本發(fā)明涉及化合物領(lǐng)域，具體涉及一類(lèi)靶向FAK(Focal Adhesion Kinase，黏著斑激酶)的化合物和其F-18標(biāo)記物，以及它們的制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

腫瘤是危害人類(lèi)健康和生命的主要疾病之一，對(duì)腫瘤的早期診斷和個(gè)體化治療也成為放射性藥物研究的一個(gè)重要熱點(diǎn)。粘著斑激酶(Focal Adhesion Kinase,FAK)的作用涉及腫瘤發(fā)生、發(fā)展等多個(gè)環(huán)節(jié)，參與腫瘤細(xì)胞黏附、侵襲、遷移、增殖及凋亡等多種生物學(xué)行為。FAK幾乎在所有的腫瘤細(xì)胞中都存在過(guò)度表達(dá)現(xiàn)象，因此FAK表達(dá)水平可以作為腫瘤早期診斷、治療和預(yù)后評(píng)價(jià)的指標(biāo)，是腫瘤診治的重要靶點(diǎn)。

人們已經(jīng)研制出多種小分子的FAK抑制劑，有些甚至已經(jīng)在進(jìn)行臨床II期研究(但直到目前為止，還沒(méi)有一種FAK抑制劑上市)。我們將小分子的FAK抑制劑大體上分為兩大類(lèi)：(1)靶向FAK的酶活激酶依賴(lài)功能的FAK抑制劑，包括靶向FAK的ATP結(jié)合位點(diǎn)結(jié)構(gòu)域的抑制劑和雖然是靶向FAK的變構(gòu)位點(diǎn)，但仍然能夠阻斷激酶活性的FAK抑制劑。前者例如諾華公司的7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidine類(lèi)、NVP-TAC544、NVP-TAE226；輝瑞公司的PF-573,228,PF-562,271(正在進(jìn)行臨床II期研究，F(xiàn)AK和PYK2雙通道抑制劑，其中FAK體外酶活性抑制的IC₅₀＝1.5nM)、PF-431,396、PF-04554878；默克公司的1H-Pyrrolo[2,3-b]-and 3H-Imidazolo[4,5-b]-Pyridines類(lèi)；Poniard公司的PND-1186；Cephalon公司的pyrrolo[2,1-f][1,2,4]triazine類(lèi)；UniversitéParis Descartes的diarylamino-1,3,5-triazine類(lèi)、Imidazo[1,2-a][1,3,5]triazine類(lèi)；葛蘭素史克公司的GSK2256098；Verastem公司的VS-6063、VS-4718、VS-5095；Teva Branded Pharmaceutical Products R&D公司的CEP-37440(正在完成臨床I期研究，F(xiàn)AK和ALK雙通道抑制劑，其中FAK體外酶活性抑制的IC₅₀＝2.0nM)。后者例如University of Florida的Y15；Takeda公司的pyrazolo[4,3-c][2,1]benzothiazines；(2)靶向FAK的支架功能的抑制劑，例如University of Florida的(CFAK)C4；INT2-31；M13；R2。

本發(fā)明設(shè)計(jì)和合成了新型的靶向FAK的5-氯-1,3-嘧啶類(lèi)和1,3,5-三嗪類(lèi)腫瘤腫瘤生長(zhǎng)抑制劑；另外，據(jù)我們所知，直到目前為止，在靶向FAK的小分子藥物研究方面，人們只是在普藥層面上進(jìn)行了作為腫瘤治療藥物的FAK小分子抑制劑的研究，先前并沒(méi)有在放射性藥物層面上進(jìn)行靶向FAK的用于腫瘤早期診斷的藥物的研究報(bào)道。因此，我們同樣也進(jìn)行了新型F-18標(biāo)記的靶向FAK的用于腫瘤早期診斷的腫瘤顯像劑的研究。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的首要目的在于：提出一類(lèi)新的靶向FAK的化合物，可以作為有效的腫瘤生長(zhǎng)抑制劑分子。

本發(fā)明的另一目的在于：基于所述靶向FAK的化合物提出一類(lèi)放射性標(biāo)記物，可以作為優(yōu)良的腫瘤顯像劑，用于腫瘤的早期診斷。

本發(fā)明的再一目的在于：提出制備所述靶向FAK的化合物和所述放射性標(biāo)記物的方法。

本發(fā)明的還一個(gè)目的在于：提出所述靶向FAK的化合物、所述放射性標(biāo)記物在制備腫瘤早期治療或診斷藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明的上述目的通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

首先，提出一類(lèi)靶向FAK的化合物，其結(jié)構(gòu)如下式(I)所示：

其中，X為N原子或Cl取代的C原子；R₁為-OH、-O-CH₂-CH₂-OH或-O-CH₂-CH₂-F；R₂為甲氨基或二甲氨基。

本發(fā)明優(yōu)選的一類(lèi)靶向FAK的化合物，是所述式(I)中的X為Cl取代的C原子的化合物，即靶向FAK的5-氯-1,3-嘧啶類(lèi)化合物，其結(jié)構(gòu)如下式(II)所示：

其中，R₁為-OH、-O-CH₂-CH₂-OH或-O-CH₂-CH₂-F；R₂為甲氨基或二甲氨基。

本發(fā)明優(yōu)選的另一類(lèi)靶向FAK的化合物，是所述式(I)中的X為N原子的化合物，即靶向FAK的1,3,5-三嗪類(lèi)化合物，其結(jié)構(gòu)如下式(III)所示：

其中，R₁為-OH、-O-CH₂-CH₂-OH或-O-CH₂-CH₂-F；R₂為甲氨基或二甲氨基。

本發(fā)明最優(yōu)選的靶向FAK的化合物是以下化合物中的任意一種：

化合物TM-1：

化合物IM3-1：

化合物IM4-1：

化合物TM-2

化合物IM3-2：

化合物TM4-2：

化合物TM-3：

化合物IM3-3：

化合物IM4-3：

化合物TM-4：

化合物IM3-4：

或者，

化合物IM4-4：

在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明進(jìn)一步提出一種放射性核素F-18標(biāo)記的靶向FAK的化合物，其結(jié)構(gòu)如下式(IV)所示：

其中，X為N原子或Cl取代的C原子；R₂為甲氨基或二甲氨基。

本發(fā)明進(jìn)一步提供制備所述的靶向FAK的化合物及其標(biāo)記物的方法。

制備所述的結(jié)構(gòu)如式(II)所示的化合物時(shí)，本發(fā)明的合成路線(xiàn)大體如下，記作方法一：

具體制備方法包括以下步驟：

A1)等摩爾的2-氨基-N-甲基苯甲酰胺與2,4,5-三氯嘧啶在堿性條件下在有機(jī)溶劑中于70～80℃下攪拌反應(yīng)4～6h，得到化合物II-01；

A2)等摩爾的5-氟-2-硝基苯酚與溴乙醇在堿性條件下在有機(jī)溶劑中于60～70℃下攪拌反應(yīng)8～12h，再在體系中加入3-(N-叔丁氧羰基-N-甲基氨基)吡咯烷，與5-氟-2-硝基苯酚摩爾比為1～1.05:1，然后于70～90℃下繼續(xù)攪拌反應(yīng)3～5h，得到化合物II-02；再將化合物II-02苯環(huán)上的硝基經(jīng)氫化還原為氨基，得到化合物II-03；

A3)將步驟A1)得到的化合物II-01與步驟A2)得到的化合物II-03在酸性條件下于90～110℃下等摩爾攪拌反應(yīng)7～9h，得到化合物II-07；將化合物II-07脫去叔丁氧羰基的保護(hù)，得到化合物IM3-2；

A4)步驟A2)得到的化合物II-02、三乙胺、DMAP和對(duì)甲苯磺酰氯在二氯甲烷溶劑中于室溫下攪拌反應(yīng)5～7h得到磺酸酯中間體；再將所述的磺酸酯中間體與四丁基氟化銨在四氫呋喃存在下反應(yīng)18～22h得到化合物II-04；再將化合物II-04苯環(huán)上的硝基經(jīng)氫化還原為氨基，得到化合物II-05；

A5)將步驟A1)得到的化合物II-01與步驟A4)得到的化合物II-05在酸性條件下于90～110℃下等摩爾攪拌反應(yīng)7～9h，得到化合物II-06；將所述的化合物II-06脫去叔丁氧羰基的保護(hù)，得到化合物TM-2；

A6)步驟A3)得到的化合物IM3-2、超干DMSO和KOH在80～120℃下攪拌反應(yīng)170～190min，加水猝滅反應(yīng)，得到化合物IM4-2；

