(wěn)定、可逆的電流信號，明顯高于正常堿基的情況，從而實(shí)現(xiàn)堿基脫落位點(diǎn)的檢測。

(3)金屬銠配合物

rh(bpy)2(chrysi)³⁺能夠進(jìn)入脫堿基位點(diǎn)，并在光催化作用下切斷dna骨架?；谶@一發(fā)現(xiàn)，并利用核酸的常規(guī)生物學(xué)檢測方法，實(shí)現(xiàn)rh(bpy)2(chrysi)³⁺金屬嵌入劑對脫堿基位點(diǎn)及單堿基凸起微摩爾級的檢測。

綜上，對氧化損傷dna的現(xiàn)有檢測方法及其優(yōu)缺點(diǎn)如表1所示。

表1現(xiàn)有檢測技術(shù)及其優(yōu)缺點(diǎn)

有鑒于此，特提出本發(fā)明。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種檢測氧化損傷dna的方法，該檢測方法靈敏度高、特異性強(qiáng)，對氧化損傷dna的檢測限低，背景溶液對檢測信號干擾小。

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，特采用以下技術(shù)方案：

一種檢測氧化損傷dna的方法，包括以下步驟：

(a)獲得含3’,5’磷酸基團(tuán)核苷酸空隙的dna：在dna樣品中加入dna修復(fù)酶識(shí)別并切除被氧化的dna堿基，在dna鏈的氧化位點(diǎn)處形成脫嘌呤或脫嘧啶位點(diǎn)，進(jìn)而獲得含3’,5’磷酸基團(tuán)核苷酸空隙的dna；

(b)在3’,5’位點(diǎn)引入羥基：在步驟(a)得到的含3’,5’磷酸基團(tuán)核苷酸空隙的dna中加入堿性磷酸酶脫磷酸，獲得含3’,5’羥基基團(tuán)核苷酸空隙的dna；

(c)引入熒光標(biāo)記物：向步驟(b)得到的含3’,5’羥基基團(tuán)核苷酸空隙的dna中加入dna聚合酶i和熒光標(biāo)記物，將熒光標(biāo)記物引入dna3’,5’羥基位點(diǎn)上，得到熒光標(biāo)記的dna；

(d)形成pfp-dna復(fù)合物：在步驟(c)得到的熒光標(biāo)記的dna中加入水溶性共軛聚合物pfp，反應(yīng)得到pfp-dna復(fù)合物；

(e)氧化損傷dna檢測：步驟(d)的pfp-dna復(fù)合物形成熒光共振能量轉(zhuǎn)移體系，使熒光標(biāo)記物的光信號放大，通過測定放大的熒光強(qiáng)度得到dna堿基氧化程度。

優(yōu)選地，在本發(fā)明提供的技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，所述dna修復(fù)酶為甲酰胺嘧啶-dna糖基化酶或核酸內(nèi)切酶viii。

優(yōu)選地，在本發(fā)明提供的技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，所述堿性磷酸酶為fastap熱敏感堿性磷酸酶。

優(yōu)選地，在本發(fā)明提供的技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，所述熒光標(biāo)記物為由熒光素-12-雙脫氧腺嘌呤三磷酸、熒光素-12-雙脫氧鳥嘌呤三磷酸、熒光素-12-雙脫氧胞嘧啶三磷酸和熒光素-12-雙脫氧尿嘧啶三磷酸配制而成的混合濃度為0.4～0.8μm的混合液。

進(jìn)一步地，在本發(fā)明提供的技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，上述檢測氧化損傷dna的方法包括以下步驟：

(a)樣品前處理：

(a’)取5μg氧化損傷dna標(biāo)準(zhǔn)樣品或檢測樣品25μl，加入0.5μl10u/μl核酸內(nèi)切酶viii、5μl核酸內(nèi)切酶viii緩沖液和20μl水，于37℃反應(yīng)90分鐘，于75℃終止反應(yīng)10分鐘；

(b’)向步驟(a’)得到的樣品中加入4μl1u/μlfastap熱敏感堿性磷酸酶、3μlfastap熱敏感堿性磷酸酶緩沖液和3μl水，于37℃反應(yīng)20分鐘，于75℃終止反應(yīng)10分鐘；

