本發(fā)明涉及生物化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種高通量自動(dòng)化從痰液樣本中提取病原體核酸的試劑盒。

背景技術(shù)：

人體氣管、支氣管的內(nèi)壁都覆蓋著一層粘膜，在粘膜下層含較多的粘液腺和漿液腺。正常情況下，杯狀細(xì)胞和腺體分泌少量粘液覆蓋在粘膜層表面，對(duì)粘膜起保護(hù)作用，可保持氣管粘膜的濕潤(rùn)，以便把吸入氣管、支氣管內(nèi)的塵埃顆粒、細(xì)菌等粘附住，阻擋其進(jìn)入肺組織深處。當(dāng)氣管、支氣管和肺受到有害因素的刺激或致病菌感染而發(fā)生炎癥時(shí)，呼吸道的粘膜充血、水腫，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，血管擴(kuò)張，滲出增加，粘膜層的杯狀細(xì)胞和粘膜下層的腺體增生肥大，粘液分泌大量增多，產(chǎn)生一些變性壞死組織細(xì)胞，滯留在支氣管內(nèi)，粘液和這些變性壞死的組織細(xì)胞就構(gòu)成了痰。正常人一般不咯痰或僅有少量泡沫樣痰或粘液樣痰，當(dāng)呼吸道有病變時(shí)，呼吸道粘膜受刺激，分泌物增多，痰也增多。病變包括支氣管擴(kuò)張癥、肺膿腫、肺結(jié)核、肺癌等；此時(shí)痰液中就會(huì)包含粘液、異物、病原微生物，各種炎癥細(xì)胞及壞死脫落的粘膜上皮細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞等成分。痰液中的細(xì)菌真菌病毒等病原微生物核酸是呼吸道感染等疾病分子診斷的重要標(biāo)本。從呼吸道痰液脫落細(xì)胞中提取病原物核酸（DNA和RNA)，通過(guò)PCR、熒光定量PCR等分子生物學(xué)檢測(cè)手段進(jìn)行基因檢測(cè)，可用于呼吸道感染的快速診斷。

傳統(tǒng)的痰液病原體核酸提取方法為：用氫氧化鈉消化痰液，然后高速離心收集沉淀，用磷酸緩沖液洗滌沉淀2次，離心收集菌體，再利用高溫煮沸，裂解核酸，然后高速離心，取上清即為制備的核酸。此過(guò)程需要反復(fù)的離心洗滌，操作非常復(fù)雜，容易在消化和提取過(guò)程中損失大量核酸，同時(shí)雜質(zhì)去除率低，導(dǎo)致檢測(cè)假陰性；而反復(fù)離心工作不利于核酸檢測(cè)的自動(dòng)化，且該方法不適用于痰液中病原體RNA的提取，不具有通用性，直接限制了通過(guò)痰液進(jìn)行呼吸道感染等疾病的臨床診斷，降低了痰液這一重要臨床樣本在疾病診斷中的價(jià)值。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種高通量自動(dòng)化從痰液樣本中提取病原體核酸的試劑盒。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明可采取下述技術(shù)方案：

本發(fā)明所述的高通量自動(dòng)化從痰液樣本中提取病原體核酸的試劑盒，包括痰液消化試劑，裂解液，磁珠，洗滌液和洗脫液；所述痰液消化試劑為1~6M的 NaOH；所述裂解液是由2~8M的胍鹽、表面活性劑、pH緩沖介質(zhì)和金屬螯合劑配制而成的pH≤3的酸性溶液。

所述胍鹽可以為異硫氰酸胍、鹽酸胍、肌酸胍、碳酸胍、磷酸胍或硝酸胍等，優(yōu)選為異硫氰酸胍，可起到抑制RNase 活性，保護(hù)核酸不被降解的作用，優(yōu)選其濃度為4M；所述表面活性劑可以由SDS、Tween 20、Triton X-100、NP-40、十二烷基肌氨酸鈉、CTAB中的一種或兩種以上組合物組成，其濃度為1~20%，優(yōu)選的表面活性劑為Triton X-100，濃度為10%；所述pH緩沖介質(zhì)為10~100mM 的Tris-HCl，由鹽酸或醋酸調(diào)節(jié)至pH≤3，優(yōu)選pH＜2；所述金屬螯合劑為10~25 mM 的EDTA，用于穩(wěn)定體系pH值，并除去作為核酸酶活性輔因子的金屬離子。