A7)將步驟A3)得到的化合物IM3-2、步驟A5)得到的化合物TM-2，分別對(duì)其結(jié)構(gòu)中與吡咯烷基相連的甲氨基進(jìn)行還原甲基化，得到化合物IM3-1和化合物TM-1；

A8)步驟A7)得到的化合物IM3-1、超干DMSO和KOH在80～120℃下攪拌反應(yīng)170～190min，加水猝滅反應(yīng)，得到化合物IM4-1。

制備所述的結(jié)構(gòu)如式(III)所示的化合物時(shí)，本發(fā)明的合成路線(xiàn)大體如下，記作方法二：

具體制備方法包括以下步驟：

B1)5-氟-2-硝基苯酚(化合物1)與3-(二甲氨基)吡咯烷以1:1～1.5的摩爾比在有機(jī)溶劑中于80～90℃回流反應(yīng)4～6h，反應(yīng)完全后得到化合物2；

B2)步驟B1)得到的化合物2與2-溴乙醇在堿性條件下以1:1.5～2的摩爾比在有機(jī)溶劑中于110～130℃反應(yīng)2～4h，反應(yīng)完全后得到化合物3；將所述的化合物3結(jié)構(gòu)中的硝基經(jīng)氫化還原為氨基，得到化合物4；

B3)步驟B1)得到的化合物2與溴氟乙烷在堿性條件下以1:1.5～2的摩爾比在有機(jī)溶劑中于110～130℃反應(yīng)2～4h，反應(yīng)完全后得到化合物7A；將所述的化合物7A結(jié)構(gòu)中的硝基經(jīng)氫化還原為氨基，得到化合物8A；

B4)等摩爾的2,4-二氯-1,3,5-三嗪與2-氨基-N-甲基苯甲酰胺在DIP乙酸乙酯存在下于有機(jī)溶劑中冰浴攪拌反應(yīng)，反應(yīng)完全后得到化合物6；

B5)步驟B3)得到的化合物8A與步驟B4)得到的化合物6以等摩爾的比例在堿性條件下于有機(jī)溶劑中低溫?cái)嚢璺磻?yīng)，得到化合物TM-3；

B6)步驟B2)得到的化合物4與步驟B4)得到的化合物6以等摩爾的比例在堿性條件下于有機(jī)溶劑中低溫?cái)嚢璺磻?yīng)，得到化合物IM3-3；

B7)步驟B6)得到的化合物IM3-3、超干DMSO和KOH在80～120℃下攪拌反應(yīng)170～190min，加水猝滅反應(yīng)，得到化合物IM4-3；

B8)2,4,6-三氯-1,3,5-三嗪與2-氨基-N-甲基苯甲酰胺在堿性條件下以等摩爾比在有機(jī)溶劑中冰浴攪拌反應(yīng)7～9h得到化合物8B；

B9)步驟B8)得到的化合物8B與方法一中步驟A2)得到的化合物II-03以等摩爾比在有機(jī)溶劑中攪拌反應(yīng)7～9h得到化合物9；

B10)步驟B9)得到的化合物9與三乙胺以等摩爾的比例在鈀碳催化下于甲醇和四氫呋喃混合溶液中氫氣置換、氫氣氛攪拌反應(yīng)4～6h，得到化合物10；將所述的化合物10脫去叔丁氧羰基的保護(hù)，得到化合物TM-4；

B11)步驟B8)得到的化合物8B與方法一中步驟A4)得到的化合物II-05以等摩爾比在有機(jī)溶劑中攪拌反應(yīng)7～9h得到化合物11；

B12)步驟B11)得到的化合物11與三乙胺以等摩爾的比例在鈀碳催化下于甲醇和四氫呋喃混合溶液中氫氣置換、氫氣氛攪拌反應(yīng)4～6h，得到化合物12；將所述的化合物12脫去叔丁氧羰基的保護(hù)，得到化合物IM3-4；

B13)步驟B12)得到的化合物IM3-4、超干DMSO和KOH在80～120℃下攪拌反應(yīng)170～190min，加水猝滅反應(yīng)，得到化合物IM4-4。

本發(fā)明還進(jìn)一步提供制備式(IV)所示放射性標(biāo)記的靶向FAK化合物的方法，記作方法三，其合成路線(xiàn)如下：

具體步驟包括：

C1)制備標(biāo)記前體化合物：

取方法一步驟A3)得到的化合物II-07、方法一步驟A7)得到的化合物IM3-1、方法二步驟B6)得到的化合物IM3-3、或者方法二步驟B12)得到的化合物12，與TsCl在DCM溶劑中經(jīng)DMAP催化反應(yīng)得到相應(yīng)的對(duì)甲基苯磺酸酯類(lèi)化合物，作為標(biāo)記前體化合物，分別記作IM2-2、IM2-1、IM2-3或IM2-4：

C2)放射性標(biāo)記：

采用Kryptofix 2.2.2./[¹⁸F]KF/K₂CO₃復(fù)合物對(duì)步驟C1)得到的所述標(biāo)記前體化合物IM2-2、IM2-1、IM2-3或IM2-4進(jìn)行¹⁸F-親核取代氟化，然后脫除其他保護(hù)基，得到F-18標(biāo)記的靶向FAK化合物[¹⁸F]TM-2、[¹⁸F]TM-1、[¹⁸F]TM-3、或者[¹⁸F]TM-4。

本發(fā)明所述的靶向FAK的化合物具有優(yōu)異的體外FAK激酶活性抑制效果；其放射性標(biāo)記物在荷S180腫瘤小鼠體內(nèi)具有理想的生物分布。

經(jīng)本發(fā)明所述的方法制備得到的放射性標(biāo)記的靶向FAK化合物，常規(guī)分離純化后的放化純均大于98％，與相應(yīng)未經(jīng)放射性標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)品共注射結(jié)果顯示兩者在容許誤差的范圍內(nèi)匹配良好，并具有良好的體外穩(wěn)定性。

本發(fā)明進(jìn)一步提供所述靶向FAK的化合物在制備腫瘤治療藥物中的應(yīng)用，所述的腫瘤治療藥物包括腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制等。

本發(fā)明進(jìn)一步提供所述放射性標(biāo)記的靶向FAK化合物在制備腫瘤早期診斷顯像劑中的應(yīng)用。

附圖說(shuō)明

圖1是[¹⁸F]TM-1和[¹⁹F]TM-1的共注射色譜圖。

圖2是[¹⁸F]TM-2和[¹⁹F]TM-2的共注射色譜圖。

圖3是[¹⁸F]TM-3和[¹⁹F]TM-3的共注射色譜圖。

圖4是[¹⁸F]TM-4和[¹⁹F]TM-4的共注射色譜圖。

具體實(shí)施方式

為了進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案，以下采用列舉具體實(shí)施例的方式進(jìn)一步對(duì)本發(fā)明加以闡述，但本發(fā)明的技術(shù)方案不限于所列舉的實(shí)施例。

實(shí)施例1.[¹⁹F]TM-2、[¹⁸F]TM-2的標(biāo)記前體IM2-2的有機(jī)合成、IM3-2和IM4-2的有機(jī)合成

合成路線(xiàn)如下：

具體步驟：

II-01的合成

100mL反應(yīng)瓶中依次加入2-氨基-N-甲基苯甲酰胺(1.53g，10mmol)、碳酸鉀(2.07g,15mmol)、DMF(15mL)，攪拌下加入2,4,5-三氯嘧啶(1.85g，10mmol)。反應(yīng)液在75℃攪拌5h，將反應(yīng)液倒入水中，固體析出，抽濾，收集濾餅。濾餅用50％乙腈-水打漿，干燥后得到2g淺黃色固體II-01，收率67％；¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆,δppm):12.18(s,1H),8.84(s,1H),8.52(d,J＝10.5Hz,1H),8.46(s,1H),7.79(d,J＝10.0Hz,1H),7.59(t,J＝10.0Hz,1H),7.21(t,J＝9.5Hz,1H),2.81(s,3H).

II-02的合成

反應(yīng)瓶中，分別加入5-氟-2-硝基苯酚(10g，63mmol)，溴乙醇(8g，63mmol)，無(wú)水DMF(200mL)，碳酸鉀(18g，128mmol)，并攪拌加熱至65℃，約10小時(shí)后，加入3-(N-叔丁氧羰基-N-甲基氨基)吡咯烷(12.7g，63.6mmol)，并升溫至80℃繼續(xù)攪拌4小時(shí)。冷卻至室溫，加入水和乙酸乙酯萃取，有機(jī)層用飽和食鹽水洗滌，干燥，過(guò)濾，濾液減壓濃縮，粗品經(jīng)硅膠柱層析純化(PE/乙酸乙酯＝2/1)得6.7g黃色固體狀I(lǐng)I-02，收率27.6％；¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆,δppm):7.89(d,J＝10.0Hz,1H),6.24(d,J＝15.0Hz,1H),6.17(s,1H),4.87(brs,1H),4.16(t,J＝5.0Hz,2H),3.75(t,J＝5.0Hz,2H),3.51-3.58(m,3H),2.89(s,1H),2.74(d,J＝10.0Hz,4H),2.13(t,J＝10.0Hz,2H),1.42(s,9H).