(c’)向步驟(b’)得到的樣品中加入0.2μl10u/μldna聚合酶i，2μlneb緩沖液2，20μl0.4μm的熒光素-12-雙脫氧腺嘌呤三磷酸、熒光素-12-雙脫氧鳥嘌呤三磷酸、熒光素-12-雙脫氧胞嘧啶三磷酸和熒光素-12-雙脫氧尿嘧啶三磷酸混合液和18μl水，于37℃反應(yīng)60分鐘，于75℃終止反應(yīng)20分鐘；

(d’)取步驟(c’)樣品10μl加入1μl1u/μlfastap熱敏感堿性磷酸酶、2μlfastap熱敏感堿性磷酸酶緩沖液和7μl水，于37℃反應(yīng)20分鐘，于75℃終止反應(yīng)10分鐘；

(b)樣品的檢測：

取步驟(d’)得到的樣品4μl，加入2μl7.5μm水溶性共軛聚合物pfp和194μlhepes緩沖液，室溫反應(yīng)10分鐘，進(jìn)行熒光檢測。

具體地，在本發(fā)明提供的技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，所述核酸內(nèi)切酶viii緩沖液為10倍濃縮緩沖液，其包含10mmtris–hcl、75mmnacl和1mmedta，ph為8.0±0.5。

具體地，在本發(fā)明提供的技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，所述fastap熱敏感堿性磷酸酶緩沖液為10倍濃縮緩沖液，其包含10mmtris–hcl、5mmmgcl2、100mmkcl、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.02％的tritonx-100和100g/mlbsa，ph為8.0±0.5。

具體地，在本發(fā)明提供的技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，所述neb緩沖液2包含5mmnacl、10mmtris-hcl、10mmmgcl2和1mmdtt，ph為7.9±0.5。

優(yōu)選地，在本發(fā)明提供的技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，上述檢測氧化損傷dna的方法用以下步驟替換步驟(a’)：

取5μg氧化損傷dna標(biāo)準(zhǔn)樣品或檢測樣品25μl，加入0.5μl10u/μl甲酰胺嘧啶-dna糖基化酶、5μlneb緩沖液1和20μl水，于37℃反應(yīng)90分鐘，于75℃終止反應(yīng)10分鐘；

所述neb緩沖液1包含10mmbis-tris-propane-hcl、10mmmgcl2和1mmdtt，ph為7.0±0.5。

優(yōu)選地，在本發(fā)明提供的技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，上述檢測氧化損傷dna的方法中氧化損傷dna標(biāo)準(zhǔn)樣品由芬頓反應(yīng)制得，其制備方法包括以下步驟：

(a)將提取好的基因組dna樣品稀釋至不同濃度，進(jìn)行紫外測定，得到吸光度和dna濃度關(guān)系；

(b)取10μg不同濃度的dna樣品加入50μl80μmfecl2，40μl0.5mmh2o2，100μltris-乙酸鹽緩沖液，于37℃避光反應(yīng)4小時(shí)；待反應(yīng)后迅速取出，加入20μl3m乙酸鈉溶液和500μl無水乙醇，于-20℃下反應(yīng)10分鐘；將溶液離心，析出的dna沉淀用70％乙醇洗滌；將dna沉淀晾干，用50μl水重新溶解；

(c)對步驟(b)得到的溶液進(jìn)行紫外測定，根據(jù)步驟(a)吸光度和dna濃度關(guān)系得到溶液中的dna濃度，進(jìn)而得到氧化損傷dna濃度；

所述tris-乙酸鹽緩沖液為2倍濃縮緩沖液，其包含20mmtris和13mm乙酸，ph為7.3±0.5；

所述乙酸鈉溶液的ph為5.2±0.5。

與已有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：

(1)本發(fā)明提供的方法緩解了現(xiàn)有檢測dna損傷步驟繁瑣、靈敏度低和選擇性低的缺點(diǎn)。水溶性共軛聚合物pfp具有很好的光捕獲性質(zhì)，其分子骨架吸收的能量可以轉(zhuǎn)移到受體即帶熒光標(biāo)記的dna分子上，導(dǎo)致受體的光信號放大，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)和準(zhǔn)確度高的特點(diǎn)，且檢出限低，可達(dá)到1ng/μl，背景溶液對被檢測物的干擾小。

(2)本發(fā)明方法操作簡單，容易推廣。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明實(shí)施例的技術(shù)方案，下面將對實(shí)施例中所需要使用的附圖作簡單地介紹，應(yīng)當(dāng)理解，以下附圖僅示出了本發(fā)明的某些實(shí)施例，因此不應(yīng)被看作是對范圍的限定，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他相關(guān)的附圖。

