本發(fā)明涉及一種新的截短型人乳頭瘤病毒16型l1蛋白、由其組成的病毒樣顆粒、含該病毒樣顆粒和疫苗佐劑的疫苗及其在預(yù)防hpv感染或hpv感染相關(guān)病變中的用途。
背景技術(shù)：
：目前已分離鑒定了200多型人乳頭瘤病毒(humanpapillomavirus，hpv)，分為嗜黏膜組和嗜皮膚組。黏膜組的hpv主要感染泌尿生殖道、肛門(mén)肛周及口咽部的黏膜及周?chē)つw，誘發(fā)各種良惡性病變。根據(jù)誘發(fā)病變的性質(zhì)不同，可分為誘發(fā)惡性腫瘤的高危型(包括hpv16,18,31,33,35,39,45,51,52,56,58,59,68等)、可疑高危型(hpv26,30,53,66,67,69,70,73,82,85等)、尚未確定型(hpv34,42,43,54,71,81,83,97,102,114等)，及誘發(fā)疣狀增生等良性病變的低危型(hpv6,7,11,13,32,40,42,44,61,62,72,74,81,83,84,86,87,89,90,91,106等)。嗜皮膚組主要感染上述部位之外的皮膚組織，誘發(fā)皮膚疣狀增生，并與某些皮膚癌的發(fā)生密切相關(guān)。高危型hpv感染相關(guān)的惡性腫瘤目前已確定的有：宮頸癌、陰道癌、陰唇癌、陰莖癌、肛門(mén)肛周癌、口咽癌、扁桃體癌、口腔癌，其中以宮頸癌的危害最大。宮頸癌是世界范圍第三高發(fā)的婦女惡性腫瘤，年發(fā)病率約52.7萬(wàn)，其中亞洲地區(qū)28.5萬(wàn)；中國(guó)的年發(fā)病數(shù)7.5萬(wàn)。研究發(fā)現(xiàn)病毒的主要外殼蛋白l1體外表達(dá)后可組裝成l1病毒樣顆粒(vlp)，l1vlp的結(jié)構(gòu)及形態(tài)與病毒顆粒的天然結(jié)構(gòu)類(lèi)似，具有很強(qiáng)的免疫原性。目前國(guó)外上市的三種hpv預(yù)防性疫苗均為hpvl1vlp疫苗，包括葛蘭素史克的hpv16/18雙價(jià)疫苗、默沙東的hpv16/18/6/11四價(jià)疫苗及hpv16/18/58/52/31/33/45/6/11九價(jià)疫苗，人群免疫后，免疫活性好、預(yù)防感染及感染相關(guān)疾病的保護(hù)效率高。鑒于hpv16是世界范圍內(nèi)的優(yōu)勢(shì)流行病毒株，約53.5％的宮頸癌是由hpv16感染引起的，其余46.5％的宮頸癌由其它約22種高危型和可疑高危型hpv感染引起。因此深入研究hpv16l1vlp疫苗具有意義。目前多種不同的表達(dá)體系，包括昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)體系、酵母表達(dá)體系、大腸桿菌表達(dá)體系及植物表達(dá)體系，均可用于hpv16l1vlp的表達(dá)生產(chǎn)。研究發(fā)現(xiàn)hpv16l1全長(zhǎng)蛋白(whitew,wilsons,etal.j.virol.1999；73(6):4882-4889.)、n端截短的突變體蛋白(chenxs,casinig,etal.j.mol.biol.2011；307:173-182.)、c端截短的突變體(專(zhuān)利cn1976718a，cn102586287，cn104418942a)、及聯(lián)合n端截10個(gè)氨基酸及c端截短22個(gè)氨基酸的突變體蛋白(varsania,williamsonal,etal.vir.res.2006；122:154-163.)，采用特定的技術(shù)均可以組裝成hpv16l1vlp(全長(zhǎng)hpv16l1蛋白序列為ncbi數(shù)據(jù)庫(kù)aac09292.1序列，n端截短從n端第一個(gè)氨基酸m開(kāi)始)。研究還發(fā)現(xiàn)了多種提高h(yuǎn)pv16l1蛋白表達(dá)水平的方法，如c端截短31氨基酸可以使表達(dá)水平提高1.58倍，消除n端前129個(gè)核苷酸內(nèi)的抑制性dna序列，亦可提高表達(dá)水平，聯(lián)合采用密碼子優(yōu)化、消除潛在轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)、消除潛在剪切位點(diǎn)、簡(jiǎn)化mrna二級(jí)結(jié)構(gòu)等方法也可以提高表達(dá)水平。目前有關(guān)n端截短2、3、5或7個(gè)氨基酸的hpv16l1突變體是否能形成vlp，以及n端截短1-9個(gè)氨基酸聯(lián)合c端截短的1-34個(gè)氨基酸的hpv16l1突變體是否能形成vlp，尚未見(jiàn)有報(bào)道。因此，上述方法獲得的截短型突變體的表達(dá)量的分析也不明確。研究發(fā)現(xiàn)，hpv16l1蛋白中即使出現(xiàn)1個(gè)或幾個(gè)氨基酸的差異，均可顯著影響其表達(dá)水平，c端截短不同長(zhǎng)度的l1突變體表達(dá)水平有明顯差異，其中c端截短34個(gè)氨基酸的l1突變體比野生型的表達(dá)水平顯著提高。本發(fā)明采用的c端截短的氨基酸數(shù)目與該研究不同，截短蛋白的表達(dá)水平是無(wú)法預(yù)測(cè)的；另外聯(lián)合n端截短不同長(zhǎng)度的氨基酸，獲得的hpv16l1突變體氨基酸序列組成與目前已報(bào)道的方法差異更大，其表達(dá)水平如何及是否能組裝成vlp亦是無(wú)法預(yù)測(cè)的，需依靠具體的實(shí)驗(yàn)研究才能確定。因此，本發(fā)明設(shè)計(jì)的多種hpv16l1突變體在hpv16l1vlp疫苗中的研究?jī)r(jià)值需要實(shí)驗(yàn)探索后才能確定。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種新的截短型hpv16l1蛋白、由其組成的病毒樣顆粒及含該病毒樣顆粒的疫苗，并研究該疫苗在預(yù)防hpv感染和感染相關(guān)疾病中的用途。本發(fā)明人經(jīng)研究出人意料地發(fā)現(xiàn)，適當(dāng)?shù)貙?duì)hpv16l1蛋白的n端和/或c端進(jìn)行截短，可提高h(yuǎn)pv16l1蛋白在昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)量，該截短蛋白可組裝成vlp，并可誘發(fā)針對(duì)hpv16的保護(hù)性免疫反應(yīng)。本發(fā)明基于以上發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)已完成，在本文實(shí)施例中提供數(shù)據(jù)。因此，本發(fā)明第一方面涉及一種與野生型hpv16l1蛋白(例如起始atg同ncbi數(shù)據(jù)庫(kù)aac09292.1序列)相比n端截短了2、3、5或7個(gè)氨基酸，c端保留完整讀碼框編碼的氨基酸或截短了29、31、33個(gè)氨基酸的hpv16l1蛋白。優(yōu)選地該截短蛋白選自hpv16l1δn2、hpv16l1δn3、hpv16l1δn5、hpv16l1δn7、hpv16l1δn2c29、hpv16l1δn3c29、hpv16l1δn5c29、hpv16l1δn7c29、hpv16l1δn2c31、hpv16l1δn3c31、hpv16l1δn5c31、hpv16l1δn7c31、hpv16l1δn2c33、hpv16l1δn3c33、hpv16l1δn5c33和hpv16l1δn7c33。