II-03的合成

單口反應(yīng)瓶中，分別加入化合物II-02(3g，7.9mmol)，無(wú)水甲醇(50ml)和7.5％鈀碳(1g),抽真空置換氫氣，常壓氫化2小時(shí)。過(guò)濾除去鈀碳，減壓濃縮得2.8g棕黑色油狀I(lǐng)I-03，收率100％；¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆,δppm):6.52(d,J＝10.0Hz,1H),6.17(s,1H),6.00(d,J＝10.0Hz,1H),4.74(brs,1H),3.92(t,J＝5.0Hz,2H),3.72(t,J＝5.0Hz,2H),3.01-3.24(m,5H),2.89(s,3H),1.95-2.10(m,2H),1.39(s,9H).

II-04的合成

單口反應(yīng)瓶中，分別加入化合物II-02(3g，7.9mmol)，二氯甲烷(50mL)，三乙胺(1.6g，16mmol)，DMAP(0.1g，0.09mol)和對(duì)甲苯磺酰氯(2.25g，11.8mmol)，室溫下攪拌6小時(shí)后反應(yīng)終止。加水萃取，有機(jī)層干燥，過(guò)濾，濾液減壓濃縮得磺酸酯中間體。三口反應(yīng)瓶中，于氮?dú)獗Ｗo(hù)下分別加入磺酸酯中間體，無(wú)水THF(50ml)和四丁基氟化銨的四氫呋喃溶液(1.0mol/L，10mL，10mmol)，升溫至回流反應(yīng)，約20小時(shí)后反應(yīng)終止，減壓濃縮除去溶劑，剩余物經(jīng)硅膠柱層析純化(PE/乙酸乙酯＝5/1)得1.1g黃色固體狀I(lǐng)I-04，收率45.2％；¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆,δppm):7.92(d,J＝10.0Hz,1H),6.26-6.29(m,1H),6.18(s,1H),4.83(t,J＝5.0Hz,1H),4.71(t,J＝5.0Hz,1H),4.45(t,J＝5.0Hz,1H),4.38(t,J＝5.0Hz,1H),3.55(q,J＝5.0Hz,2H),2.89(s,1H),2.73-2.75(m,5H),2.14(t,J＝10.0Hz,2H),1.40(s,9H).

II-05的合成

操作步驟同II-03的合成。棕色油狀產(chǎn)物，收率95％，產(chǎn)物不穩(wěn)定，直接用于下步反應(yīng)。II-06的合成

100mL反應(yīng)瓶中依次加入II-05(354mg，1mmol)，對(duì)甲苯磺酸(258mg，1.5mmol)，1,4-二氧六環(huán)(10mL)，攪拌下加入II-01(300mg，1mmol)。反應(yīng)液100℃攪拌8h直至原料反應(yīng)完全。將反應(yīng)液倒入水中，乙酸乙酯萃取，收集有機(jī)層，水洗2次。有機(jī)相濃縮后柱層析純化(PE/乙酸乙酯＝3/1)，得到230mg淺黃色固體II-06，收率38％；¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆,δppm):11.58(s,1H),8.69(d,J＝5.0Hz,1H),8.61(d,J＝10.0Hz,1H),8.06(d,J＝20.0Hz,2H),7.70(d,J＝5.0Hz,1H),7.39(d,J＝10.0Hz,1H),7.29(t,J＝5.0Hz,1H),7.05(t,J＝5.0Hz,1H),6.30(s,1H),6.18-6.21(m,1H),4.71(t,J＝5.0Hz,1H),4.60(t,J＝5.0Hz,1H),4.27(t,J＝5.0Hz,1H),4.20(t,J＝5.0Hz,1H),3.60(s,1H),3.31-3.39(m,2H),3.24(t,J＝10.0Hz,2H),2.80(s,3H),2.79(s,3H),2.09-2.16(m,2H),1.40(s,9H).

[¹⁹F]TM-2的合成

100mL反應(yīng)瓶中加入II-06(280mg,0.46mmol)，乙醇(5mL)，3N HCl(1mL)，反應(yīng)液100℃攪拌40min，旋蒸除去乙醇，剩余物加飽和碳酸氫鈉溶液中和至pH＝9，乙酸乙酯萃取，有機(jī)相濃縮后柱層析(DCM/MeOH＝10/1)，得到120mg深黃色固體[¹⁹F]TM-2,收率51％；¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆,δppm):11.56(s,1H),8.70(t,J＝5.5Hz,1H),8.61(t,J＝5.5Hz,1H),8.06(s,1H),8.03(s,1H),7.70(d,J＝9.5Hz,1H),7.33(d,J＝11.0Hz,1H),7.26(d,J＝9.5Hz,1H),7.04(t,J＝9.5Hz,1H),6.21(d,J＝2.5Hz,1H),6.11-6.14(m,1H),4.70(t,J＝4.5Hz,1H),4.58(t,J＝5.0Hz,1H),4.24(t,J＝4.5Hz,1H),4.17(t,J＝5.0Hz,1H),3.20-3.32(m,4H),2.99-3.03(m,1H),3.24(t,J＝10.0Hz,2H),2.80(s,3H),2.32(s,3H),2.09-2.14(m,1H),1.80-1.85(m,1H).

II-07的合成

100mL反應(yīng)瓶中依次加入II-03(360mg，1mmol)，對(duì)甲苯磺酸(0.27g，1.5mmol)，1,4-二氧六環(huán)(10mL)，攪拌下加入II-01(0.3g，1mmol)。反應(yīng)液100℃攪拌8h直至原料反應(yīng)完全。將反應(yīng)液倒入水中，乙酸乙酯萃取，收集有機(jī)層，水洗2次。有機(jī)相濃縮后柱層析純化(PE/乙酸乙酯＝2/1)，得到160mg淺黃色固體II-07，收率25.5％；¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆,δppm):11.58(s,1H),8.66-8.72(m,2H),8.19(s,1H),8.11(s,1H),7.72(d,J＝9.5Hz,1H),7.54(d,J＝11.0Hz,1H),7.35(t,J＝9.8Hz,1H),7.07(t,J＝9.5Hz,1H),6.26(s,1H),6.17(d,J＝11.0Hz,1H),4.79(brs,1H),4.02(t,J＝9.0Hz,2H),3.35-3.44(m,2H),3.19-3.24(m,2H),3.60(s,1H),3.31-3.39(m,2H),3.24(t,J＝10.0Hz,2H),2.80(s,3H),2.76(s,3H),1.47(s,9H).

IM3-2的合成

100mL反應(yīng)瓶中加入II-07(300mg，0.49mmol)，乙醇(5mL)，3N HCl(1mL)，反應(yīng)液100℃攪拌40min，旋蒸除去乙醇，剩余物加飽和碳酸氫鈉溶液中和至pH＝9，乙酸乙酯萃取，有機(jī)相濃縮后柱層析(DCM/MeOH＝10/1)，得到90mg深黃色固體IM3-2,收率36％；¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆,δppm):11.56(s,1H),8.67-8.73(m,2H),8.18(s,1H),8.10(s,1H),7.72(d,J＝9.5Hz,1H),7.51(d,J＝10.5Hz,1H),7.34(t,J＝10.0Hz,1H),7.07(t,J＝9.5Hz,1H),6.20(s,1H),6.10-6.20(m,1H),4.96(brs,1H),4.00(t,J＝6.0Hz,2H),3.66(t,J＝5.0Hz,2H),3.36-3.49(m,2H),3.22-3.28(m,2H),3.05-3.09(m,1H),2.80(s,3H),2.37(s,3H),2.12-2.18(m,1H),1.82-1.87(m,1H).