圖1為水溶性共軛聚合物pfp的結(jié)構(gòu)示意圖；

圖2為本發(fā)明檢測氧化損傷dna的方法原理圖；

圖3為不同濃度的氧化損傷dna對熒光檢測信號的影響圖；

圖4為熒光強(qiáng)度與氧化損傷dna濃度的線性關(guān)系圖；

圖5為不同濃度的pfp對熒光檢測信號的影響圖；

圖6為分別采用fpg蛋白和核酸內(nèi)切酶viii處理對熒光檢測信號的影響圖。

附圖標(biāo)記：

1-核酸內(nèi)切酶viii/fpg蛋白；2-fastap熱敏感堿性磷酸酶；3-dna聚合酶i；4-氧化堿基；5-熒光素。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，下列實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市售購買獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

本發(fā)明提供了一種檢測氧化損傷dna的方法，其中：圖1為水溶性共軛聚合物pfp的結(jié)構(gòu)示意圖；圖2為本發(fā)明檢測氧化損傷dna的方法原理圖，如圖1，2所示，本發(fā)明的檢測氧化損傷dna的方法，包括以下步驟：

(a)獲得含3’,5’磷酸基團(tuán)核苷酸空隙的dna：在dna樣品中加入dna修復(fù)酶識(shí)別并切除被氧化的dna堿基，在dna鏈的氧化位點(diǎn)處形成脫嘌呤或脫嘧啶位點(diǎn)，進(jìn)而獲得含3’,5’磷酸基團(tuán)核苷酸空隙的dna；

(b)在3’,5’位點(diǎn)引入羥基：在步驟(a)得到的含3’,5’磷酸基團(tuán)核苷酸空隙的dna中加入堿性磷酸酶脫磷酸，獲得含3’,5’羥基基團(tuán)核苷酸空隙的dna；

(c)引入熒光標(biāo)記物：向步驟(b)得到的含3’,5’羥基基團(tuán)核苷酸空隙的dna中加入dna聚合酶i和熒光標(biāo)記物，將熒光標(biāo)記物引入dna3’,5’羥基位點(diǎn)上，得到熒光標(biāo)記的dna；

(d)形成pfp-dna復(fù)合物：在步驟(c)得到的熒光標(biāo)記的dna中加入水溶性共軛聚合物pfp，反應(yīng)得到pfp-dna復(fù)合物；

(e)氧化損傷dna檢測：步驟(d)的pfp-dna復(fù)合物形成熒光共振能量轉(zhuǎn)移體系，使熒光標(biāo)記物的光信號放大，通過測定放大的熒光強(qiáng)度得到dna堿基氧化程度。

步驟(a)中，dna修復(fù)酶為可以對dna起到修復(fù)作用的蛋白質(zhì)酶，修復(fù)酶的作用因dna損傷種類不同而不同，代表性的修復(fù)酶有連接多聚核苷鏈缺口的dna連接酶、可將多聚核苷鏈上生成的間隙填上的dna聚合酶、將損傷部位除掉的核酸酶等。

優(yōu)選地，dna修復(fù)酶為fpg蛋白或核酸內(nèi)切酶viii。

甲酰胺嘧啶-dna糖基化酶(formamidopyrimidine-dnaglycosylase，fpgprotein或稱mutm)簡稱fpg蛋白，是糖基化酶中的一種。

fpg蛋白作為n-糖基化酶識(shí)別來自于雙鏈dna的n-糖苷鍵上的氧化嘌呤堿基并切除這些位點(diǎn)，產(chǎn)生脫嘌呤位點(diǎn)，即a位點(diǎn)。

核酸內(nèi)切酶viii識(shí)別來自于雙鏈dna的n-糖苷鍵上的氧化嘧啶堿基并切除這些位點(diǎn)，產(chǎn)生脫嘧啶位點(diǎn)，即p位點(diǎn)。

脫嘌呤或脫嘧啶位點(diǎn)也稱作ap位點(diǎn)。

通過使用fpg蛋白或核酸內(nèi)切酶viii產(chǎn)生ap位點(diǎn)。進(jìn)一步，由于fpg蛋白或核酸內(nèi)切酶viii的ap-裂解酶活性使在相同的ap位點(diǎn)的3’,5’磷酸二酯鍵被裂解，獲得含3’,5’磷酸基團(tuán)核苷酸空隙的dna。