具體地，本發(fā)明提供了一種截短型hpv16l1蛋白，其中所述截短型hpv16l1蛋白與野生型hpv16l1蛋白相比，n端截短了2、3、5或7個(gè)氨基酸；其中所述截短型hpv16l1蛋白與野生型hpv16l1蛋白相比，c端保留完整讀碼框編碼的氨基酸或截短了29、31或33個(gè)氨基酸。優(yōu)選地，本發(fā)明所述截短型hpv16l1蛋白在ncbi數(shù)據(jù)庫(kù)aac09292.1序列基礎(chǔ)上進(jìn)行截短；特別優(yōu)選地，所述截短型hpv16l1蛋白選自hpv16l1δn5c31(seqidno.1)及hpv16l1δn7c33(seqidno.2)。野生型hpv16l1蛋白也可來(lái)自但不限于hpv16phi1、tha7、alg1、sen32、fra25、fra63、114k、114b、z-1194等變異株的l1蛋白(touzea,mehdaouise,etal.j.clin.micr.1998；36(7):2046-2051)，相應(yīng)變異株的截短型l1蛋白為在上述截短型hpv16l1蛋白等同位置截短，如通過(guò)序列比較來(lái)評(píng)價(jià)。本發(fā)明第二方面涉及編碼本發(fā)明截短型hpv16l1蛋白的多核苷酸。本發(fā)明第三方面涉及含有上述第二方面所述多核苷酸的載體，優(yōu)選地，所述載體選自質(zhì)粒、重組bacmid和重組桿狀病毒。本發(fā)明第四方面涉及包含上述載體的昆蟲(chóng)細(xì)胞。本發(fā)明第五方面涉及一種hpv16l1病毒樣顆粒，該病毒樣顆粒含有上述第一方面所述的hpv16l1蛋白，或由上述第一方面所述的hpv16l1蛋白組成。本發(fā)明第六方面涉及一種預(yù)防hpv感染或hpv感染相關(guān)病變的疫苗，該疫苗含有第五方面所述的hpv16l1病毒樣顆粒，其中hpv16l1病毒樣顆粒的含量為能誘發(fā)保護(hù)性免疫反應(yīng)的有效量。優(yōu)選地，該疫苗還可包含至少一種選自其他嗜黏膜組和/或嗜皮膚組的hpv的病毒樣顆粒，這些病毒樣顆粒的含量分別為能誘發(fā)保護(hù)性免疫反應(yīng)的有效量。上述疫苗通常還包含疫苗用賦形劑或載體。優(yōu)選地，所述疫苗含有第五方面所述的hpv16l1病毒樣顆粒以及至少1種選自hpv2、5、6、7、11、18、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、39、40、43、44、45、51、52、53、56、57、58、59、61、66、67、68、69、70、73、74、77、81、82、83、85、91的l1病毒樣顆粒，這些病毒樣顆粒的含量分別為能誘發(fā)保護(hù)性免疫反應(yīng)的有效量。進(jìn)一步優(yōu)選地，所述疫苗含有第五方面所述的hpv16l1病毒樣顆粒以及hpv18、26、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68及73的l1病毒樣顆粒，這些病毒樣顆粒的含量分別為能誘發(fā)保護(hù)性免疫反應(yīng)的有效量。進(jìn)一步優(yōu)選地，所述疫苗含有第五方面所述的hpv16l1病毒樣顆粒以及hpv18、31、33、35、39、45、52及58的l1病毒樣顆粒，這些病毒樣顆粒的含量分別為能誘發(fā)保護(hù)性免疫反應(yīng)的有效量。進(jìn)一步優(yōu)選地，所述疫苗含有第五方面所述的hpv16l1病毒樣顆粒以及hpv18、52及58的l1病毒樣顆粒，這些病毒樣顆粒的含量分別為能誘發(fā)保護(hù)性免疫反應(yīng)的有效量。進(jìn)一步優(yōu)選地，所述疫苗含有第五方面所述的hpv16l1病毒樣顆粒以及hpv18及58的l1病毒樣顆粒，這些病毒樣顆粒的含量分別為能誘發(fā)保護(hù)性免疫反應(yīng)的有效量。特別優(yōu)選地，所述疫苗含有第五方面所述的hpv16l1病毒樣顆粒以及hpv18的l1病毒樣顆粒，這些病毒樣顆粒的含量分別為能誘發(fā)保護(hù)性免疫反應(yīng)的有效量。本發(fā)明第七方面涉及一種包含第六方面所述疫苗及佐劑的可進(jìn)一步提高免疫反應(yīng)的新型疫苗。優(yōu)選地，所使用的佐劑為包含鋁佐劑、水包油乳劑或油包水乳劑及tlr刺激劑的佐劑組合物。進(jìn)一步優(yōu)選地，所使用的佐劑為包含氫氧化鋁佐劑或磷酸鋁佐劑與聚肌苷酸-聚胞苷酸佐劑及穩(wěn)定劑的組合物。進(jìn)一步優(yōu)選地，所使用的佐劑為包含mf59佐劑與聚肌苷酸-聚胞苷酸佐劑及穩(wěn)定劑的組合物。特別地，本發(fā)明涉及的復(fù)合佐劑為實(shí)施方案中所述的聚肌苷酸-聚胞苷酸及穩(wěn)定劑(pika)聯(lián)合氫氧化鋁佐劑組成的復(fù)合物，或聚肌苷酸-聚胞苷酸及穩(wěn)定劑(pika)聯(lián)合mf59佐劑組成的復(fù)合物，兩種復(fù)合佐劑與hpvvlp疫苗聯(lián)合使用均可有效提高疫苗的免疫活性。本發(fā)明第八方面涉及第六方面及第七方面所述疫苗在預(yù)防hpv感染或hpv感染相關(guān)疾病中的用途。相關(guān)術(shù)語(yǔ)的說(shuō)明及解釋根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語(yǔ)“昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)”包括昆蟲(chóng)細(xì)胞、重組桿狀病毒、重組bacmid及表達(dá)載體。其中昆蟲(chóng)細(xì)胞來(lái)源于市場(chǎng)上可得到的細(xì)胞，在此舉例但不限于：sf9，sf21，highfive。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語(yǔ)“野生型hpv16l1蛋白”的例子包括但不限于ncbi數(shù)據(jù)庫(kù)中編號(hào)為aac09292.1的蛋白等長(zhǎng)的全長(zhǎng)l1蛋白。“截短型hpv16l1蛋白”的基因片段指的是其與野生型hpv16l1蛋白基因相比，在其5’端和/或3’端缺失編碼1個(gè)或多個(gè)氨基酸的核苷酸，其中“野生型hpv16l1蛋白”的全長(zhǎng)序列例如但不限于ncbi數(shù)據(jù)庫(kù)中的如下序列:aac09292.1、aiq82817.1、aac61736.1等。根據(jù)本發(fā)明，表述“δnx”代表“n端截短x個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)”，是指以起始甲硫氨酸為第1位氨基酸來(lái)計(jì)數(shù)，從n末端截去x個(gè)氨基酸之后，在剩余序列的n端再補(bǔ)加一個(gè)甲硫氨酸作為起始位點(diǎn)的蛋白質(zhì)。例如“hpv16l1δn5”代表n端截短了5個(gè)氨基酸的hpv16l1蛋白，即刪除從起始甲硫氨酸開(kāi)始的5個(gè)氨基酸之后，在剩余序列的n端再補(bǔ)加一個(gè)甲硫氨酸所獲得的蛋白質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明，表述“δcy”代表“c端截短y個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)”，是指從hpv16l1第505位氨基酸開(kāi)始計(jì)數(shù)，截短y個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。