IM2-2(標(biāo)記前體)的合成

100mL反應(yīng)瓶中依次加入II-07(200mg，0.32mmol)，DMAP(39mg,0.32mmol)，DCM(10mL)，攪拌下加入TsCl(100mg，0.52mmol)。反應(yīng)液室溫?cái)嚢?h直至原料反應(yīng)完全。將反應(yīng)液倒入水中，DCM萃取，收集有機(jī)層，濃縮后柱層析純化(PE/乙酸乙酯＝4/1)，得到160mg黃色固體IM2-2，收率64％；¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆,δppm):11.56(s,1H),8.72(d,J＝5.5Hz,2H),8.10(s,1H),7.99(s,1H),7.71-7.73(m,3H),7.44(d,J＝11.0Hz,1H),7.38(d,J＝10.0Hz,2H),7.29(t,J＝9.5Hz,1H),7.04(t,J＝9.5Hz,1H),6.16-6.22(m,2H),4.73(s,1H),4.27(t,J＝3.5Hz,2H),4.19(t,J＝5.5Hz,2H),3.32-3.41(m,2H),3.20(t,J＝9.0Hz,2H),2.81(s,3H),2.74(s,3H),2.34(s,3H),2.08-2.16(m,2H),1.43(s,9H).

IM4-2的合成

5mL消解罐中加入IM3-2(40mg，0.078mmol,1.0eq)，超干的DMSO(0.5mL)，KOH(3eq)，反應(yīng)液100℃攪拌180min，加水猝滅反應(yīng)，乙酸乙酯萃取，有機(jī)相濃縮后柱層析(DCM/MeOH＝5/1)，得到20mg深黃色固體IM4-2,收率57％；¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆,δppm):11.47(s,1H),10.15(s,1H),8.58-8.84(m,2H),8.27(s,1H),8.15(s,1H),7.73(d,J＝9.5Hz,1H),7.48(d,J＝10.5Hz,1H),7.31(t,J＝10.0Hz,1H),7.12(t,J＝9.5Hz,1H),6.31(s,1H),6.10-6.20(m,1H),3.31-3.52(m,2H),3.19-3.35(m,2H),2.97-3.12(m,1H),2.76(s,3H),2.34(s,3H),2.09-2.23(m,1H),1.78-1.89(m,1H).

實(shí)施例2.[¹⁹F]TM-1、[¹⁸F]TM-1的標(biāo)記前體IM2-1的有機(jī)合成、IM3-1和IM4-1的有機(jī)合成

合成路線(xiàn)如下：

具體步驟：

[¹⁹F]TM-1的合成

100mL反應(yīng)瓶中依次加入實(shí)施例1制備的[¹⁹F]TM-2(200mg,1eq)、MeOH(10mL)、38％甲醛水溶液(0.5mL)，冰浴攪拌下緩慢分批加入NaBH₄(78mg，5eq)。加完后，繼續(xù)冰浴攪拌0.5h。加水，乙酸乙酯萃取，有機(jī)層干燥，濃縮后柱層析純化(DCM/MeOH＝10/1)得目標(biāo)化化合物，黃色固體[¹⁹F]TM-1(135mg，Yield：66％)；¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆,δppm):11.57(s,1H),8.70(d,J＝5.0Hz,1H),8.61(d,J＝10.0Hz,1H),8.07(s,1H),8.02(s,1H),7.67(d,J＝15.0Hz,1H),7.35(d,J＝10.0Hz,1H),7.27(t,J＝9.5Hz,1H),7.05(t,J＝5.0Hz,1H),6.25(s,1H),6.14-6.16(m,1H),4.71(t,J＝5.0Hz,1H),4.59(t,J＝5.0Hz,1H),4.27(t,J＝5.0Hz,1H),4.20(t,J＝5.0Hz,1H),3.32-3.45(m,2H),3.24-3.30(m,2H),3.06(t,J＝5.0Hz,1H),2.75-2.79(m,1H),2.74(s,3H),2.22(s,6H),1.83(q,J＝5.0Hz,1H).

IM3-1的合成

100mL反應(yīng)瓶中依次加入實(shí)施例1制備的IM3-2(600mg,1eq)、MeOH(20mL)、38％甲醛水溶液(1mL)，冰浴攪拌下緩慢分批加入NaBH₄(223mg，5eq)。加完后，繼續(xù)冰浴攪拌0.5h。加水，乙酸乙酯萃取，有機(jī)層干燥，濃縮后柱層析純化(DCM/MeOH＝7/1)得目標(biāo)化化合物，黃色固體IM3-1(385mg，Yield：63％)；¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆,δppm):11.59(s,1H),8.67-8.73(m,2H),8.18(s,1H),8.10(s,1H),7.70-7.73(m,1H),7.50(d,J＝11.0Hz,1H),7.35(t,J＝9.5Hz,1H),7.08(t,J＝9.5Hz,1H),6.22(s,1H),6.11-6.21(m,1H),4.96(brs,1H),4.00(t,J＝5.0Hz,2H),3.67(t,J＝6.5Hz,2H),3.22-3.47(m,1H),3.24-3.28(m,1H),3.05(t,J＝10.0Hz,1H),2.79-2.83(m,4H),2.22(s,6H),2.14-2.19(m,1H),1.83(q,J＝5.0Hz,1H).

IM2-1(標(biāo)記前體)的合成

100mL反應(yīng)瓶中依次加入上一步制備的IM3-1(230mg，1eq)，DMAP(5mg，0.1eq)，DCM(10mL)，T乙酸乙酯(44mg，1.5eq)，攪拌下加入TsCl(100mg，1.5eq)。反應(yīng)液室溫?cái)嚢?h直至原料反應(yīng)完全。將反應(yīng)液倒入水中，DCM萃取，收集有機(jī)層，濃縮后柱層析純化(DCM/MeOH＝10/1)，得到黃色固體IM2-1(158mg，Yield：49％)；¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆,δppm):11.63(s,1H),8.70-8.72(m,2H),8.12(s,1H),7.99(d,J＝10.0Hz,1H),7.70-7.74(m,3H),7.41-7.48(m,3H),7.39(t,J＝10.0Hz,1H),7.02-7.11(m,1H),6.12-6.18(m,2H),4.25(t,J＝5.5Hz,2H),4.18(t,J＝3.0Hz,2H),3.40-3.45(m,2H),3.21-3.23(m,1H),3.02-3.10(m,2H),2.76-2.84(m,4H),2.50(s,3H),2.34(s,6H),2.15-2.28(m,1H),1.82-2.00(m,1H).

IM4-1的合成

5mL消解罐中加入上述步驟制備的IM3-1(50mg，0.095mmol,1.0eq)，超干的DMSO(0.5mL)，KOH(3eq)，反應(yīng)液100℃攪拌180min，加水猝滅反應(yīng)，乙酸乙酯萃取，有機(jī)相濃縮后柱層析(DCM/MeOH＝5/1)，得到18mg深黃色固體IM4-1,收率39％；¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆,δppm):11.59(s,1H),10.12(s,1H),8.58-8.64(m,2H),7.75-7.79(m,1H),7.54(d,J＝11.0Hz,1H),7.38(t,J＝9.5Hz,1H),7.14(t,J＝9.5Hz,1H),6.19(s,1H),6.08-6.24(m,1H),3.28-3.45(m,1H),3.20-3.25(m,1H),3.08(t,J＝10.0Hz,1H),2.75-2.78(m,4H),2.19(s,6H),2.13-2.17(m,1H),1.88(q,J＝5.0Hz,1H).

實(shí)施例3.[¹⁹F]TM-3、[¹⁸F]TM-3的標(biāo)記前體IM2-3的有機(jī)合成、IM3-3和IM4-3的有機(jī)合成

合成路線(xiàn)如下：

具體步驟：

化合物2的制備

100mL反應(yīng)瓶中依次加入1(5g，1eq)、乙腈(30mL)、3-(二甲氨基)吡咯烷(5.4g，1.5eq)，85℃回流反應(yīng)5h，TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)完全后，直接濃縮除去溶劑乙腈，剩余物柱層析純化(PE/乙酸乙酯＝2/1)得黃色固體目標(biāo)化合物2(6.3g，Yield：79％)；¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆,δppm):12.11(brs,1H),7.88(d,J＝12.0Hz,1H),6.33(dd,J＝12.0Hz,2.5Hz,1H),6.05-6.07(m,1H),3.53-3.65(m,2H),3.25-3.37(m,1H),3.16(t,J＝10.5Hz,1H),2.76-2.83(m,1H),2.25(s,6H),2.14-2.17(m,1H),1.77-1.84(m,1H).