步驟(b)中，堿性磷酸酶是指一組同功酶，可以催化核酸分子脫掉5’磷酸基團(tuán)，從而使dna片段的5’-p末端轉(zhuǎn)換成5’-oh末端。

優(yōu)選地，堿性磷酸酶為fastap熱敏感堿性磷酸酶。

fastap熱敏感堿性磷酸酶催化dna、rna和核苷酸的3’,5’磷酸基團(tuán)被取代為羥基基團(tuán)，該酶也可從蛋白中除去磷酸基團(tuán)。fastap是一種新型的堿性磷酸酶，是fermentas公司生產(chǎn)的，在所有限制酶緩沖液和pcr緩沖液中均有活性。

步驟(c)中，熒光標(biāo)記為將熒光基團(tuán)共價(jià)連接到核酸等分子上的過程。熒光標(biāo)記物使用能夠選擇性地與目標(biāo)分子上存在的功能基團(tuán)反應(yīng)的熒光素基團(tuán)衍生物來完成。

優(yōu)選地，熒光標(biāo)記物為熒光素-12-雙脫氧腺嘌呤三磷酸(fluorescein-12-ddatp)、熒光素-12-雙脫氧鳥嘌呤三磷酸(fluorescein-12-ddgtp)、熒光素-12-雙脫氧胞嘧啶三磷酸(fluorescein-12-ddctp)和熒光素-12-雙脫氧尿嘧啶三磷酸(fluorescein-12-ddutp)，其為四種熒光素，熒光素為具有光致熒光特性的染料。

ddatp(2',3'-dideoxyadenosine-5'-triphosphate，三磷酸腺嘌呤雙脫氧核苷酸)；ddgtp(2',3'-dideoxyguanosone-5'-triphosphate，三磷酸鳥嘌呤雙脫氧核苷酸)；ddctp(2',3'-dideoxycytidine-5'-triphosphate，三磷酸胞嘧啶雙脫氧核苷酸)ddutp(2',3'-dideoxyuridine-5'-triphosphate，三磷酸尿嘧啶雙脫氧核苷酸)。

進(jìn)一步優(yōu)選，熒光標(biāo)記物為由熒光素-12-雙脫氧腺嘌呤三磷酸、熒光素-12-雙脫氧鳥嘌呤三磷酸、熒光素-12-雙脫氧胞嘧啶三磷酸和熒光素-12-雙脫氧尿嘧啶三磷酸配制而成的混合濃度為0.4～0.8μm的混合液，例如混合濃度為0.4μm、0.5μm、0.6μm、0.7μm或0.8μm。

最優(yōu)選，熒光標(biāo)記物為由熒光素-12-雙脫氧腺嘌呤三磷酸、熒光素-12-雙脫氧鳥嘌呤三磷酸、熒光素-12-雙脫氧胞嘧啶三磷酸和熒光素-12-雙脫氧尿嘧啶三磷酸配制而成的混合濃度為0.4μm的混合液。

步驟(c)中，dna聚合酶i是將dna由5’端點(diǎn)開始復(fù)制到3’端的酶，dna聚合酶i的主要活性是催化dna的合成(在具備模板、引物、dntp等的情況下)及其相輔的活性。

dntp(deoxy-ribonucleosidetriphosphate，脫氧核糖核苷三磷酸)的縮寫，是包括datp，dgtp，dttp，dctp等在內(nèi)的統(tǒng)稱，n是指含氮堿基，代表變量指代a、t、g、c、u等中的一種。

通過dna聚合酶i將熒光素引入dna鏈上的核苷酸空隙上，實(shí)現(xiàn)對氧化損傷dna堿基的熒光標(biāo)記。

步驟(d)中，水溶性共軛聚合物pfp是一種陽離子水溶性聚芴衍生物，其結(jié)構(gòu)如圖1所示，其中n＝1～10。

水溶性共軛聚合物pfp購自常州欣宏科生物化學(xué)有限公司(貨號y-4001)，其濃度以重復(fù)單元的摩爾濃度表示。該水溶性共軛聚合物pfp通過靜電吸引作用與dna上的熒光標(biāo)記物結(jié)合，形成pfp-dna復(fù)合物，并在光激發(fā)下發(fā)生由pfp到熒光素的熒光共振能量轉(zhuǎn)移(fret，fluorescenceresonanceenergytransfer)，從而使熒光素的信號得到顯著增強(qiáng)。