例如“hpv16l1δc1”代表c端截短第505位1個(gè)氨基酸所獲得的蛋白質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明，表述“δnxcy”代表“n端截短x個(gè)氨基酸同時(shí)c端截短y個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)”，是指以起始甲硫氨酸為第1位氨基酸來(lái)計(jì)數(shù)，從n末端截去x個(gè)氨基酸之后，在剩余序列的n端再補(bǔ)加一個(gè)甲硫氨酸作為起始位點(diǎn)，同時(shí)從hpv16l1第505位氨基酸開(kāi)始計(jì)數(shù)，截短y個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。例如“hpv16l1δn5c31”代表n端截短了5個(gè)氨基酸同時(shí)c端截短31個(gè)氨基酸的hpv16l1蛋白，即刪除從起始甲硫氨酸開(kāi)始的5個(gè)氨基酸之后，在剩余序列的n端再補(bǔ)加一個(gè)甲硫氨酸，并且同時(shí)刪除c端第475-505位共計(jì)31個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語(yǔ)“賦形劑或載體”是指選自一種或多種，包括但不限于：ph調(diào)節(jié)劑，表面活性劑，離子強(qiáng)度增強(qiáng)劑。例如，ph調(diào)節(jié)劑舉例但不限于磷酸鹽緩沖液，表面活性劑包括陽(yáng)離子、陰離子或非離子型表面活性劑，舉例但不限于聚山梨酯80(tween-80)，離子強(qiáng)度增強(qiáng)劑舉例但不限于氯化鈉。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語(yǔ)“佐劑”是指在臨床上可應(yīng)用于人體的佐劑，包括當(dāng)前已獲得批準(zhǔn)的和將來(lái)可能獲得批準(zhǔn)的各種佐劑，例如但不限于鋁佐劑、mf59及各種形式的佐劑組合物。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語(yǔ)“乳劑”是指由水相成分、油相成分及乳化劑按適當(dāng)比例混合，經(jīng)乳化后形成的非均相液體分散體系。其中水相成分包括但不限于磷酸鹽緩沖液、hepes緩沖液等緩沖系統(tǒng)；油相成分為可代謝脂類(lèi)，包括但不限于植物油、魚(yú)油、動(dòng)物油、合成油及其他脂類(lèi)成分(例如但不限于角鯊烯、生育酚)；乳化劑為適宜的表面活性劑，例如但不限于山梨醇酐三油酸酯(span-85)、聚山梨酯80(tween-80)。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語(yǔ)“穩(wěn)定劑”是指可與佐劑中的聚肌苷酸-聚胞苷酸結(jié)合并起到穩(wěn)定作用的成分，包括但不限于抗生素(例如但不限于卡那霉素、新霉素、慶大霉素)、無(wú)機(jī)鹽(例如但不限于氯化鈣、氯化鎂、磷酸鈣)、陽(yáng)離子的有機(jī)復(fù)合物(例如但不限于硬脂酸鈣、葡萄糖酸鈣)。根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的疫苗可采用患者可接受的形式，包括但不限于口服或者注射，優(yōu)選注射。根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明疫苗優(yōu)選單位劑型使用，其中單位劑型中截短型hpv16l1蛋白病毒樣顆粒的劑量為5μg-80μg，優(yōu)選20μg-40μg。附圖說(shuō)明圖1顯示了本發(fā)明實(shí)施例4中截短型hpv16l1在昆蟲(chóng)細(xì)胞中的表達(dá)鑒定。結(jié)果顯示，16種截短型hpv16l1均可在昆蟲(chóng)細(xì)胞中高水平表達(dá)。1至16分別表示hpv16l1δn2、hpv16l1δn3、hpv16l1δn5、hpv16l1δn7、hpv16l1δn2c29、hpv16l1δn3c29、hpv16l1δn5c29、hpv16l1δn7c29、hpv16l1δn2c31、hpv16l1δn3c31、hpv16l1δn5c31、hpv16l1δn7c31、hpv16l1δn2c33、hpv16l1δn3c33、hpv16l1δn5c33和hpv16l1δn7c33。圖2a至圖2b顯示了本發(fā)明實(shí)施例6中純化后獲得的hpv16l1δn5及hpv16l1δn5c31突變體蛋白的動(dòng)態(tài)光散射分析結(jié)果。結(jié)果顯示hpv16l1δn5及hpv16l1δn5c31重組蛋白形成的病毒樣顆粒水化動(dòng)力學(xué)直徑分別為129.6nm和128nm，顆粒組裝的百分比均為100％。圖2a表示hpv16l1δn5；圖2b表示hpv16l1δn5c31。圖3a至3p顯示了本發(fā)明實(shí)施例7中純化后獲得的16種截短型hpv16l1vlp的透射電鏡觀察結(jié)果。視野中可見(jiàn)大量的直徑為55nm左右的病毒樣顆粒，顆粒的大小與理論值相符，均一度好。bar＝200nm。圖3a至3p分別表示hpv16l1δn2、hpv16l1δn3、hpv16l1δn5、hpv16l1δn7、hpv16l1δn2c29、hpv16l1δn3c29、hpv16l1δn5c29、hpv16l1δn7c29、hpv16l1δn2c31、hpv16l1δn3c31、hpv16l1δn5c31、hpv16l1δn7c31、hpv16l1δn2c33、hpv16l1δn3c33、hpv16l1δn5c33和hpv16l1δn7c33。圖4顯示了本發(fā)明實(shí)施例8中的hpv16l1δn5及hpv16l1δn5c31vlp接種小鼠后免疫血清hpv16中和抗體滴度的分析。圖5顯示了本發(fā)明實(shí)施例9中的hpv16l1δn5c31vlp蛋白聯(lián)合含pika的復(fù)合佐劑接種小鼠后免疫血清中和抗體滴度的分析，*：與無(wú)佐劑組相比，p<0.05；**：與無(wú)佐劑組相比，與p<0.01；***：與無(wú)佐劑組相比，與p<0.001；#：與單純pika組相比，與p<0.05；###：與單純pika組相比，與p<0.001；&：與單純alum組相比，與p<0.05；&&&：與單純alum組相比，與p<0.001。具體實(shí)施方式下面將通過(guò)非限制性實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員公知，在不背離本發(fā)明精神的情況下，可以對(duì)本發(fā)明做出許多修改，這樣的修改也落入本發(fā)明的范圍。下面的實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍，因?yàn)閷?shí)施方案必然是多樣的。本說(shuō)明書(shū)中使用的用語(yǔ)僅是為了闡述特定的實(shí)施方案，而非作為限制，本發(fā)明的范圍已界定在所附的權(quán)利要求中。除非特別說(shuō)明，本說(shuō)明書(shū)中所使用的所有技術(shù)和科學(xué)用語(yǔ)均和本案所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員所普遍明了的意義相同。