化合物3的制備

100mL反應(yīng)瓶中依次加入2(6g，1eq)、DMF(15mL)、2-溴乙醇(5.9g，2eq)、K₂CO₃(8.3g，2.5eq)，120℃反應(yīng)3h，TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)完全后，加水，乙酸乙酯萃取，有機(jī)層濃縮后柱層析(PE/乙酸乙酯＝1/1)得黃色固體目標(biāo)化合物3(4.6g，Yield：66％)；¹H NMR(500MHz,CDCl₃,δppm):8.00-8.02(m,1H),6.13(dd,J＝11.5Hz,2.5Hz,1H),5.94(d,J＝2.5Hz,1H),4.21(t,J＝5.5Hz,2H),3.99(t,J＝5.5Hz,2H),3.56(q,J＝11.5Hz,2H),3.36-3.43(m,1H),3.23(t,J＝11.0Hz,1H),2.33(s,6H),2.21-2.29(m,2H),1.97(t,J＝14.5Hz,2H).

化合物4的制備

100mL反應(yīng)瓶中依次加入3(1g，1eq)、無(wú)水乙醇(10mL)，待原料完全溶解后加入7.5％Pd/C(0.2g，20％)，氫氣置換3次后，室溫在氫氣氛圍中攪拌反應(yīng)2h，TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)，原料反應(yīng)完全且只有一個(gè)點(diǎn)時(shí)停止反應(yīng)。過(guò)濾除去Pd/C，濾液濃縮，得藍(lán)色或褐色油狀物4(0.73g)，產(chǎn)物直接用于下步反應(yīng)。

化合物6的制

100mL反應(yīng)瓶中依次加入5(1g，1eq)，DMF(10mL)，冰浴攪拌下加入DIP乙酸乙酯(1.3g，1.5eq)，2-氨基-N-甲基苯甲酰胺(1g，1eq)，加完后繼續(xù)冰浴攪拌。TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)程，原料基本反應(yīng)完全后停止反應(yīng)，加水，攪拌后有固體析出，抽濾。真空干燥得白色固體6(0.56g，Yield：32％)；¹H NMR(500MHz,CDCl₃,δppm):11.46(brs,1H),8.56(d,J＝9.5Hz,2H),7.48-7.56(m,2H),7.13-7.17(m,1H),6.29(s,1H),3.02(s,3H).

化合物7A的制備

100mL反應(yīng)瓶中依次加入2(6g，1eq)、DMF(15mL)、溴氟乙烷(6g，2eq)、K₂CO₃(8.3g，2.5eq)，120℃反應(yīng)3h，TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)完全后，加水，乙酸乙酯萃取，有機(jī)層濃縮后柱層析(PE/乙酸乙酯＝1/1)得黃色固體目標(biāo)化合物7A(3.1g，Yield：43％)；¹H NMR(500MHz,CDCl₃,δppm):8.03(d,J＝11.5Hz,1H),6.16(dd,J＝11.5Hz,3.0Hz,1H),5.99(d,J＝3.0Hz,1H),4.89(t,J＝5.0Hz,1H),4.78(t,J＝3.5Hz,1H),4.38(t,J＝3.5Hz,1H),4.31(t,J＝3.5Hz,1H),3.53-3.60(m,2H),3.37-3.43(m,1H),3.22(t,J＝10.5Hz,1H),2.86-2.90(m,1H),2.37(s,6H),2.25-2.30(m,1H),1.94-1.99(m,1H).

化合物8A的制備

100mL反應(yīng)瓶中依次加入7A(1g，1eq)、無(wú)水乙醇(10mL)，待原料完全溶解后加入7.5％Pd/C(0.2g，20％)，氫氣置換3次后，室溫在氫氣氛圍中攪拌反應(yīng)2h，TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)，原料反應(yīng)完全且只有一個(gè)點(diǎn)時(shí)停止反應(yīng)。過(guò)濾除去Pd/C，濾液濃縮，得藍(lán)色或褐色油狀物8A(0.9g)，產(chǎn)物直接用于下步反應(yīng)。

[¹⁹F]TM-3的制備

100mL反應(yīng)瓶中依次加入8A(0.9g，1eq)，乙腈(10mL)，冰浴攪拌下加入碳酸鉀(0.7g，1.5eq)，6(0.89g，1eq)，移至室溫?cái)嚢?。TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)程，原料基本反應(yīng)完全后停止反應(yīng)，加水，乙酸乙酯萃取，干燥，濃縮。柱層析分離(中性氧化鋁，DCM/MeOH＝30:1)得黃色固體化合物[¹⁹F]TM-3(76mg)；¹H NMR(500MHz,CD₃OD,δppm):8.43-8.54(m,2H),8.19(d,J＝10.0Hz,2H),7.57-7.65(m,3H),7.03-7.05(m,2H),6.25-6.31(m,2H),4.75(t,J＝8.5Hz,1H),4.61(t,J＝5.0Hz,1H),4.29(t,J＝5.0Hz,1H),4.21(t,J＝5.5Hz,1H),3.52-3.59(m,2H),3.37-3.43(m,2H),3.17(s,3H),2.86-2.90(m,7H),2.27-2.41(m,2H).

IM3-3的制備

100mL反應(yīng)瓶中依次加入4(0.73g，1eq)，乙腈(10mL)，冰浴攪拌下加入碳酸鉀(0.76g，2eq)，6(0.73g，1eq)，移至室溫?cái)嚢?。TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)程，原料基本反應(yīng)完全后停止反應(yīng)，加水，乙酸乙酯萃取，干燥，濃縮。柱層析分離(中性氧化鋁，DCM/MeOH＝8:1)得黃色固體化合物IM3-3(290mg，Yield：21％)；¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆,δppm):12.03(brs,1H),8.53-8.65(m,3H),8.25(s,1H),7.73(d,J＝5.0Hz,1H),7.40-7.53(m,2H),7.05(t,J＝9.5Hz,1H),6.14-6.21(m,2H),4.96(brs,1H),4.03(t,J＝4.4Hz,2H),3.67(t,J＝5.5Hz,2H),3.45(t,J＝5.5Hz,2H),3.37(t,J＝5.0Hz,2H),3.05(t,J＝10.5Hz,1H),2.79-2.84(m,4H),2.26(s,6H),2.12-2.19(m,1H).

IM2-3(標(biāo)記前體)的制備

100mL反應(yīng)瓶中依次加入IM3-3(200mg，1eq)，DMAP(99mg,2eq)，DCM(10mL)，攪拌下加入TsCl(154mg，2eq)。反應(yīng)液室溫?cái)嚢柚敝猎戏磻?yīng)完全。將反應(yīng)液倒入水中，DCM萃取，收集有機(jī)層，濃縮后柱層析純化(PE/乙酸乙酯＝2/1)，得到黃色固體IM2-3(130mg，Yield：49％)；¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆,δppm):12.03(brs,1H),8.73(s,1H),8.65(s,1H),8.25(s,1H),7.66-7.71(m,2H),7.40-7.48(m,4H),7.02-7.04(m,1H),6.17-6.25(m,2H),4.18-4.25(m,4H),3.41-3.47(m,2H),3.24-3.28(m,1H),3.02-3.11(m,1H),2.83-2.87(m,4H),2.39(s,3H),2.26(s,6H),2.12-2.19(m,1H),1.81-1.87(m,1H).

IM4-3的合成

5mL消解罐中加入IM3-3(50mg，0.102mmol,1.0eq)，超干的DMSO(0.5mL)，KOH(3eq)，反應(yīng)液100℃攪拌180min，加水猝滅反應(yīng)，乙酸乙酯萃取，有機(jī)相濃縮后柱層析(DCM/MeOH＝4/1)，得到24mg深黃色固體IM4-2,收率53％；¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆,δppm):11.97(brs,1H),10.14(s,1H),8.42-8.53(m,3H),7.78(d,J＝5.0Hz,1H),7.36-7.56(m,2H),7.09(t,J＝9.5Hz,1H),6.19-6.28(m,2H),3.40(t,J＝5.5Hz,2H),3.34(t,J＝5.0Hz,2H),3.11(t,J＝10.5Hz,1H),2.75-2.79(m,4H),2.23(s,6H),2.08-2.17(m,1H).