本發(fā)明提供的檢測氧化損傷dna的方法通過dna修復(fù)酶、堿性磷酸酶和dna聚合酶i的作用將熒光標(biāo)記物引入dna3’,5’羥基位點(diǎn)上，得到熒光標(biāo)記dna，熒光標(biāo)記dna與水溶性共軛聚合物pfp之間通過靜電吸引力形成pfp-dna復(fù)合物，由于水溶性共軛聚合物pfp具有很好的光捕獲性質(zhì)，其分子骨架吸收的能量可以轉(zhuǎn)移到受體，即dna熒光標(biāo)記物上，使dna上的熒光標(biāo)記物信號放大，通過熒光法來測定放大的熒光強(qiáng)度得到dna堿基氧化程度。

具體說來，當(dāng)體系中不存在氧化損傷dna時(shí)，在425nm處有熒光信號，此為pfp的熒光信號，當(dāng)體系中存在氧化損傷dna時(shí)，在425nm處的熒光信號減弱，而在530nm處產(chǎn)生了新的熒光信號，此時(shí)發(fā)生了由pfp到熒光素的熒光共振能量轉(zhuǎn)移，且隨著dna氧化程度(氧化損傷dna濃度)的增加，新的熒光信號強(qiáng)度逐漸增加，在一定濃度范圍內(nèi)，新的熒光信號強(qiáng)度與氧化損傷dna濃度呈線性關(guān)系，由此實(shí)現(xiàn)對氧化損傷dna濃度的檢測。

通過提供氧化損傷dna標(biāo)準(zhǔn)樣品和檢測樣品，用熒光檢測法按外標(biāo)法對檢測樣品溶液中的氧化損傷dna含量進(jìn)行分析。

優(yōu)選地，氧化損傷dna標(biāo)準(zhǔn)樣品由芬頓反應(yīng)制得，其制備方法包括以下步驟：

(a)將提取好的基因組dna樣品稀釋至不同濃度，進(jìn)行紫外測定，得到吸光度和dna濃度關(guān)系；

(b)取10μg不同濃度的dna樣品加入50μl80μmfecl2，40μl0.5mmh2o2，100μltris-乙酸鹽緩沖液，于37℃避光反應(yīng)4小時(shí)；待反應(yīng)后迅速取出，加入20μl3m乙酸鈉溶液和500μl無水乙醇，于-20℃下反應(yīng)10分鐘；將溶液離心，析出的dna沉淀用70％乙醇洗滌；將dna沉淀晾干，用50μl水重新溶解；

(c)對步驟(b)得到的溶液進(jìn)行紫外測定，根據(jù)步驟(a)吸光度和dna濃度關(guān)系得到溶液中的dna濃度，進(jìn)而得到氧化損傷dna濃度；

tris-乙酸鹽緩沖液為2倍濃縮緩沖液，其包含20mmtris和13mm乙酸，ph為7.3±0.5；所述乙酸鈉溶液的ph為5.2±0.5。

70％乙醇中70％指的是體積分?jǐn)?shù)。

在該優(yōu)選技術(shù)方案中，氧化損傷dna標(biāo)準(zhǔn)樣品由芬頓反應(yīng)制得，芬頓反應(yīng)產(chǎn)生羥基自由基，對dna堿基造成氧化損傷，利用芬頓反應(yīng)模擬人體內(nèi)對dna氧化損傷的環(huán)境，從而獲得不同濃度的氧化損傷dna標(biāo)準(zhǔn)樣品。通過后期對氧化損傷dna標(biāo)準(zhǔn)樣品做與實(shí)際檢測樣品同樣的處理后進(jìn)行熒光測定，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后測定實(shí)際樣品時(shí)利用此標(biāo)準(zhǔn)曲線得到氧化損傷dna濃度。

優(yōu)選地，作為一種典型的檢測氧化損傷dna的方法，包括以下步驟：

(a)樣品前處理：

(a’)取5μg氧化損傷dna標(biāo)準(zhǔn)樣品或檢測樣品25μl，加入0.5μl10u/μl核酸內(nèi)切酶viii、5μl核酸內(nèi)切酶viii緩沖液和20μl水，于37℃反應(yīng)90分鐘，于75℃終止反應(yīng)10分鐘；

(b’)向步驟(a’)得到的樣品中加入4μl1u/μlfastap熱敏感堿性磷酸酶、3μlfastap熱敏感堿性磷酸酶緩沖液和3μl水，于37℃反應(yīng)20分鐘，于75℃終止反應(yīng)10分鐘；

