本發(fā)明屬于基因擴(kuò)增領(lǐng)域，涉及一種解決等位基因擴(kuò)增不平衡的方法，具體涉及一種通過(guò)pcr添加劑解決等位基因擴(kuò)增不平衡的方法。

背景技術(shù)：

pcr技術(shù)即基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是一種可以特異放大擴(kuò)增特定基因片段的技術(shù)，可以使基因片段數(shù)萬(wàn)倍的增加。其原理的核心是寡核苷酸引物與單鏈dna模板中的一段互補(bǔ)序列結(jié)合雜交，形成部分雙鏈，在dna聚合酶的作用下進(jìn)行dna合成。而寡核苷酸引物與單鏈dna模板的結(jié)合是基于堿基配對(duì)原則：堿基配對(duì)遵循g(鳥(niǎo)嘌呤)：c(胞嘧啶)、a(腺嘌呤)：t(胸腺嘧啶)/u(尿嘧啶)的watson-crick堿基配對(duì)原則。

人體內(nèi)每個(gè)細(xì)胞內(nèi)有23對(duì)染色體，通?；?yàn)殡p等位基因。進(jìn)行普通pcr擴(kuò)增時(shí)，兩個(gè)等位基因一般情況下沒(méi)有擴(kuò)增效率的差異。但在復(fù)雜基因時(shí)，影響pcr擴(kuò)增效率的因素會(huì)導(dǎo)致兩個(gè)等位基因的擴(kuò)增效率存在明顯擴(kuò)增差異，即等位基因擴(kuò)增不平衡，嚴(yán)重時(shí)可出現(xiàn)一個(gè)等位基因擴(kuò)增產(chǎn)量極少(擴(kuò)增失敗)，雜合的等位基因被錯(cuò)誤的檢測(cè)為純合等位基因。例如hla基因就是典型的復(fù)雜基因，具有高gc含量、高度同源性，高度多態(tài)性等特點(diǎn)。目前，hla基因總數(shù)已經(jīng)超過(guò)1萬(wàn)個(gè)，這些基因的有效擴(kuò)增是hla高分辨分型的重要基礎(chǔ)。但以上特點(diǎn)決定了hla基因的擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)特別困難以及擴(kuò)增難度很高，容易出現(xiàn)hla基因非特異擴(kuò)增、等位基因丟失或等位基因擴(kuò)增不平衡等問(wèn)題，即相應(yīng)基因擴(kuò)增效率低或失敗(擴(kuò)增不平衡)使雜合基因位點(diǎn)丟失一個(gè)等位基因，分型錯(cuò)誤為純合基因位點(diǎn)。

pcr過(guò)程中，兩個(gè)等位基因的dna雙鏈會(huì)發(fā)生解鏈。其中一個(gè)等位基因解鏈時(shí)，由于堿基配對(duì)，單鏈dna因自身序列堿基特點(diǎn)可能會(huì)形成復(fù)雜二級(jí)結(jié)構(gòu)；或者由于序列堿基特點(diǎn)使dna雙鏈解鏈不充分，這些對(duì)dna聚合酶延伸產(chǎn)生影響，從而影響pcr的擴(kuò)增效率；但另外一個(gè)等位基因擴(kuò)增效率卻正常。這就導(dǎo)致了兩個(gè)等位基因擴(kuò)增效率的差異，即等位基因擴(kuò)增不平衡。針對(duì)以上出現(xiàn)的等位基因擴(kuò)增不平衡現(xiàn)象，現(xiàn)有技術(shù)采用如下策略進(jìn)行解決：針對(duì)擴(kuò)增效率低的等位基因設(shè)計(jì)特異性引物，使用特異性擴(kuò)增的方式解決。

然而現(xiàn)有的解決方案存在著如下弊端：特異性擴(kuò)增單個(gè)等位基因，在面臨高度復(fù)雜的基因，例如hla基因，有大量的等位基因。有些等位基因會(huì)因復(fù)雜二級(jí)結(jié)構(gòu)或解鏈不充分等導(dǎo)致擴(kuò)增不平衡。如果采用發(fā)現(xiàn)一個(gè)等位基因擴(kuò)增不平衡，就設(shè)計(jì)一條特異性引物策略，很快就會(huì)面臨需要設(shè)計(jì)大量引物，引物設(shè)計(jì)極其困難的情況。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了有效的解決等位基因擴(kuò)增不平衡的問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種解決等位基因擴(kuò)增不平衡的方法。