實(shí)施例4.[¹⁹F]TM-4、[¹⁸F]TM-4的標(biāo)記前體IM2-4、IM3-4和IM4-4的有機(jī)合成

合成路線(xiàn)如下：

具體步驟：

化合物8B的合成

100mL反應(yīng)瓶中依次加入7B(3.7g，1eq)，丙酮(30mL)，碳酸鈉(2.1g，1eq)，冰浴攪拌下分批加入2-氨基-N-甲基苯甲酰胺(3g，1eq)，加完后繼續(xù)冰浴攪拌5h，直至原料大部分反應(yīng)完。將反應(yīng)液倒入水中，攪拌有固體析出，抽濾，濾餅真空干燥的灰白色固體8B(4.5g，Yield：76％)；¹H NMR譜圖請(qǐng)參考[¹⁹F]TM-3的合成中6的合成步驟。

化合物9的合成

100mL反應(yīng)瓶中依次加入實(shí)施例1中制備的化合物II-03(351mg，1eq)，丙酮(10mL)，碳酸鉀(138mg，1eq)，8B(298mg，1eq)，加完后室溫?cái)嚢?h，直至原料大部分反應(yīng)完。將反應(yīng)液倒入水中，乙酸乙酯萃取，有機(jī)層濃縮后柱層析純化(PE/乙酸乙酯＝1/1)得灰色固體9(394mg，Yield：64％)；¹H NMR(500MHz,CDCl₃,δppm):11.49(brs,1H),8.50(d,J＝10.5Hz,1H),8.00-8.05(m,1H),7.43-7.49(m,3H),7.06-7.08(m,1H),6.44(s,1H),4.96-5.02(m,1H),4.90(t,J＝5.0Hz,1H),4.84(t,J＝5.0Hz,1H),4.32(t,J＝5.0Hz,1H),4.25(t,J＝5.0Hz,1H),3.45(t,J＝10.0Hz,2H),3.21-3.31(m,2H),2.99(s,3H),2.83(s,3H),2.17-2.16(m,2H),1.49(s,9H).

化合物10的合成

100mL反應(yīng)瓶中依次加入9(394mg，1eq)，甲醇(5mL)，四氫呋喃(5mL)，三乙胺(65mg，1eq)，7.5％Pd/C(80mg，20％)，加完后氫氣置換三次，并在氫氣氛圍下室溫?cái)嚢?h，直至原料反應(yīng)完全。抽濾除去Pd/C，濾液濃縮至干得灰色固體10(312mg，Yield：84％)；¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆,δppm):10.99(brs,1H),8.67-8.73(m,2H),8.45(s,1H),7.64-7.66(m,1H),7.29(s,2H),7.00-7.05(m,1H),6.20-6.29(m,2H),4.79-4.82(m,1H),4.79(t,J＝5.0Hz,1H),4.76(t,J＝5.0Hz,1H),4.28(t,J＝5.0Hz,1H),4.21(t,J＝5.0Hz,1H),3.38-3.46(d,J＝6.5Hz,2H),3.24(d,J＝6.5Hz,2H),2.78(s,6H),1.99-2.18(m,2H),1.47(s,9H).

[¹⁹F]TM-4的合成

100mL反應(yīng)瓶中加入10(280mg，1eq)，1M的氯化氫氣體的乙酸乙酯溶液(5mL，10eq)，室溫?cái)嚢柽^(guò)夜，原料反應(yīng)完全后加乙酸乙酯稀釋?zhuān)琋aHCO₃溶液調(diào)節(jié)pH至中性。分液后，有機(jī)層濃縮至干，柱層析純化(DCM/MeOH＝8/1)得黃色固體[¹⁹F]TM-4(35mg，yield：14％)；¹H NMR(500MHz,CD₃OD,δppm):8.42-8.45(m,1H),8.17(s,1H),7.60(dd,J＝12.5Hz,7.0Hz,2H),7.31-7.33(m,1H),7.05-7.09(m,1H),6.21-6.26(m,2H),4.73(t,J＝5.0Hz,1H),4.62(t,J＝5.0Hz,1H),4.29(t,J＝5.0Hz,1H),4.21(t,J＝5.0Hz,1H),3.52-3.56(m,3H),3.35-3.49(m,1H),3.13-3.17(m,1H),2.89(s,3H),2.43(s,3H),2.21-2.32(m,1H),1.82-1.97(m,1H).

化合物11的合成

100mL反應(yīng)瓶中依次加入實(shí)施例1制備的化合物II-05(1.4g，1eq)，丙酮(50mL)，碳酸鉀(560mg，1eq)，化合物8B(1.2g，1eq)，加完后室溫?cái)嚢?h，直至原料大部分反應(yīng)完。將反應(yīng)液倒入水中，乙酸乙酯萃取，有機(jī)層濃縮后柱層析純化(PE/乙酸乙酯＝1/1)得灰色固體化合物11(1.7g，Yield：69％)；¹H NMR(500MHz,CDCl₃,δppm):11.07(brs,1H),8.43-8.52(m,1H),7.84-7.94(m,2H),7.37-7.43(m,2H),7.00(t,J＝9.0Hz,1H),6.61(s,1H),6.08(s,2H),4.90(brs,1H),4.13(t,J＝8.5Hz,2H),3.99(t,J＝5.0Hz,2H),3.34-3.44(m,2H),3.17-3.24(m,2H),2.99(s,3H),2.81(s,3H),2.14-2.22(m,2H),1.49(s,9H),1.33-1.45(m,1H).

化合物12的合成

100mL反應(yīng)瓶中依次加入11(1.7g，1eq)，甲醇(15mL)，四氫呋喃(15mL)，三乙胺(280mg，1eq)，7.5％Pd/C(340mg，20％)，加完后氫氣置換三次，并在氫氣氛圍下室溫?cái)嚢?h，直至原料反應(yīng)完全。抽濾除去Pd/C，濾液濃縮至干得灰色固體12(1.2g，Yield：74％)；¹H NMR(500MHz,CDCl₃,δppm):11.16(brs,1H),8.69(d,J＝5.5Hz,1H),8.55(d,J＝10.0Hz,1H),8.37(s,1H),7.75(d,J＝11.0Hz,1H),7.69(d,J＝9.0Hz,1H),7.45(t,J＝9.5Hz,1H),7.09(t,J＝9.5Hz,1H),6.21(d,J＝3.0Hz,1H),6.06(s,1H),4.75(brs,1H),4.25(t,J＝5.5Hz,2H),4.20(t,J＝5.0Hz,2H),3.37-3.42(m,2H),3.17-3.24(m,2H),2.80(s,3H),2.74(s,3H),2.03-2.16(m,2H),1.49(s,9H),1.33-1.45(m,1H).

IM3-4的合成

100mL反應(yīng)瓶中加入10(578mg，1eq)，1M的氯化氫氣體的乙酸乙酯溶液(10mL，10eq)，室溫?cái)嚢柽^(guò)夜，原料反應(yīng)完全后加乙酸乙酯稀釋?zhuān)琋aHCO₃溶液調(diào)節(jié)pH至中性。分液后，有機(jī)層濃縮至干，柱層析純化(DCM/MeOH＝5/1)得黃色固體IM3-4(41mg，yield：8.6％)；¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆,δppm):12.03(brs,1H),8.53-8.67(m,3H),8.25(s,1H),7.67(d,J＝9.5Hz,1H),7.33-7.47(m,2H),7.05(t,J＝9.5Hz,1H),6.12-6.18(m,2H),4.95(brs,1H),4.02(t,J＝6.5Hz,2H),3.67(t,J＝6.0Hz,2H),3.39-3.46(m,2H),3.21-3.29(m,2H),3.01-3.04(m,1H),2.89(s,3H),2.34(s,3H),2.10-2.16(m,1H),1.78-1.89(m,1H).

IM2-4(標(biāo)記前體)的合成

100mL反應(yīng)瓶中依次加入12(578mg，1eq)，DMAP(12mg，0.1eq)，DCM(15mL)，乙酸乙酯(150mg，1.5eq)，攪拌下加入TsCl(290mg，1.5eq)。反應(yīng)液室溫?cái)嚢?h直至原料反應(yīng)完全。將反應(yīng)液倒入水中，DCM萃取，收集有機(jī)層，濃縮后柱層析純化(DCM/MeOH＝30/1)，得到黃色固體IM2-4(238mg，Yield：33％)；¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆,δppm):12.03(brs,1H),8.62-8.69(m,2H),8.23(s,1H),7.67-7.74(m,3H),7.30-7.43(m,4H),7.03(t,J＝5.0Hz,1H),6.21(s,2H),4.77(brs,1H),4.25(t,J＝5.5Hz,2H),4.20(t,J＝5.0Hz,2H),3.35-3.49(m,2H),3.21(d,J＝8.0Hz,2H),2.73(s,6H),2.34(s,3H),1.47(s,9H).

IM4-4的合成

5mL消解罐中加入IM3-4(19mg，0.040mmol,1.0eq)，超干的DMSO(0.5mL)，KOH(3eq)，反應(yīng)液100℃攪拌180min，加水猝滅反應(yīng)，乙酸乙酯萃取，有機(jī)相濃縮后柱層析(DCM/MeOH＝3/1)，得到9mg深黃色固體IM4-2,收率52％；¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆,δppm):12.06(brs,1H),10.25(s,1H),8.49-8.62(m,3H),8.29(s,1H),7.72(d,J＝9.5Hz,1H),7.30-7.48(m,2H),6.99(t,J＝9.5Hz,1H),6.09-6.15(m,2H),3.35-3.41(m,2H),3.18-3.26(m,2H),3.01-3.04(m,1H),2.85(s,3H),2.29(s,3H),2.06-2.14(m,1H),1.75-1.88(m,1H).

