本發(fā)明涉及免疫學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種用于免疫熒光檢測(cè)的SETD3抗體的制備方法。

背景技術(shù)：

SETD3是一個(gè)具有經(jīng)典SET保守結(jié)構(gòu)(Su(var)3-9,Enhancer-of-zeste以及Trithorax)的一個(gè)甲基化轉(zhuǎn)移酶。SETD3自身還包含有一個(gè)稱為Rubis-subs-bind的結(jié)構(gòu)域。SETD3首次被發(fā)現(xiàn)是因?yàn)槠滢D(zhuǎn)錄本水平在喂食過程中被調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)，斑馬魚中的SETD3具有對(duì)組蛋白H3K36位殘基的單、雙、三甲基化功能以及通過誘導(dǎo)caspase-3的激活進(jìn)而抑制細(xì)胞生存能力的功能。最近的研究顯示，鼠源的SETD3可以通過結(jié)合在肌生因子myogenin的啟動(dòng)子處來誘導(dǎo)肌肉細(xì)胞的分化過程，因此鼠源的SETD3在此處扮演了轉(zhuǎn)錄因子的角色，相對(duì)應(yīng)的，鼠源的SETD3被證明具有組蛋白H3K4和H3K36位的甲基化轉(zhuǎn)移酶活性。人源的SETD3蛋白被發(fā)現(xiàn)可以跟很多蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用，其中可以甲基化轉(zhuǎn)錄因子FoxM1。兩者的結(jié)合可以抑制VEGF的轉(zhuǎn)錄。

鑒于SETD3蛋白的多種功能，研究該蛋白的重要工具——抗體的優(yōu)劣決定了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。目前商品化的SETD3兔多克隆抗體有Abcam(ab177582),abcam(ab200950)，Sigma(HPA003639)，Thermo fisher(PA5-43675)，Atlas(HPA003591)；鼠單克隆抗體有Thermo Fisher(730058)。這些抗體除了Atlas抗體顯示可以用于免疫熒光外，其他抗體都只能用于Western blot實(shí)驗(yàn)。但是Atlas抗體的效價(jià)不高，稀釋比例均大于1:1000。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種用于免疫熒光檢測(cè)的SETD3抗體的制備方法。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：一種用于免疫熒光檢測(cè)的SETD3抗體的制備方法，包括以下步驟：

a)用N端6xHis標(biāo)簽的全長(zhǎng)SETD3表達(dá)的蛋白免疫兔子并提取被免疫兔子的血清；

b)用Affi-Gel偶聯(lián)的GST標(biāo)簽的全長(zhǎng)SETD3蛋白純化兔子的血清。

優(yōu)選地，用N端6xHis標(biāo)簽的全長(zhǎng)SETD3表達(dá)的蛋白免疫兔子時(shí)間為：主注射、主注射后的第28天、主注射后的第42天、主注射后的第60天、主注射后的第78天。

優(yōu)選地，免疫主注射后的第102天提取被免疫兔子的血清。

優(yōu)選地，主注射0.5mg抗原、主注射后的第28天注射0.6mg抗原、主注射后的第42天注射0.6mg抗原、主注射后的第60天注射0.4mg抗原、主注射后的第78天注射0.4mg抗原。

優(yōu)選地，N端6xHis標(biāo)簽的全長(zhǎng)SETD3表達(dá)的蛋白為經(jīng)鎳柱樹脂純化后蛋白。

優(yōu)選地，用Affi-Gel偶聯(lián)GST標(biāo)簽的全長(zhǎng)SETD3蛋白步驟包括：

c)用谷胱甘肽樹脂純化GST標(biāo)簽的全長(zhǎng)SETD3蛋白；

d)將GST標(biāo)簽純化的SETD3蛋白透析兩次,將透析后GST標(biāo)簽純化的SETD3蛋白蛋白質(zhì)與事先用冷水平衡的Affi-Gel 15樹脂在4攝氏度下偶聯(lián)十二小時(shí)；

e)用PBS溶液清洗Affi-Gel柱子；

f)用檸檬酸鈉溶液清洗柱子并用該溶液平衡Affi-Gel柱子；

g)將平衡后Affi-Gel柱子與庚二亞氨酸二甲酯在室溫下反應(yīng)30分鐘；

h)用Tris-HCl溶液終止反應(yīng)2小時(shí)后，并用PBS溶液清洗Affi-Gel柱子。

優(yōu)選地，加入兔子的血清到Affi-Gel柱子上，并與Affi-Gel柱子在4攝氏度孵育十二小時(shí)。

優(yōu)選地，用TBS-T溶液清洗Affi-Gel柱子，用Glycine溶液洗脫結(jié)合的抗體，收集的抗體用Tris-HCl溶液中和洗脫液。

優(yōu)選地，測(cè)定所收集抗體的濃度，并濃縮抗體到1mg/ml的濃度，用PBS溶液透析濃縮的抗體十二小時(shí)后，在其中加入10％的甘油，分裝后零下80攝氏度保存。

優(yōu)選地，N端6xHis標(biāo)簽的全長(zhǎng)SETD3和GST標(biāo)簽的全長(zhǎng)人源SETD3蛋白均為克隆基因，并在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)。

本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明的SETD3抗體可用于免疫印跡(WB)、免疫熒光(IF)、免疫組化(IHC)、以及免疫沉淀(IP)多種用途，且效價(jià)和特異性較高。