(c’)向步驟(b’)得到的樣品中加入0.2μl10u/μldna聚合酶i，2μlneb緩沖液2，20μl0.4μm的熒光素-12-雙脫氧腺嘌呤三磷酸、熒光素-12-雙脫氧鳥嘌呤三磷酸、熒光素-12-雙脫氧胞嘧啶三磷酸和熒光素-12-雙脫氧尿嘧啶三磷酸混合液和18μl水，于37℃反應(yīng)60分鐘，于75℃終止反應(yīng)20分鐘；

(d’)取步驟(c’)樣品10μl加入1μl1u/μlfastap熱敏感堿性磷酸酶、2μlfastap熱敏感堿性磷酸酶緩沖液和7μl水，于37℃反應(yīng)20分鐘，于75℃終止反應(yīng)10分鐘；

(b)樣品的檢測：

取步驟(d’)得到的樣品4μl，加入2μl7.5μm水溶性共軛聚合物pfp和194μlhepes緩沖液，室溫反應(yīng)10分鐘，進(jìn)行熒光檢測。

neb緩沖液為neb(newenglandbiolabs)公司生產(chǎn)的，包括neb緩沖液1、neb緩沖液2、neb緩沖液3等，針對不同的酶選用不同的緩沖液，酶活性不會(huì)受影響。

hepes(2-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonicacid，羥乙基哌嗪乙硫磺酸)緩沖液是一種非離子兩性緩沖液，其在ph7.2-7.4范圍內(nèi)具有較好的緩沖能力。

按照上述各種酶含量對樣品進(jìn)行處理，步驟(a’)識(shí)別去除氧化位點(diǎn)獲得帶有磷酸基團(tuán)的核苷酸空隙，步驟(b’)位點(diǎn)脫磷酸基團(tuán)變?yōu)榱u基基團(tuán)，步驟(c’)將熒光素引入到位點(diǎn)上，步驟(d’)再次加入fastap熱敏感堿性磷酸酶可以使熒光素失去活性，由于熒光素本身有熒光，檢測時(shí)會(huì)帶有干擾信號，采用此步可有效降低信號干擾。樣品處理后加入水溶性共軛聚合物pfp，與帶熒光素的dna組成熒光共振能量轉(zhuǎn)移(fret)體系，使受體帶熒光素的dna的光信號放大，檢測時(shí)出現(xiàn)熒光信號，通過此熒光信號實(shí)現(xiàn)對氧化損傷dna濃度的檢測。

作為一種優(yōu)選的實(shí)施方式，核酸內(nèi)切酶viii緩沖液為10倍濃縮緩沖液，其包含10mmtris–hcl、75mmnacl和1mmedta，ph為8.0±0.5。

作為一種優(yōu)選的實(shí)施方式，fastap熱敏感堿性磷酸酶緩沖液為10倍濃縮緩沖液，其包含10mmtris–hcl、5mmmgcl2、100mmkcl、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.02％的tritonx-100和100g/mlbsa，ph為8.0±0.5。

作為一種優(yōu)選的實(shí)施方式，neb緩沖液2包含5mmnacl、10mmtris-hcl、10mmmgcl2和1mmdtt，ph為7.9±0.5。

在上述優(yōu)選技術(shù)方案中，對dna分子進(jìn)行處理，緩沖液的使用是非常重要的，既要保證dna分子的處理環(huán)境，也要保證酶的活性和穩(wěn)定性。

作為一種優(yōu)選的實(shí)施方式，用以下步驟替換步驟(a’)：

取5μg氧化損傷dna標(biāo)準(zhǔn)樣品或檢測樣品25μl，加入0.5μl10u/μl甲酰胺嘧啶-dna糖基化酶、5μlneb緩沖液1和20μl水，于37℃反應(yīng)90分鐘，于75℃終止反應(yīng)10分鐘；

所述neb緩沖液1包含10mmbis-tris-propane-hcl、10mmmgcl2和1mmdtt，ph為7.0±0.5。

在該優(yōu)選技術(shù)方案中，步驟(a’)不僅可以使用核酸內(nèi)切酶viii，也可以使用fpg蛋白進(jìn)行，核酸內(nèi)切酶viii主要識(shí)別氧化嘧啶堿基，fpg蛋白主要識(shí)別氧化嘌呤堿基，將氧化損傷dna轉(zhuǎn)化為含3’,5’磷酸基團(tuán)核苷酸空隙的dna。