實(shí)施例5.[¹⁸F]TM-1、[¹⁸F]TM-2、[¹⁸F]TM-3和[¹⁸F]TM-4的F-18標(biāo)記和分離純化

合成路線(xiàn)如下：

用1.5mL的Kryptofix 2.2.2./K₂CO₃淋洗液(分別將13.5mg的Kryptofix 2.2.2.溶于1.25mL的乙腈中，1.7mg K₂CO₃溶于0.25mL的水中，然后將兩種溶液混合均勻即得)將QMA柱上俘獲的F-18氟負(fù)離子淋洗至高壓消解罐中，在100℃下用氮?dú)饬鲗⑷軇┐蹈?。然后，用氮?dú)饬骱兔看?.5mL的無(wú)水乙腈進(jìn)行前后三次共沸除水操作。

對(duì)于F-18藥物分子[¹⁸F]TM-1和[¹⁸F]TM-3來(lái)說(shuō)，分別將相應(yīng)的對(duì)甲苯磺酸酯類(lèi)標(biāo)記前體——實(shí)施例2制備的IM2-1、實(shí)施例3制備的IM2-3(3.0mg)的無(wú)水乙腈(0.5mL)的溶液加入到包含有上述干燥的Kryptofix 2.2.2./[¹⁸F]KF/K₂CO₃復(fù)合物的高壓消解罐中，在100℃下加熱15min。消解罐冷卻打開(kāi)后，向反應(yīng)液中加入去離子水(10mL)猝滅反應(yīng)，將得到的懸濁液用一次性注射器通過(guò)已經(jīng)預(yù)處理的Sep-Pak C18固相萃取柱,Sep-Pak C18固相萃取柱再用去離子水(10mL)洗滌一次以除去未反應(yīng)的F-18氟負(fù)離子。然后，用2mL的乙腈將吸附在Sep-Pak C18固相萃取柱上的有機(jī)相淋洗下來(lái)，共淋洗兩次。合并淋洗液，旋蒸除去有機(jī)溶劑，母液用0.4mL的乙腈溶解，注射至高效液相色譜儀中進(jìn)行純化(流動(dòng)相組成:乙腈/水＝80/20)。

只是對(duì)于[¹⁸F]TM-2和[¹⁸F]TM-4來(lái)說(shuō)，在第一步的F-18標(biāo)記(標(biāo)記操作與上面的步驟類(lèi)似)后，需要分別用1mol/L的鹽酸水溶液在100℃下加熱5min(對(duì)于[¹⁸F]TM-2來(lái)說(shuō))或1mol/L的氯化氫氣體的乙酸乙酯溶液在常溫下反應(yīng)15min(對(duì)于[¹⁸F]TM-4來(lái)說(shuō))來(lái)進(jìn)行Boc保護(hù)基團(tuán)脫保護(hù)，冷卻后，再用1mol/L的氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)pH至強(qiáng)堿性后，用適量的乙酸乙酯萃取，旋蒸除去有機(jī)溶劑，再用0.4mL的乙腈溶解后，用HPLC進(jìn)行分離純化。

對(duì)于[¹⁸F]TM-1和[¹⁸F]TM-2來(lái)說(shuō)，HPLC純化和分離過(guò)程均使用總流速為4.0mL/min的二元等度洗脫劑(乙腈/水(含千分之一的三乙胺)＝80/20)進(jìn)行洗脫；對(duì)于[¹⁸F]TM-3和[¹⁸F]TM-4來(lái)說(shuō)，HPLC純化和分離過(guò)程均使用總流速為2.0mL/min的二元等度洗脫劑(乙腈/水(含千分之一的三乙胺)＝80/20)進(jìn)行洗脫。對(duì)于每個(gè)F-18藥物分子來(lái)說(shuō)，放化合成總時(shí)間均大約為60min，放化產(chǎn)率分別為1％、1％、5％和3％(未衰變校正)，放化純均大于98％。

實(shí)驗(yàn)例

F-18藥物分子的體外穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

F-18藥物分子在生理鹽水中的體外穩(wěn)定性研究：將F-18藥物分子各10μCi分散于100μL的生理鹽水中,然后在37℃下與500μL的生理鹽水混合，分別孵育1h或2h。然后，分別取100μL的溶液進(jìn)行radio-HPLC純度分析。

F-18藥物分子在小鼠血清中的體外穩(wěn)定性研究：將F-18藥物分子各10μCi分散于100μL的生理鹽水中,然后在37℃下與500μL的小鼠血清混合，分別孵育1h或2h。然后，在4℃下以5000rpm的轉(zhuǎn)速離心5min，離心后，分別加入分別200μL的乙腈，收集上清液，取100μL的上清液進(jìn)行radio-HPLC純度分析。

Radio-HPLC分析結(jié)果顯示，本發(fā)明所有的F-18化合物在37℃下于生理鹽水和小鼠血漿中放置1h和2h后都是穩(wěn)定的。

體外FAK酶活性抑制實(shí)驗(yàn)

該實(shí)驗(yàn)以本發(fā)明實(shí)施例1-3制備的[¹⁹F]TM-1、[¹⁹F]TM-2、[¹⁹F]TM-3和[¹⁹F]TM-4及其部分藥物中間體為實(shí)驗(yàn)試劑，以諾華公司研發(fā)的FAK抑制劑NVP-TAE226和輝瑞公司研發(fā)的FAK抑制劑PF-562,271作為陽(yáng)性對(duì)照藥。

使用(Homogeneous Time-Resolved Fluorescence,均相時(shí)間分辨熒光)kinEASE^TM-TK試劑盒和被截短的人類(lèi)FAK(PTK2)[376-1052(end)amino acids of accession number NP_722560.1]酶進(jìn)行FAK酶活性抑制實(shí)驗(yàn)。

在正式的測(cè)試之前，首先進(jìn)行了酶濃度、酶反應(yīng)時(shí)間和ATP濃度的優(yōu)化。優(yōu)化后的條件為：使用濃度為0.11ng/μL同濃度為13.8μM的ATP在室溫下反應(yīng)50分鐘。

在接下來(lái)的酶反應(yīng)步驟期間，首先將4μL的梯度稀釋的待測(cè)小分子化合物(相對(duì)應(yīng)的F-19標(biāo)準(zhǔn)品)、2μL的TK底物-生物素溶液和2μL的FAK激酶溶液進(jìn)行孵育，然后加入2μL的ATP溶液?jiǎn)?dòng)酶反應(yīng)。接下來(lái)，依次加入酶緩沖液(來(lái)自 kinEASE^TM-TK試劑盒)、5mM的MgCl₂,1mM的DTT(二硫代蘇糖醇)和25nM的SEB(staphylococcal enterotoxin B，葡萄球菌腸毒素B)溶液。

將檢測(cè)試劑(5μL的Eu³⁺-穴狀化合物標(biāo)記的TK-抗體和5μL的鏈霉親和素-XL665)溶解于檢測(cè)緩沖液中(在有EDTA存在的情況下)，攪拌后加入到上述反應(yīng)體系中。在上述孵育過(guò)程進(jìn)行1小時(shí)之后，用酶標(biāo)儀(BMG FS型)檢測(cè)同激酶的磷酸化水平成正比的TR-FRET(time-resolved fluorescence energy transfer，時(shí)間分辨熒光能量轉(zhuǎn)移)信號(hào)。對(duì)于每一個(gè)待測(cè)的小分子化合物(相對(duì)應(yīng)的F-19標(biāo)準(zhǔn)品)，通過(guò)使用Graph-Pad Prism軟件(GraphPad Software,San Diego,CA,USA)做出S形的劑量反應(yīng)曲線(xiàn)而測(cè)得其對(duì)FAK酶活性抑制的IC₅₀(半數(shù)抑制濃度)值。檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)下表1：