下面就本發(fā)明的優(yōu)選方法和材料加以敘述，但是與本說(shuō)明書(shū)中所述方法和材料類(lèi)似或等效的任何方法和材料均可用以實(shí)施或測(cè)試本發(fā)明。下述實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特別說(shuō)明，均為常規(guī)方法或產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)所描述的方法，所使用的實(shí)驗(yàn)材料如無(wú)特別說(shuō)明，均可容易地從商業(yè)公司獲取。本說(shuō)明書(shū)中所提到的所有公開(kāi)文獻(xiàn)均被并入于此作為參考，以揭示并說(shuō)明所述公開(kāi)文獻(xiàn)中的方法和/或材料。實(shí)施例1：截短型hpv16l1基因的擴(kuò)增及表達(dá)載體構(gòu)建用做模版的全長(zhǎng)hpv16l1基因由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司全基因合成(seqidno：3)，其對(duì)應(yīng)的氨基酸序列為ncbi數(shù)據(jù)庫(kù)中編號(hào)為aac09292.1的序列。用于構(gòu)建截短型hpv16l1基因的引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，具體如下：16n2f：5’-gaattcgccgccaccatgctctggttgccatccgaagc-3’；16n3f：5’-gaattcgccgccaccatgtggttgccatccgaagctac-3’；16n5f：5’-gaattcgccgccaccatgccatccgaagctacagtctatc-3’；16n7f：5’-gaattcgccgccaccatggaagctacagtctatctccc-3’；16cr：5’-tctagattacagcttacgttttttgcg-3’；16c29r：5’-tctagaattaggccttgagaccagcttgcaac-3’16c31r：5’-tctagaattagagaccagcttgc-3’；16c33r：5’-tctagaattaagcttgcaacaggaatttc-3’,上述引物序列顯示于序列表seqidno：6-13中。以seqidno：3為模版，使用16n2f/16cr為引物，pcr擴(kuò)增hpv16l1δn2基因；使用16n3f/16cr為引物，pcr擴(kuò)增hpv16l1δn3基因；使用16n5f/16cr為引物，pcr擴(kuò)增hpv16l1δn5基因；使用16n7f/16cr為引物，pcr擴(kuò)增hpv16l1δn7基因；使用16n2f/16c29r為引物，pcr擴(kuò)增hpv16l1δn2c29基因；使用16n3f/16c29r為引物，pcr擴(kuò)增hpv16l1δn3c29基因；使用16n5f/16c29r為引物，pcr擴(kuò)增hpv16l1δn5c29基因；使用16n7f/16c29r為引物，pcr擴(kuò)增hpv16l1δn7c29基因；使用16n2f/16c31r為引物，pcr擴(kuò)增hpv16l1δn2c31基因；使用16n3f/16c31r為引物，pcr擴(kuò)增hpv16l1δn3c31基因；使用16n5f/16c31r為引物，pcr擴(kuò)增hpv16l1δn5c31基因(seqidno：4)；使用16n7f/16c31r為引物，pcr擴(kuò)增hpv16l1δn7c31基因；使用16n2f/16c33r為引物，pcr擴(kuò)增hpv16l1δn2c33基因；使用16n3f/16c33r為引物，pcr擴(kuò)增hpv16l1δn3c33基因；使用16n5f/16c33r為引物，pcr擴(kuò)增hpv16l1δn5c33基因；使用16n7f/16c33r為引物，pcr擴(kuò)增hpv16l1δn7c33基因(seqidno：5)。pcr擴(kuò)增的方法都是公知的，例如專(zhuān)利cn101293918b。采用ecori/xbai酶切位點(diǎn)，分別對(duì)上述pcr擴(kuò)增得到的基因進(jìn)行酶切，并分別插入商業(yè)化表達(dá)載體pfastbac1(invitrogen公司生產(chǎn))中，得到包含截短型hpv16l1基因的重組表達(dá)載體：pfastbac1-16l1δn2、pfastbac1-16l1δn3、pfastbac1-16l1δn5、pfastbac1-16l1δn7、pfastbac1-16l1δn2c29、pfastbac1-16l1δn3c29、pfastbac1-16l1δn5c29、pfastbac1-16l1δn7c29、pfastbac1-16l1δn2c31、pfastbac1-16l1δn3c31、pfastbac1-16l1δn5c31、pfastbac1-16l1δn7c31、pfastbac1-16l1δn2c33、pfastbac1-16l1δn3c33、pfastbac1-16l1δn5c33、pfastbac1-16l1δn7c33。上述酶切、連接及克隆構(gòu)建的方法都是公知的，例如專(zhuān)利cn101293918b。實(shí)施例2：截短型hpv16l1基因的重組bacmid及重組桿狀病毒的構(gòu)建體分別使用包含截短型hpv16l1基因的重組表達(dá)載體pfastbac1-16l1δn2、pfastbac1-16l1δn3、pfastbac1-16l1δn5、pfastbac1-16l1δn7、pfastbac1-16l1δn2c29、pfastbac1-16l1δn3c29、pfastbac1-16l1δn5c29、pfastbac1-16l1δn7c29、pfastbac1-16l1δn2c31、pfastbac1-16l1δn3c31、pfastbac1-16l1δn5c31、pfastbac1-16l1δn7c31、pfastbac1-16l1δn2c33、pfastbac1-16l1δn3c33、pfastbac1-16l1δn5c33、pfastbac1-16l1δn7c33轉(zhuǎn)化大腸桿菌dh10bac感受態(tài)，篩選獲得重組bacmid，然后用重組bacmid轉(zhuǎn)染昆蟲(chóng)細(xì)胞sf9，在sf9內(nèi)擴(kuò)增重組桿狀病毒。重組bacmid的篩選及重組桿狀病毒的擴(kuò)增方法都是公知的，例如專(zhuān)利cn101148661b。實(shí)施例3：截短型hpv16l1基因在sf9細(xì)胞中的表達(dá)sf9細(xì)胞分別接種16種截短型hpv16l1基因的重組桿狀病毒，進(jìn)行截短型hpv16l1蛋白的表達(dá)，27℃培養(yǎng)約88h后收發(fā)酵液，3000rpm離心15min，棄上清，用pbs洗滌細(xì)胞后，用于表達(dá)鑒定及純化。感染表達(dá)的方法是公開(kāi)的，例如專(zhuān)利cn101148661b。實(shí)施例4：截短型hpv16l1的表達(dá)鑒定取實(shí)施例3中所述表達(dá)不同截短型hpv16l1的細(xì)胞各1×106個(gè)，重懸于200μlpbs溶液中，加入6×loadingbuffer50μl，75℃變性8分鐘，分別取10μl進(jìn)行sds-page電泳及westernblot鑒定。