為了進(jìn)一步了解本發(fā)明，下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步解釋與說明。

本發(fā)明實(shí)施例中所使用的儀器包括：日立f-4500型熒光分光光度計(jì)(東京，日本)用來測定熒光強(qiáng)度和熒光光譜；2720pcr儀(appliedbiosystems，美國)被用來控制反應(yīng)的溫度；nanodrop2000超微量分光光度計(jì)(thermofisherscientific，美國)；h1650-w微量高速離心機(jī)(湖南湘儀，中國)。

本發(fā)明實(shí)施例中所使用的試劑包括：人基因組dna采自運(yùn)動(dòng)員的外周血樣品，用tianamp全血基因組試劑盒提取(天根生化科技有限公司，中國)；甲酰胺嘧啶-dna糖基化酶(fpg蛋白)、核酸內(nèi)切酶viii、dna聚合酶i購自newenglandbiolabs(ipswich,ma)；fastap熱敏感堿性磷酸酶購自fermentas公司(thermoscientific,pittsburgh,pa)；熒光素-12-雙脫氧腺嘌呤三磷酸(fluorescein-12-ddatp)、熒光素-12-雙脫氧鳥嘌呤三磷酸(fluorescein-12-ddgtp)、熒光素-12-雙脫氧胞嘧啶三磷酸(fluorescein-12-ddctp)和熒光素-12-雙脫氧尿嘧啶三磷酸(fluorescein-12-ddutp)購自perkinelmer(wellesley,ma)；hepes緩沖液(純度≥99.5％)購自sigma公司。所有溶液都是由滅菌的二次去離子水配制，其他試劑均為分析純。

實(shí)施例1不同濃度的氧化損傷dna對熒光檢測信號的影響

(a)不同濃度的氧化損傷dna標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備方法如下：

將提取好的基因組dna樣品稀釋至不同濃度，用nanodrop2000超微量分光光度計(jì)在最大吸收波長260nm處測定，得到吸光度和dna濃度關(guān)系；

取10μg不同濃度的dna樣品加入50μl80μmfecl2，40μl0.5mmh2o2，100μltris-乙酸鹽緩沖液(tris-乙酸鹽緩沖液為2倍濃縮緩沖液，其包含20mmtris和13mm乙酸，ph＝7.3)，于37℃避光反應(yīng)4小時(shí)；待反應(yīng)后迅速取出，加入20μl3m乙酸鈉溶液(ph＝5.2)和500μl無水乙醇(4℃)，在-20℃下反應(yīng)10分鐘，隨即溶液取出在12000rpm轉(zhuǎn)速下離心10分鐘，析出的dna沉淀用70％乙醇洗三遍(4℃)，將dna沉淀晾干，用50μl滅菌水重新溶解，同樣用nanodrop2000超微量分光光度計(jì)測定，分別得到不同濃度dna樣品沒有被氧化損傷的dna濃度，用dna原始濃度減去沒有被氧化損傷dna濃度得到氧化損傷dna濃度。

(b)對氧化損傷dna進(jìn)行如下處理：

(a’)取5μg氧化損傷dna樣品25μl，加入0.5μl10u/μl核酸內(nèi)切酶viii、5μl核酸內(nèi)切酶viii緩沖液(10倍濃縮緩沖液，其包含10mmtris–hcl、75mmnacl和1mmedta，ph＝8.0)和20μl水，總體積50μl，于37℃反應(yīng)90分鐘，于75℃終止反應(yīng)10分鐘；

(b’)向步驟(a’)得到的樣品中加入4μl1u/μlfastap熱敏感堿性磷酸酶、3μlfastap熱敏感堿性磷酸酶緩沖液(10倍濃縮緩沖液，其包含10mmtris–hcl、5mmmgcl2、100mmkcl、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.02％的tritonx-100和100g/mlbsa，ph＝8.0)和3μl水，總體積60μl，于37℃反應(yīng)20分鐘，于75℃終止反應(yīng)10分鐘；此步驟脫去磷酸基團(tuán)；

(c’)向步驟(b’)得到的樣品中加入0.2μl10u/μldna聚合酶i，2μlneb緩沖液2(包含5mmnacl、10mmtris-hcl、10mmmgcl2和1mmdtt，ph＝7.9)、20μl0.4μm的熒光素-12-雙脫氧腺嘌呤三磷酸、熒光素-12-雙脫氧鳥嘌呤三磷酸、熒光素-12-雙脫氧胞嘧啶三磷酸和熒光素-12-雙脫氧尿嘧啶三磷酸混合液和18μl水，總體積100μl，于37℃反應(yīng)60分鐘，于75℃終止反應(yīng)20分鐘；此步驟引入熒光素；