下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述。

附圖說明

圖1是檢測(cè)本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施例兔源SETD3抗體特異性的分析圖；

圖2是免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施例兔源SETD3抗體的分析圖。

具體實(shí)施方式

為了更充分理解本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容，下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)一步介紹和說明。

一種用于免疫熒光檢測(cè)的SETD3抗體的制備方法優(yōu)選實(shí)施例：

1、克隆N端6xHis和GST標(biāo)簽的全長(zhǎng)人源SETD3蛋白基因，并在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)。

2、用鎳柱樹脂純化N端6xHis標(biāo)簽SETD3蛋白，用谷胱甘肽樹脂純化GST標(biāo)簽的SETD3蛋白各5mg。

3、用純化N端His標(biāo)簽SETD3蛋白同時(shí)免疫兩只新西蘭大兔子，主注射0.5mgN端His標(biāo)簽SETD3蛋白抗原、在主注射后第28天注射0.6mgN端His標(biāo)簽SETD3蛋白抗原、在主注射后第42天注射0.6mgN端His標(biāo)簽SETD3蛋白抗原、在主注射后第60天注射0.4mgN端His標(biāo)簽SETD3蛋白抗原、在主注射后第78天注射0.4mgN端His標(biāo)簽SETD3蛋白抗原，共5次免疫新西蘭大白兔。在免疫后第102天處死兔子后提取血清。

4、將5mg的GST標(biāo)簽純化的SETD3蛋白在0.1M MOPS、pH7.5的溶液中透析兩次。將透析后的蛋白質(zhì)與事先用冷水平衡的Affi-Gel 15樹脂在4攝氏度偶聯(lián)十二小時(shí)。

5、用10個(gè)柱體積的PBS溶液清洗Affi-Gel柱子5次，然后用0.2M的檸檬酸鈉溶液(pH9.0)清洗Affi-Gel柱子一次并用該溶液平衡柱子，再行加入20mM的庚二亞氨酸二甲酯DMP，在室溫(17至25攝氏度)下反應(yīng)30分鐘，然后用1M Tris-HCl pH 7.7的溶液終止反應(yīng)2小時(shí)，并用10個(gè)柱體積的PBS溶液清洗Affi-Gel柱子。

6、加入15ml的所提取的兔子血清到Affi-Gel柱子上，與

Affi-Gel柱子在4攝氏度下孵育十二小時(shí)后，用TBS-T溶液清洗Affi-Gel柱子10次，再用0.1M Glycine、pH 2.5的溶液洗脫結(jié)合的抗體，每1ml組分收集為一管，并用2M Tris-HCl、pH 8.5的溶液中和洗脫液。

7、測(cè)定所收集抗體濃度，并濃縮抗體到1mg/ml的濃度，用PBS

溶液透析抗體十二小時(shí)，然后將抗體溶液中加入10％的甘油，分裝后下零下80攝氏度保存。

將上述步驟所獲得抗體兔源SETD3抗體進(jìn)行特異性分析，所得結(jié)果如圖1所示：

A圖在Hela細(xì)胞中，分別構(gòu)建了穩(wěn)轉(zhuǎn)空載(shControl)或敲低SETD3(shSETD3)的穩(wěn)定細(xì)胞系，用自己制備的抗體Western Blot檢測(cè)兩種細(xì)胞中的SETD3的蛋白表達(dá)水平，其中GAPDH為內(nèi)參。SETD3抗體稀釋比例:1:5000

B圖在經(jīng)過抗原親和層析純化的SETD3抗體中分別加入BSA以及原核表達(dá)純化的His標(biāo)簽的SETD3蛋白，然后將這兩種抗體作為一抗分別與A圖中構(gòu)建的穩(wěn)定細(xì)胞系樣品進(jìn)行抗體孵育2個(gè)小時(shí)，Western Blot檢測(cè)空載和shSETD3細(xì)胞系中SETD3的蛋白表達(dá)水平，其中GAPDH為內(nèi)參。結(jié)論：本發(fā)明的兔源SETD3抗體特異性較高，可以有效識(shí)別內(nèi)源的SETD3蛋白。

免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)上述兔源SETD3抗體，所得結(jié)果如圖2所示；在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染空載(shControl)或敲低SETD3(shSETD3)的細(xì)胞中用制備的SETD3抗體進(jìn)行免疫熒光反應(yīng)實(shí)驗(yàn)。DAPI代表細(xì)胞核的染色情況；SETD3代表本發(fā)明所制備的SETD3抗體免疫檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)源的SETD3蛋白定位情況(一抗稀釋比例：1:2000)；MERGE代表前兩張免疫信號(hào)的疊加。shControl代表對(duì)照組，shSETD3代表用shRNA特異性敲低內(nèi)源SETD3蛋白。由圖2可見，敲低SETD3后，SETD3在細(xì)胞質(zhì)中的定位信號(hào)明顯減弱。結(jié)論：敲低SETD3的樣品證明抗體識(shí)別的高特異性。

以上所述僅以實(shí)施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容，以便于讀者更容易理解，但不代表本發(fā)明的實(shí)施方式僅限于此，任何依本發(fā)明所做的技術(shù)延伸或再創(chuàng)造，均受本發(fā)明的保護(hù)?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。