結(jié)果如圖1所示，16種截短型hpv16l1蛋白均可在昆蟲(chóng)細(xì)胞中高水平表達(dá)，其中hpv16l1δn2、hpv16l1δn3、hpv16l1δn5、hpv16l1δn7大小約55kda，其余12種蛋白大小約50kda。sds-page電泳及westernblot鑒定的方法是公開(kāi)的，例如專(zhuān)利cn101148661b。實(shí)施例5：截短型hpv16l1蛋白與野生型hpv16l1蛋白的表達(dá)量比較取實(shí)施例3中所述表達(dá)截短型hpv16l1蛋白及野生型hpv16l1的細(xì)胞各1×106個(gè)，重懸于200μlpbs溶液中，采用超聲破碎法(寧波新芝超聲破碎儀，2#探頭，100w，超聲5s，間隔7s，總時(shí)間3min)破碎細(xì)胞，12000rpm高速離心10分鐘。收取裂解上清，采用夾心elisa法檢測(cè)上清中的l1含量，該方法是公知的，例如專(zhuān)利cn104513826a。使用本發(fā)明人制備的hpv16l1單克隆抗體包被酶標(biāo)板，80ng/孔，4℃孵育過(guò)夜；使用5％bsa-pbst室溫封閉2h，再用pbst洗板3次。用pbs將裂解上清進(jìn)行連續(xù)2倍稀釋?zhuān)⑶覍pv16l1vlp標(biāo)準(zhǔn)品也進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)瑵舛葟?μg/ml-0.0625μg/ml，分別加入酶標(biāo)板，每孔100μl，37℃孵育1h。用pbst洗板3次，加入1：3000稀釋的hpv16l1兔多抗，每孔100μl，37℃孵育1h。用pbst洗板3次，加入1：3000稀釋的hrp標(biāo)記的山羊抗小鼠igg(1：3000稀釋?zhuān)猩冀饦蚬?，37℃孵育45分鐘。用pbst洗板5次，每孔加入100μlopd底物(sigma公司)，37℃顯色5分鐘，用50μl2m硫酸終止反應(yīng)，在490nm處測(cè)定吸光值。依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算裂解上清中截短型hpv16l1蛋白及野生型hpv16l1蛋白的濃度。結(jié)果如表1所示，本發(fā)明的截短型hpv16l1蛋白的表達(dá)量均高于野生型hpv16l1蛋白，且高于專(zhuān)利cn104418942a中的c端截短突變體hpv16l1-498(hpv16l1δc7)及hpv16l1-483(hpv16l1δc22)。表1hpv16l1蛋白表達(dá)量分析實(shí)施例6：截短型hpv16l1蛋白的純化及動(dòng)態(tài)光散射粒徑分析取截短型hpv16l1的細(xì)胞發(fā)酵液50ml，使用10mlpbs重懸細(xì)胞，加pmsf至終濃度1mg/ml，超聲破碎(寧波新芝超聲破碎儀，6#探頭，100w，超聲5s，間隔7s，總時(shí)間5min)，取破碎上清進(jìn)行純化，純化步驟在室溫進(jìn)行。在裂解液中加入4％β-巰基乙醇(w/w)對(duì)vlp進(jìn)行解聚，然后使用0.22μm濾器過(guò)濾樣品，依次使用dmae陰離子交換層析(20mmtris,180mmnacl,4％β-me,ph7.9洗脫)、tmae陰離子交換層析(20mmtris,180mmnacl,4％β-me,ph7.9洗脫)及羥基磷灰石層析(100mmnah2po4，30mmnacl，4％β-me，ph6.0洗脫)純化。純化產(chǎn)物采用planova超濾系統(tǒng)進(jìn)行濃縮，并更換緩沖液(20mmnah2po4，500mmnacl，ph6.0)促使vlp組裝。以上純化方法均是公開(kāi)的，例如專(zhuān)利cn101293918b、cn1976718a等。取純化后的截短型hpv16l1蛋白溶液進(jìn)行dls粒徑分析(zetasizernanozs90動(dòng)態(tài)光散射儀，malvern公司)，結(jié)果如表2所示，其中hpv16l1δn5及hpv16l1δn5c31的dls分析圖如圖2所示。表2截短型hpv16l1蛋白dls分析蛋白名稱(chēng)水力學(xué)直徑(nm)pdihpv16l1δn2128.40.148hpv16l1δn3127.20.153hpv16l1δn5129.60.167hpv16l1δn7129.10.151hpv16l1δn2c29128.50.146hpv16l1δn3c29129.30.133hpv16l1δn5c29127.40.145hpv16l1δn7c29126.90.138hpv16l1δn2c31128.30.141hpv16l1δn3c31127.80.138hpv16l1δn5c311280.146hpv16l1δn7c31128.40.129hpv16l1δn2c33127.50.137hpv16l1δn3c331270.147hpv16l1δn5c33128.80.150hpv16l1δn7c33128.50.138實(shí)施例7：截短型hpv16l1vlp的透射電鏡觀察按實(shí)施例6所述的層析純化方法，對(duì)截短型hpv16l1vlp分別進(jìn)行純化，使用透析后的vlp制備銅網(wǎng)，并用1％醋酸鈾進(jìn)行染色，充分干燥后使用jem-1400電鏡(奧林巴斯)進(jìn)行觀察。結(jié)果如圖3所示，截短型hpv16l1vlp直徑約為55nm，大小均勻，形狀規(guī)則。銅網(wǎng)制備及電鏡觀察的方法均是公開(kāi)的，例如專(zhuān)利cn101148661b。實(shí)施例8：截短型hpv16l1vlp的小鼠免疫及中和抗體滴度測(cè)定取4-6周齡的balb/c小鼠，隨機(jī)分組，每組4只，分別用pbs、截短型hpv16l1vlp及hpv16l1wtvlp免疫小鼠。肌肉注射，l1vlp的免疫劑量為0.1μg，于第0，2周免疫，共2次。第2次免疫后2周尾靜脈采血，分離血清。使用hpv16假病毒對(duì)免疫血清的hpv16中和抗體滴度進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖4所示，hpv16l1δn5vlp(16l1δn5)、hpv16l1δn5c31vlp(16l1δn5c31)及hpv16l1wtvlp(16l1wt)免疫小鼠后均可有效誘發(fā)中和抗體，且中和抗體滴度無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。本發(fā)明包括的其他14種截短型hpv16l1突變體vlp采用上述策略免疫小鼠后，誘發(fā)的hpv16中和抗體水平均在400-1600之間，與hpv16l1wtvlp相比亦無(wú)差異。假病毒制備及假病毒中和實(shí)驗(yàn)的方法均是公開(kāi)的，例如專(zhuān)利cn104418942a。實(shí)施例9：hpv16l1δn5c31vlp聯(lián)合佐劑免疫小鼠及中和抗體滴度測(cè)定取4-6周齡的balb/c小鼠，隨機(jī)分11組，分別用hpv16l1δn5c31vlp聯(lián)合聚肌苷酸-聚胞苷酸注射液(pika，南國(guó)藥業(yè))及氫氧化鋁佐劑或mf59佐劑(4.3％角鯊烯，0.5％tween-80，0.5％span-85)免疫小鼠，具體分組及免疫劑量如表3所示。皮下注射，于第0，2周免疫，共2次。第2次免疫后2周尾靜脈采血，分離血清。