本發(fā)明所提供的解決等位基因擴(kuò)增不平衡的方法，是針對(duì)由于“部分待測(cè)等位基因在pcr擴(kuò)增過(guò)程中解鏈形成復(fù)雜二級(jí)結(jié)構(gòu)或/和dna雙鏈解鏈不充分，而其余待測(cè)等位基因擴(kuò)增效率正?！倍鴮?dǎo)致的等位基因擴(kuò)增不平衡的情況的，具體可包括如下步驟：通過(guò)向原有pcr反應(yīng)體系中加入pcr添加劑，來(lái)降低雙螺旋dna的穩(wěn)定性，使二級(jí)結(jié)構(gòu)易于打開(kāi)，dna聚合酶延伸時(shí)更加容易通過(guò)二級(jí)結(jié)構(gòu)區(qū)，從而解決所述待測(cè)等位基因擴(kuò)增不平衡的問(wèn)題；所述原有pcr反應(yīng)體系為：對(duì)所述待測(cè)等位基因進(jìn)行pcr擴(kuò)增，出現(xiàn)所述待測(cè)等位基因擴(kuò)增不平衡情況時(shí)所采用的pcr反應(yīng)體系。

其中，所述pcr添加劑是pcr反應(yīng)中的一種增效劑，在pcr反應(yīng)中傳統(tǒng)上起到提高pcr反應(yīng)的特異性、增加pcr擴(kuò)增的產(chǎn)量及防止無(wú)效擴(kuò)增等有益效果。

在所述方法中，所述pcr添加劑可為任意pcr添加劑中的任一種或任幾種，例如：甜菜堿、甲酰胺、dmso等。

其中，向所述原有pcr反應(yīng)體系中加入的所述pcr添加劑的量以達(dá)到所述待測(cè)等位基因擴(kuò)增平衡，即等位基因擴(kuò)增效率接近或一致為度。

所述方法中，在pcr擴(kuò)增體系中，可以以濃度梯度形式，逐步增加所述pcr添加劑的量，一直增加至能使所述待測(cè)等位基因擴(kuò)增平衡，即等位基因擴(kuò)增效率接近或一致。

在所述方法中，所述待測(cè)等位基因可為任意基因，特別是高度復(fù)雜的基因，例如hla基因，具體如hla-dqb1基因。

在本發(fā)明中，所述待測(cè)等位基因具體為基因型分別為dqb1*03:03:02(imgt/hlaaccno:hla00629)和dqb1*06:01:01(imgt/hlaaccno:hla00643)的hla-dqb1基因。

在本發(fā)明的第一個(gè)實(shí)例中，是通過(guò)向所述原有pcr反應(yīng)體系中加入0.4-0.6m的甜菜堿來(lái)解決所述待測(cè)等位基因(基因型分別為dqb1*03:03:02和dqb1*06:01:01的hla-dqb1基因)擴(kuò)增不平衡的問(wèn)題的。

在本發(fā)明的第二個(gè)實(shí)例中，是通過(guò)向所述原有pcr反應(yīng)體系中加入1％-2.5％體積百分含量的甲酰胺來(lái)解決所述待測(cè)等位基因(基因型分別為dqb1*03:03:02和dqb1*06:01:01的hla-dqb1基因)擴(kuò)增不平衡的問(wèn)題的。

在本發(fā)明的第三個(gè)實(shí)例中，是通過(guò)向所述原有pcr反應(yīng)體系中加入1％-5％體積百分含量的dmso來(lái)解決所述待測(cè)等位基因(基因型分別為dqb1*03:03:02和dqb1*06:01:01的hla-dqb1基因)擴(kuò)增不平衡的問(wèn)題的。

對(duì)所述基因型分別為dqb1*03:03:02和dqb1*06:01:01的hla-dqb1基因進(jìn)行pcr擴(kuò)增時(shí)，采用的引物對(duì)為由序列表中序列1和序列2所示的兩條dna單鏈組成的引物對(duì)。

相應(yīng)的，所述原有pcr反應(yīng)體系具體參見(jiàn)實(shí)施例1。

對(duì)所述基因型分別為dqb1*03:03:02和dqb1*06:01:01的hla-dqb1基因進(jìn)行pcr擴(kuò)增時(shí)，擴(kuò)增程序如下：96℃3min；96℃25s，60℃45s，72℃45s，35個(gè)循環(huán)；72℃5min；12℃保存。

本發(fā)明針對(duì)由于“部分待測(cè)等位基因在pcr擴(kuò)增過(guò)程中解鏈形成復(fù)雜二級(jí)結(jié)構(gòu)或/和dna雙鏈解鏈不充分，而其余待測(cè)等位基因擴(kuò)增效率正?！倍鴮?dǎo)致的等位基因擴(kuò)增不平衡的情況，提供了通過(guò)向原有pcr反應(yīng)體系中加入一定濃度的pcr添加劑解決等位基因擴(kuò)增不平衡的方法。實(shí)驗(yàn)證明，該方法確實(shí)可以有效的解決由于部分待測(cè)等位基因在pcr擴(kuò)增過(guò)程中解鏈形成復(fù)雜二級(jí)結(jié)構(gòu)或/和dna雙鏈解鏈不充分，而其余待測(cè)等位基因擴(kuò)增效率正常而導(dǎo)致的等位基因擴(kuò)增不平衡。

附圖說(shuō)明

圖1為對(duì)dqb1*03:03:02/dqb1*06:01:01組合樣品進(jìn)行pcr擴(kuò)增時(shí)反應(yīng)體系中加入不同濃度甜菜堿組的測(cè)序結(jié)果。