(d’)取步驟(c’)樣品10μl加入1μl1u/μlfastap熱敏感堿性磷酸酶、2μlfastap熱敏感堿性磷酸酶緩沖液和7μl水，總體積20μl，于37℃反應(yīng)20分鐘，于75℃終止反應(yīng)10分鐘；此步驟使熒光素失活，防止熒光素本身信號對檢測信號的影響。

(c)標(biāo)準(zhǔn)樣品的檢測：

對不同濃度氧化損傷dna標(biāo)準(zhǔn)樣品均進(jìn)行上述處理，每個(gè)樣品處理后取步驟(d)得到的樣品4μl，加入2μl7.5μm水溶性共軛聚合物pfp和194μlhepes緩沖液，室溫反應(yīng)10分鐘，用f-4500型熒光分光光度計(jì)進(jìn)行熒光檢測。檢測結(jié)果如圖3所示。

從圖3中可以看出，當(dāng)氧化損傷dna濃度為0時(shí)，熒光光譜在425nm處有一個(gè)特征峰，此為pfp的特征峰，當(dāng)氧化損傷dna濃度不為0時(shí)，熒光光譜在425nm處熒光強(qiáng)度減弱，且在530nm處出現(xiàn)另一特征峰，此時(shí)發(fā)生了由pfp到熒光素的熒光共振能量轉(zhuǎn)移，且隨著dna氧化程度的增加，即氧化損傷dna濃度的增加425nm處熒光強(qiáng)度減弱，530nm處熒光強(qiáng)度增強(qiáng)。且氧化損傷dna濃度在0～10ng/μl的范圍內(nèi)，530nm處熒光強(qiáng)度與氧化損傷dna的濃度呈線性關(guān)系，如圖4所示。

根據(jù)熒光強(qiáng)度與氧化損傷dna濃度的線性關(guān)系，可以快速準(zhǔn)確地對dna的氧化損傷程度進(jìn)行檢測(檢測樣品的處理方式可按照上述步驟(b)、和步驟(c)進(jìn)行，為了保證檢測濃度落在檢測范圍內(nèi)，前期也可對檢測樣品進(jìn)行一定程度的稀釋)。本發(fā)明提供的方法具有靈敏度高和特異性強(qiáng)的特點(diǎn)，且檢出限低，可達(dá)到1ng/μl(溶液中的終濃度)，背景溶液對被檢測物的干擾小。

實(shí)施例2不同濃度的pfp對熒光檢測信號的影響

用不同濃度的pfp處理同一固定濃度的樣品，在其他條件均相同的情況下，對熒光檢測信號進(jìn)行影響試驗(yàn)。圖5為不同濃度的pfp對熒光檢測信號的影響圖。由圖5可以看出，不同濃度的pfp對熒光檢測信號有影響。pfp濃度過低，熒光檢測信號較弱，不易檢測。在530nm處，隨著pfp濃度的增大，熒光強(qiáng)度逐漸增大。

實(shí)施例3分別采用fpg蛋白和核酸內(nèi)切酶viii處理對熒光檢測信號的影響

分別采用fpg蛋白和核酸內(nèi)切酶viii處理同一固定濃度的樣品，在其他條件均相同的情況下，對熒光檢測信號進(jìn)行影響試驗(yàn)。圖6為采用fpg蛋白和核酸內(nèi)切酶viii處理對熒光檢測信號的影響圖。由圖6可以看出，當(dāng)用fpg蛋白或核酸內(nèi)切酶viii處理未氧化損傷dna和處理水時(shí)，未出現(xiàn)熒光檢測信號，而用fpg蛋白或核酸內(nèi)切酶viii處理氧化損傷dna時(shí)，熒光信號明顯，驗(yàn)證了方法的可行，同時(shí)，采用核酸內(nèi)切酶viii處理的樣品的熒光信號大于采用fpg蛋白處理的樣品的熒光信號。

盡管已用具體實(shí)施例來說明和描述了本發(fā)明，然而應(yīng)意識(shí)到，在不背離本發(fā)明的精神和范圍的情況下可以作出許多其它的更改和修改。因此，這意味著在所附權(quán)利要求中包括屬于本發(fā)明范圍內(nèi)的所有這些變化和修改。