所述磁珠為磁性復(fù)合微粒，由核酸吸附載體和具有超順磁性的磁性納米粒子組成；所述核酸吸附載體為二氧化硅或是用氨基或羧基修飾的聚乙烯醇、多糖、硅樹脂、聚苯乙烯中的一種或兩種以上的混合物；所述超順磁性的磁性納米粒子為Fe、Co、Ni、 Fe₂0₃、Fe₃0₄、Co₂0₃、Co₃0₄中的一種或兩種以上的混合物。

所述洗滌液為檸檬酸鹽緩沖液，或磷酸鹽緩沖液，或75%乙醇的Tris緩沖液，當(dāng)然也可以采用本領(lǐng)域常用的其他洗滌液。

本發(fā)明采用的洗脫液可以為本領(lǐng)域常用的各種洗脫液，如10mM Tris，1mM EDTA，pH 8.0。

本發(fā)明的試劑盒在提取痰液樣本中的病原體（包括細(xì)菌、病毒、真菌）核酸時(shí)無(wú)需離心，便于自動(dòng)化操作；對(duì)痰液樣本中的病毒、細(xì)菌、真菌DNA和RNA均可提取，更具有通用性；提取過(guò)程中無(wú)有機(jī)毒劑，更加安全；提取核酸的純度高，提高了痰液臨床樣本在疾病診斷中的價(jià)值。

本發(fā)明試劑盒提取總核酸（包括DNA和RNA）時(shí)無(wú)需離心，用氫氧化鈉消化痰液后，直接取消化液，將其添加到酸性的裂解液中后直接加磁珠，酸堿中和反應(yīng)與樣本裂解反應(yīng)、核酸吸附反應(yīng)一步完成；特制的核酸溶液能保護(hù)核酸DNA和RNA，同時(shí)維持適合磁珠核酸吸附的pH環(huán)境和高鹽環(huán)境；用洗滌液洗滌雜質(zhì)和殘留的鹽分，洗脫核酸即制備出痰液總核酸（DNA和RNA）。

附圖說(shuō)明

圖1是采用本發(fā)明實(shí)施例1制備的試劑盒從痰液中提取白色念球菌DNA的Realtime PCR擴(kuò)增圖。

圖2是采用本發(fā)明實(shí)施例2制備的試劑盒從痰液中提取合胞病毒 RNA和梯度稀釋RNA 的Realtime PCR擴(kuò)增圖。

圖3是采用本發(fā)明實(shí)施例3制備的試劑盒從痰液中提取支原體DNA和梯度稀釋DNA的RealtimePCR擴(kuò)增圖。

具體實(shí)施方式

下面通過(guò)具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步解釋，以幫助理解本發(fā)明。

實(shí)施例1

一、本發(fā)明高通量自動(dòng)化從痰液樣本中提取病原體核酸的試劑盒，包括下述試劑：

1）痰液消化液：氫氧化鈉，濃度1M；

2）裂解液：pH＜1.0，包括

異硫氰酸胍，濃度4M，

Trizma?HCl，濃度50mM，

Triton X-100（v/v,%），濃度10%，

EDTA ，濃度10mM，

HCl，濃度0.1M；

3）洗滌液：檸檬酸鈉，濃度10 mM，pH 6.0；

4）洗脫液：pH 8.0，包括

Trizma?Base，濃度10 mM，

EDTA，濃度1 mM；

5）磁珠 20 ul。

二、取臨床痰液培養(yǎng)鑒定白色念球菌陽(yáng)性的患者痰液標(biāo)本，使用上述試劑在自動(dòng)化移液工作站上進(jìn)行痰液核酸提取，具體步驟包括：