圖2為對(duì)dqb1*03:03:02/dqb1*06:01:01組合樣品進(jìn)行pcr擴(kuò)增時(shí)反應(yīng)體系中加入不同濃度甲酰胺組的測(cè)序結(jié)果。

圖3為對(duì)dqb1*03:03:02/dqb1*06:01:01組合樣品進(jìn)行pcr擴(kuò)增時(shí)反應(yīng)體系中加入不同濃度dmso組的測(cè)序結(jié)果。

具體實(shí)施方式

下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。

下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。

實(shí)施例、通過(guò)pcr添加劑解決等位基因擴(kuò)增不平衡

pcr添加劑是pcr反應(yīng)中的一種增效劑，常見(jiàn)種類(lèi)有甲酰胺、甜菜堿、dmso等。本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)，pcr添加劑可以降低雙螺旋dna的穩(wěn)定性，使二級(jí)結(jié)構(gòu)易于打開(kāi)，有助于dna聚合酶延伸通過(guò)二級(jí)結(jié)構(gòu)區(qū)。對(duì)于pcr過(guò)程中，兩個(gè)等位基因中的一個(gè)等位基因的單鏈形成復(fù)雜二級(jí)結(jié)構(gòu)或dna雙鏈解鏈不充分，導(dǎo)致兩個(gè)等位基因擴(kuò)增效率不一致即擴(kuò)增不平衡的問(wèn)題，可以加入一定濃度的類(lèi)似甜菜堿的pcr添加劑來(lái)解決此類(lèi)問(wèn)題。

下面以具體實(shí)例對(duì)這種通過(guò)pcr添加劑解決等位基因擴(kuò)增不平衡問(wèn)題的方法進(jìn)行闡述。

等位基因：基因型分別為dqb1*03:03:02(imgt/hlaaccno:hla00629)和dqb1*06:01:01(imgt/hlaaccno:hla00643)的hla-dqb1基因。

1、原有pcr引物、反應(yīng)體系和反應(yīng)程序

(1)pcr引物

用于擴(kuò)增dqb1*03:03:02及dqb1*06:01:01等位基因的引物：

dqb-f：5’-tgattccccgcagaggatttcg-3’(序列1)；

dqb-r：5’-aggggcgacgacgctcacctc-3’(序列2)。

(2)反應(yīng)體系：

(3)反應(yīng)程序：

96℃3min；96℃25s，60℃45s，72℃45s，35個(gè)循環(huán)；72℃5min；12℃保存。

結(jié)果顯示：采用如上原有pcr引物、反應(yīng)體系和反應(yīng)程序?qū)蛐蜑閐qb1*03:03:02/dqb1*06:01:01雜合型的hla-dqb1基因進(jìn)行pcr擴(kuò)增時(shí)，會(huì)產(chǎn)生等位基因擴(kuò)增不平衡的情況，dqb1*03:03:02/dqb1*06:01:01組合中dqb1*03:03:02的測(cè)序峰很低，即出現(xiàn)了擴(kuò)增不平衡的情況。如圖1、圖2、圖3中“0m”/“0％”所示。

2、改變后的pcr擴(kuò)增條件

擴(kuò)增引物和pcr擴(kuò)增反應(yīng)程序完全同步驟1。

反應(yīng)體系改為如下(1)或(2)或(3)：

(1)在步驟1的反應(yīng)體系基礎(chǔ)上，加入終濃度分別為0m、0.2m、0.4m、0.6m、0.8m、1.0m的甜菜堿。

(2)在步驟1的反應(yīng)體系基礎(chǔ)上，加入終濃度分別為0％、1％、1.25％、2.5％、5％的甲酰胺。其中，％表示體積百分含量。

(3)在步驟1的反應(yīng)體系基礎(chǔ)上，加入終濃度分別為0％、1％、5％、10％、12％的dmso。其中，％表示體積百分含量。

結(jié)果顯示：采用改變后的pcr擴(kuò)增條件對(duì)基因型為dqb1*03:03:02/dqb1*06:01:01雜合型的hla-dqb1基因進(jìn)行pcr擴(kuò)增，在不加入pcr添加劑(0m/0％濃度)的情況下，雜合位點(diǎn)dqb1*03:03:02的測(cè)序峰很低；隨著pcr添加劑濃度的增大，dqb1*03:03:02測(cè)序峰相對(duì)高度逐漸升高，dqb1*06:01:01測(cè)序峰相對(duì)高度逐漸降低。在甜菜堿濃度為0.4m-0.6m范圍、甲酰胺濃度為1％-2.5％、dmso濃度在1％-5％內(nèi)，2個(gè)等位基因測(cè)序峰高無(wú)明顯差異。分別如圖1、圖2、圖3所示。

<110>北京博奧晶典生物技術(shù)有限公司；成都博奧晶芯生物科技有限公司

<120>通過(guò)pcr添加劑解決等位基因擴(kuò)增不平衡的方法

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<212>dna

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