表3佐劑實(shí)驗(yàn)小鼠分組及劑量組名疫苗成分及劑量無(wú)佐劑組hpv16l1δn5c31vlp0.1μgalumhpv16l1δn5c31vlp0.1μg，al(oh)31μgpikahpv16l1δn5c31vlp0.1μg，pika25μgalum+pika1μghpv16l1δn5c31vlp0.1μg，al(oh)31μg，pika1μgalum+pika10μghpv16l1δn5c31vlp0.1μg，al(oh)31μg，pika10μgalum+pika25μghpv16l1δn5c31vlp0.1μg，al(oh)31μg，pika25μgalum+pika50μghpv16l1δn5c31vlp0.1μg，al(oh)31μg，pika50μgmf59+pika1μghpv16l1δn5c31vlp0.1μg，mf59100μl，pika1μgmf59+pika10μghpv16l1δn5c31vlp0.1μg，mf59100μl，pika10μgmf59+pika25μghpv16l1δn5c31vlp0.1μg，mf59100μl，pika25μgmf59+pika50μghpv16l1δn5c31vlp0.1μg，mf59100μl，pika50μg使用hpv16假病毒對(duì)免疫血清的hpv16中和抗體滴度進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖5所示，單獨(dú)使用氫氧化鋁佐劑或聚肌苷酸-聚胞苷酸佐劑(pika佐劑)對(duì)hpv16l1vlp誘發(fā)的中和抗體水平無(wú)明顯增強(qiáng)效果，但使用氫氧化鋁或mf59聯(lián)合pika佐劑可顯著提高vlp誘發(fā)的中和抗體水平，且與單獨(dú)使用氫氧化鋁或單獨(dú)使用pika佐劑相比，中和抗體水平亦有明顯提高。表明alum/pika復(fù)合佐劑或mf59/pika復(fù)合佐劑可顯著提高疫苗的免疫活性，具有應(yīng)用前景(使用spss軟件，one-wayanova分析)。序列表<110>中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所<120>截短型人乳頭瘤病毒16型l1蛋白及其應(yīng)用<130>370078cg-360032<160>13<170>patentinversion3.3<210>1<211>470<212>prt<213>截短型hpv16<400>1metproserglualathrvaltyrleuproprovalprovalserlys151015valvalserthraspglutyrvalalaargthrasniletyrtyrhis202530alaglythrserargleuleualavalglyhisprotyrpheproile354045lyslysproasnasnasnlysileleuvalprolysvalserglyleu505560glntyrargvalpheargilehisleuproaspproasnlysphegly65707580pheproaspthrserphetyrasnproaspthrglnargleuvaltrp859095alacysvalglyvalgluvalglyargglyglnproleuglyvalgly100105110ileserglyhisproleuleuasnlysleuaspaspthrgluasnala115120125seralatyralaalaasnalaglyvalaspasnargglucysileser130135140metasptyrlysglnthrglnleucysleuileglycyslyspropro145150155160ileglygluhistrpglylysglyserprocysthrasnvalalaval165170175asnproglyaspcysproproleugluleuileasnthrvalilegln180185190aspglyaspmetvalaspthrglypheglyalametaspphethrthr195200205leuglnalaasnlyssergluvalproleuaspilecysthrserile210215220cyslystyrproasptyrilelysmetvalsergluprotyrglyasp225230235240serleuphephetyrleuargarggluglnmetphevalarghisleu245250255pheasnargalaglyalavalglygluasnvalproaspaspleutyr260265270ilelysglyserglyserthralaasnleualaserserasntyrphe275280285prothrproserglysermetvalthrseraspalaglnilepheasn290295300lysprotyrtrpleuglnargalaglnglyhisasnasnglyilecys305310315320trpglyasnglnleuphevalthrvalvalaspthrthrargserthr325330335asnmetserleucysalaalaileserthrsergluthrthrtyrlys340345350asnthrasnphelysglutyrleuarghisglygluglutyraspleu355360365glnpheilepheglnleucyslysilethrleuthralaaspvalmet370375380thrtyrilehissermetasnserthrileleugluasptrpasnphe385390395400glyleuglnproproproglyglythrleugluaspthrtyrargphe405410415valthrserglnalailealacysglnlyshisthrproproalapro420425430lysgluaspproleulyslystyrthrphetrpgluvalasnleulys435440445glulyspheseralaaspleuaspglnpheproleuglyarglysphe450455460leuleuglnalaglyleu465470<210>2<211>466<212>prt<213>截短型hpv16<400>2metglualathrvaltyrleuproprovalprovalserlysvalval151015serthraspglutyrvalalaargthrasniletyrtyrhisalagly202530thrserargleuleualavalglyhisprotyrpheproilelyslys354045proasnasnasnlysileleuvalprolysvalserglyleuglntyr505560argvalpheargilehisleuproaspproasnlyspheglyphepro65707580aspthrserphetyrasnproaspthrglnargleuvaltrpalacys859095valglyvalgluvalglyargglyglnproleuglyvalglyileser100105110glyhisproleuleuasnlysleuaspaspthrgluasnalaserala115120125tyralaalaasnalaglyvalaspasnargglucysilesermetasp130135140tyrlysglnthrglnleucysleuileglycyslysproproilegly145150155160gluhistrpglylysglyserprocysthrasnvalalavalasnpro165170175glyaspcysproproleugluleuileasnthrvalileglnaspgly180185190aspmetvalaspthrglypheglyalametaspphethrthrleugln195200205alaasnlyssergluvalproleuaspilecysthrserilecyslys210215220tyrproasptyrilelysmetvalsergluprotyrglyaspserleu225230235240phephetyrleuargarggluglnmetphevalarghisleupheasn245250255argalaglyalavalglygluasnvalproaspaspleutyrilelys260265270glyserglyserthralaasnleualaserserasntyrpheprothr275280285proserglysermetvalthrseraspalaglnilepheasnlyspro290295300tyrtrpleuglnargalaglnglyhisasnasnglyilecystrpgly305310315320asnglnleuphevalthrvalvalaspthrthrargserthrasnmet325330335serleucysalaalaileserthrsergluthrthrtyrlysasnthr340345350asnphelysglutyrleuarghisglygluglutyraspleuglnphe355360365ilepheglnleucyslysilethrleuthralaaspvalmetthrtyr370375380ilehissermetasnserthrileleugluasptrpasnpheglyleu385390395400glnproproproglyglythrleugluaspthrtyrargphevalthr405410415serglnalailealacysglnlyshisthrproproalaprolysglu420425430aspproleulyslystyrthrphetrpgluvalasnleulysglulys435440445pheseralaaspleuaspglnpheproleuglyarglyspheleuleu450455460glnala465<210>3<211>1518<212>dna<213>全長(zhǎng)hpv16<400>3atgtccctctggttgccatccgaagctacagtctatctcccaccagtcccagtcagtaaa60gttgttagtacagatgaatatgtcgctaggacaaacatctactaccatgctggcacaagt120aggctcctcgctgtcggccacccatacttccccatcaagaagcccaacaacaacaagatc180ctggtccccaaggtgagcggcctgcagtatcgcgtgttccgcatccacctgcccgatcca240aacaaattcggcttccccgatacaagcttctacaaccccgacacccaaagactcgtctgg300gcatgcgtgggcgtcgaagtgggcaggggccaacccctgggcgtcggtatctccggtcac360cccctgctgaacaagctcgacgataccgagaacgcctccgcctacgctgccaacgctggc420gtcgacaaccgcgagtgcatcagcatggactataagcagacccagctctgcctgatcggc480tgtaagccccccatcggtgagcattggggtaaaggcagtccctgcacaaacgtcgctgtg540aaccccggtgactgcccccccctggaactgatcaataccgtcatccaagacggtgacatg600gtcgacaccggtttcggtgccatggatttcaccaccctgcaagccaacaagtccgaggtc660cccctcgacatctgcaccagcatctgtaagtaccccgactacatcaagatggtctccgag720ccctacggtgattcactgttcttctacctgaggcgcgagcagatgttcgtccgccacctg780ttcaaccgcgctggcgctgtcggtgagaacgtgcccgatgacctgtatatcaagggtagc840ggtagcaccgccaacctggcatccagcaactacttccccaccccctccggcagcatggtc900acaagcgacgcacagatctttaacaagccctactggctgcagagggcccaaggtcataac960aacggtatctgctggggcaatcagttgttcgtcaccgtcgtcgacaccaccaggtccacc1020aacatgagcctgtgcgccgcaatcagcaccagcgagaccacctacaagaacaccaatttc1080aaagaatacttgaggcacggtgaagagtacgacctgcaattcatcttccaactctgtaag1140atcacactgaccgccgatgtcatgacctacatccacagcatgaacagcaccatcctcgaa1200gattggaacttcggcttgcagcccccacccggcggtaccttggaggacacctaccgcttc1260gtgaccagtcaagccatcgcctgccagaagcacaccccccccgcccccaaggaagaccca1320ttgaagaagtataccttctgggaagtgaacctgaaagagaaattcagcgctgatttggac1380caattcccactgggaaggaaattcctgttgcaagctggtctcaaggccaaaccaaaattt1440acattaggaaaacgaaaagctacacccaccacctcatctacctctacaactgctaaacgc1500aaaaaacgtaagctgtaa1518<210>4<211>1414<212>dna<213>截短型hpv16<400>4atgccatccgaagctacagtctatctcccaccagtcccagtcagtaaagttgttagtaca60gatgaatatgtcgctaggacaaacatctactaccatgctggcacaagtaggctcctcgct120gtcggccacccatacttccccatcaagaagcccaacaacaacaagatcctggtccccaag180gtgagcggcctgcagtatcgcgtgttccgcatccacctgcccgatccaaacaaattcggc240ttccccgatacaagcttctacaaccccgacacccaaagactcgtctgggcatgcgtgggc300gtcgaagtgggcaggggccaacccctgggcgtcggtatctccggtcaccccctgctgaac360aagctcgacgataccgagaacgcctccgcctacgctgccaacgctggcgtcgacaaccgc420gagtgcatcagcatggactataagcagacccagctctgcctgatcggctgtaagcccccc480atcggtgagcattggggtaaaggcagtccctgcacaaacgtcgctgtgaaccccggtgac540tgcccccccctggaactgatcaataccgtcatccaagacggtgacatggtcgacaccggt600ttcggtgccatggatttcaccaccctgcaagccaacaagtccgaggtccccctcgacatc660tgcaccagcatctgtaagtaccccgactacatcaagatggtctccgagccctacggtgat720tcactgttcttctacctgaggcgcgagcagatgttcgtccgccacctgttcaaccgcgct780ggcgctgtcggtgagaacgtgcccgatgacctgtatatcaagggtagcggtagcaccgcc840aacctggcatccagcaactacttccccaccccctccggcagcatggtcacaagcgacgca900cagatctttaacaagccctactggctgcagagggcccaaggtcataacaacggtatctgc960tggggcaatcagttgttcgtcaccgtcgtcgacaccaccaggtccaccaacatgagcctg1020tgcgccgcaatcagcaccagcgagaccacctacaagaacaccaatttcaaagaatacttg1080aggcacggtgaagagtacgacctgcaattcatcttccaactctgtaagatcacactgacc1140gccgatgtcatgacctacatccacagcatgaacagcaccatcctcgaagattggaacttc1200ggcttgcagcccccacccggcggtaccttggaggacacctaccgcttcgtgaccagtcaa1260gccatcgcctgccagaagcacaccccccccgcccccaaggaagacccattgaagaagtat1320accttctgggaagtgaacctgaaagagaaattcagcgctgatttggaccaattcccactg1380ggaaggaaattcctgttgcaagctggtctctaat1414<210>5<211>1402<212>dna<213>截短型hpv16<400>5atggaagctacagtctatctcccaccagtcccagtcagtaaagttgttagtacagatgaa60tatgtcgctaggacaaacatctactaccatgctggcacaagtaggctcctcgctgtcggc120cacccatacttccccatcaagaagcccaacaacaacaagatcctggtccccaaggtgagc180ggcctgcagtatcgcgtgttccgcatccacctgcccgatccaaacaaattcggcttcccc240gatacaagcttctacaaccccgacacccaaagactcgtctgggcatgcgtgggcgtcgaa300gtgggcaggggccaacccctgggcgtcggtatctccggtcaccccctgctgaacaagctc360gacgataccgagaacgcctccgcctacgctgccaacgctggcgtcgacaaccgcgagtgc420atcagcatggactataagcagacccagctctgcctgatcggctgtaagccccccatcggt480gagcattggggtaaaggcagtccctgcacaaacgtcgctgtgaaccccggtgactgcccc540cccctggaactgatcaataccgtcatccaagacggtgacatggtcgacaccggtttcggt600gccatggatttcaccaccctgcaagccaacaagtccgaggtccccctcgacatctgcacc660agcatctgtaagtaccccgactacatcaagatggtctccgagccctacggtgattcactg720ttcttctacctgaggcgcgagcagatgttcgtccgccacctgttcaaccgcgctggcgct780gtcggtgagaacgtgcccgatgacctgtatatcaagggtagcggtagcaccgccaacctg840gcatccagcaactacttccccaccccctccggcagcatggtcacaagcgacgcacagatc900tttaacaagccctactggctgcagagggcccaaggtcataacaacggtatctgctggggc960aatcagttgttcgtcaccgtcgtcgacaccaccaggtccaccaacatgagcctgtgcgcc1020gcaatcagcaccagcgagaccacctacaagaacaccaatttcaaagaatacttgaggcac1080ggtgaagagtacgacctgcaattcatcttccaactctgtaagatcacactgaccgccgat1140gtcatgacctacatccacagcatgaacagcaccatcctcgaagattggaacttcggcttg1200cagcccccacccggcggtaccttggaggacacctaccgcttcgtgaccagtcaagccatc1260gcctgccagaagcacaccccccccgcccccaaggaagacccattgaagaagtataccttc1320tgggaagtgaacctgaaagagaaattcagcgctgatttggaccaattcccactgggaagg1380aaattcctgttgcaagcttaat1402<210>6<211>38<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>6gaattcgccgccaccatgctctggttgccatccgaagc38<210>7<211>38<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>7gaattcgccgccaccatgtggttgccatccgaagctac38<210>8<211>40<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>8gaattcgccgccaccatgccatccgaagctacagtctatc40<210>9<211>38<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>9gaattcgccgccaccatggaagctacagtctatctccc38<210>10<211>27<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>10tctagattacagcttacgttttttgcg27<210>11<211>32<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>11tctagaattaggccttgagaccagcttgcaac32<210>12<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>12tctagaattagagaccagcttgc23<210>13<211>29<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>13tctagaattaagcttgcaacaggaatttc29當(dāng)前第1頁(yè)12