1）將痰液標(biāo)本內(nèi)加入3倍量的痰液消化液，室溫靜置30min液化；

2）吸取液化后的樣本上清，取300ul 消化物至離心管中，加入600ul 裂解液和20ul 磁珠；

3）吸打混勻10次，室溫靜置5min；

4）將離心管放置于磁力架上，磁吸1min，去上清；

5）加600ul洗液，吸打混勻10次；

6）將離心管放置于磁力架上，磁吸1min，去上清；

7）重復(fù)加600ul洗液，吸打混勻5次；

8）上磁力架，磁吸1min，取上清；

9）加100ul 洗脫液，80℃ 5min；上磁力架磁吸1min，取洗脫液物即為提取的核酸；

10）用制備的核酸和系列10倍梯度稀釋制備的核酸，用于Realtime PCR擴(kuò)增鑒定提取結(jié)果，如下表1和附圖1所示。

表1

結(jié)論：從痰液中成功提取到了白色念球菌DNA核酸，經(jīng)10倍梯度稀釋核酸后，曲線典型，梯度均一，說(shuō)明提取的純度高。

實(shí)施例2

一、本發(fā)明高通量自動(dòng)化從痰液樣本中提取病原體核酸的試劑盒，包括下述試劑：

1）痰液消化液：氫氧化鈉，濃度1M；

2）裂解液：pH＜2.0，包括

異硫氰酸胍，濃度4M，

Trizma?HCl，濃度50mM，

Triton X-100（v/v,%），濃度10%，

EDTA ，濃度10mM，

HCl，濃度50mM；

3）洗滌液：檸檬酸鈉，濃度10 mM，pH 6.0；

4）洗脫液：pH 8.0，包括

Trizma?Base，濃度10 mM，

EDTA，濃度1 mM；

5）磁珠 20 ul。

二、取臨床PCR鑒定呼吸道合胞病毒感染患者的痰液標(biāo)本，使用上述試劑在自動(dòng)化移液工作站上進(jìn)行痰液核酸提取，具體步驟包括：

1）將痰液標(biāo)本內(nèi)加入3倍量的痰液消化液，室溫靜置30min液化；

2）吸取液化后的樣本上清，取200ul 消化物至離心管中，加入400ul 裂解液和20ul 磁珠；

3）吸打混勻10次，室溫靜置5min；

4）將離心管放置于磁力架上，磁吸1min，去上清；

5）加600ul洗液，吸打混勻10次；

6）將離心管放置于磁力架上，磁吸1min，去上清；

7）重復(fù)加600ul洗液，吸打混勻5次；

8）上磁力架，磁吸1min，取上清；

9）加100ul 洗脫液，80℃ 5min；上磁力架磁吸1min，取洗脫液物即為提取的核酸；

10）用制備的核酸和系列10倍梯度稀釋制備的核酸，用于Realtime PCR擴(kuò)增鑒定提取結(jié)果，如下表2和附圖2所示。

表2

結(jié)論：從痰液中成功提取到了呼吸道合胞病毒核酸RNA，經(jīng)10倍梯度稀釋核酸后，曲線典型，梯度均一，說(shuō)明提取的純度高。

實(shí)施例3

一、本發(fā)明高通量自動(dòng)化從痰液樣本中提取病原體核酸的試劑盒，包括下述試劑：

1）痰液消化液：氫氧化鈉，濃度1M；

2）裂解液：pH＜2.0，包括

異硫氰酸胍，濃度4M，

Trizma?HCl，濃度50mM，

Triton X-100（v/v,%），濃度10%，

EDTA ，濃度10mM，

HCl，濃度50mM；

3）洗滌液：檸檬酸鈉，濃度10 mM，pH 6.0；

4）洗脫液：pH 8.0，包括

Trizma?Base，濃度10 mM，

EDTA，濃度1 mM；

5）磁珠 20 ul。

二、取臨床PCR鑒定支原體肺炎感染患者的痰液標(biāo)本，使用上述試劑在自動(dòng)化移液工作站上進(jìn)行痰液核酸提取，具體步驟包括：

1）將痰液標(biāo)本內(nèi)加入3倍量的痰液消化液，室溫靜置30min液化；

2）吸取液化后的樣本上清，取500ul 消化物至離心管中，加入1000ul 裂解液和20ul 磁珠；

3）吸打混勻10次，室溫靜置5min；

4）將離心管放置于磁力架上，磁吸1min，去上清；

5）加600ul洗液，吸打混勻10次；

6）將離心管放置于磁力架上，磁吸1min，去上清；

7）重復(fù)加600ul洗液，吸打混勻5次；

8）上磁力架，磁吸1min，取上清；

9）加100ul 洗脫液，80℃ 5min；上磁力架磁吸1min，取洗脫液物即為提取的核酸；

10）用制備的核酸和系列10倍梯度稀釋制備的核酸，用于Realtime PCR擴(kuò)增鑒定提取結(jié)果，如下表3和附圖3所示。

表3

結(jié)論：從痰液中成功提取到了支原體細(xì)菌核酸DNA，經(jīng)10倍梯度稀釋核酸后，曲線典型，梯度均一，說(shuō)明提取的純度高。