表1本發(fā)明FAK靶向化合物體外FAK酶活性抑制測(cè)定結(jié)果

^a三次平行測(cè)試的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。

在上述體外FAK激酶活性抑制的實(shí)驗(yàn)中，所有的化合物都采用HTRF方法進(jìn)行評(píng)估。首先，兩個(gè)已經(jīng)被文獻(xiàn)報(bào)道的FAK抑制劑，NVP-TAE226和PF-562,271(分別由諾華公司和輝瑞公司研制)，被作為陽(yáng)性對(duì)照藥，用于驗(yàn)證FAK活性抑制實(shí)驗(yàn)條件的有效性。在“實(shí)驗(yàn)部分”提到的實(shí)驗(yàn)條件下，我們所測(cè)得的NVP-TAE226和PF-562,271對(duì)FAK活性抑制的IC₅₀值分別為2.7nM和4.3nM，這與先前文獻(xiàn)中報(bào)道的5.3nM和1.5nM非常接近。

如表1所示，本發(fā)明所有提到的F-19標(biāo)準(zhǔn)品以及部分藥物中間體對(duì)FAK活性抑制的IC₅₀值的變化范圍較為廣泛，為0.4nM-30685.3nM。其中，[¹⁹F]TM-2、IM3-1、[¹⁹F]TM-1和IM3-2的結(jié)果非常理想，分別為0.4nM、2.2nM、3.7nM和4.7nM；而且[¹⁹F]TM-2、IM3-1、[¹⁹F]TM-1在此方面均優(yōu)于目前文獻(xiàn)報(bào)道的藥效最好的FAK抑制劑PF-562,271(輝瑞公司研制，目前正在進(jìn)行臨床II期研究)，IM3-2也在此方面與之處于同一數(shù)量級(jí)。

初步試驗(yàn)的結(jié)果表明，本發(fā)明的上述化合物所表現(xiàn)出的優(yōu)異的FAK體外激酶活性抑制能力，為這些化合物今后在制備成腫瘤治療藥物后能夠體現(xiàn)出優(yōu)異的腫瘤生長(zhǎng)抑制效果，奠定了堅(jiān)實(shí)的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，同時(shí)也為這些化合物今后開(kāi)發(fā)成放射性藥物進(jìn)行腫瘤的早期診斷研究，提供了較為充分的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

F-18放射性藥物在荷S180腫瘤小鼠體內(nèi)的生物分布實(shí)驗(yàn)

首先，脫臼處死一只荷S180肉瘤腹水小鼠，從尸體內(nèi)吸出新鮮的腹水，制成S180肉瘤細(xì)胞懸浮液(將腹水離心，倒出上清液后，底部的沉淀用生理鹽水稀釋4-5倍)。然后，將制成的S180肉瘤細(xì)胞懸浮液對(duì)每只正常ICR小鼠在右前側(cè)部位進(jìn)行皮下接種(每只小鼠100μL，包含用細(xì)胞計(jì)數(shù)測(cè)定的大約5×10⁶個(gè)腫瘤細(xì)胞)。等到腫瘤尺寸長(zhǎng)到直徑為0.5-0.8cm(大約需要一周時(shí)間)的大小，便可進(jìn)行接下來(lái)的體內(nèi)的生物分布和小動(dòng)物PET影像學(xué)研究。

體內(nèi)生物分布數(shù)據(jù)的測(cè)定：將包含有實(shí)施例4制備的F-18放射性藥物分子的生理鹽水溶液(5-15μCi，100μL)通過(guò)尾靜脈注射的方式注射至每只荷S180腫瘤小鼠體內(nèi)。荷S180腫瘤小鼠(每個(gè)時(shí)相用5只小鼠進(jìn)行平行測(cè)定)分別在靜脈注射后5、15、30、60和120min后被斷頭處死。然后，對(duì)感興趣的器官和組織進(jìn)行解剖、稱(chēng)重和放射性計(jì)數(shù)的測(cè)定，體內(nèi)生物分布數(shù)據(jù)以％ID/g表述(腸、胃用％ID進(jìn)行表述)，取平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。測(cè)定結(jié)果數(shù)據(jù)分別列于下面表2、表3、表4和表5中：

表2[¹⁸F]TM-1在荷S180腫瘤小鼠體內(nèi)的生物分布^a(logP＝2.68±0.12)

^a通過(guò)尾靜脈注射的方式向每只小鼠注射5μCi的[¹⁸F]TM-1。分別在注射后5、15、30、60和120分鐘后，于每個(gè)時(shí)相斷頸處死5只小鼠。除非另做說(shuō)明，生物分布數(shù)據(jù)以％ID/g(％injected dose per gram)表示，為五只小鼠的％ID/g的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。

^b生物分布數(shù)據(jù)以％ID(％injected dose per organ)表示，為五只小鼠的％ID的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。.

表3[¹⁸F]TM-2在荷S180腫瘤小鼠體內(nèi)的生物分布^a(logP＝2.07±0.05)

^a通過(guò)尾靜脈注射的方式向每只小鼠注射5μCi的[¹⁸F]TM-2。分別在注射后5、15、30、60和120分鐘后，于每個(gè)時(shí)相斷頸處死5只小鼠。除非另做說(shuō)明，生物分布數(shù)據(jù)以％ID/g(％injected dose per gram)表示，為五只小鼠的％ID/g的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。

^b生物分布數(shù)據(jù)以％ID(％injected dose per organ)表示，為五只小鼠的％ID的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。

表4[¹⁸F]TM-3在荷S180腫瘤小鼠體內(nèi)的生物分布^a(logP＝1.21±0.10)

^a通過(guò)尾靜脈注射的方式向每只小鼠注射15μCi的[¹⁸F]TM-3。分別在注射后5、15、30、60和120分鐘后，于每個(gè)時(shí)相斷頸處死5只小鼠。除非另做說(shuō)明，生物分布數(shù)據(jù)以％ID/g(％injected dose per gram)表示，為五只小鼠的％ID/g的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。

^b生物分布數(shù)據(jù)以％ID(％injected dose per organ)表示，為五只小鼠的％ID的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。

表5[¹⁸F]TM-4在荷S180腫瘤小鼠體內(nèi)的生物分布^a(logP＝0.94±0.07)

^a通過(guò)尾靜脈注射的方式向每只小鼠注射15μCi的[¹⁸F]TM-4。分別在注射后5、15、30、60和120分鐘后，于每個(gè)時(shí)相斷頸處死5只小鼠。除非另做說(shuō)明，生物分布數(shù)據(jù)以％ID/g(％injected dose per gram)表示，為五只小鼠的％ID/g的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。

^b生物分布數(shù)據(jù)以％ID(％injected dose per organ)表示，為五只小鼠的％ID的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。

大體上，由表3、表4和表5所示，[¹⁸F]TM-2于尾靜脈注射后15min、30min和60min時(shí)，在荷S180腫瘤小鼠的腫瘤組織內(nèi)達(dá)到中等甚至是較高的攝取值，分別是5.45±0.47、6.13±0.30和6.29±0.49％ID/g，瘤/血值很高，分別是5.19、8.07和11.04，瘤/肉值較高，分別是2.68、2.53和3.93，瘤/骨值適中，分別是1.69、1.44和1.33；[¹⁸F]TM-4于尾靜脈注射后15min和30min時(shí)，在荷S180腫瘤小鼠的腫瘤組織體內(nèi)達(dá)到了較高的攝取值，分別是6.60±0.57和7.66±0.85％ID/g，瘤/肉值適中，分別是1.50和1.75，瘤/骨比值適中，分別是2.04和2.09；[¹⁸F]TM-3雖然在荷S180腫瘤小鼠的腫瘤組織內(nèi)的攝取值稍低，但也于尾靜脈注射后60min時(shí)，在荷S180腫瘤小鼠的腫瘤組織內(nèi)達(dá)到了中等的攝取值，為5.62±0.46％ID/g，瘤/血值適中，為1.48，瘤/肉比值適中，為1.95，瘤/骨值適中，為1.16。

[¹⁸F]TM-2、[¹⁸F]TM-3和[¹⁸F]TM-4在荷S180腫瘤小鼠的腫瘤組織內(nèi)的攝取值雖然分別于尾靜脈注射后120min、120min和60min時(shí)下降(分別為3.17±0.35、4.49±0.34和5.25±0.31％ID/g)，但仍然分別高于各自峰值的一半，說(shuō)明這三個(gè)F-18化合物在荷S180腫瘤小鼠的腫瘤組織內(nèi)中能夠隨著時(shí)間的推移停留較長(zhǎng)的一段時(shí)間。

從某些靶器官/非靶器官值來(lái)說(shuō)，[¹⁸F]TM-2于尾靜脈注射15min、30min和60min后的瘤/血值(5.19、8.07和11.04)，比[¹⁸F]TM-4在此方面(0.98、0.86和1.02)要高得多，[¹⁸F]TM-2于尾靜脈注射15min、30min和60min后的瘤/肉值(2.68、2.53和3.93)，也比[¹⁸F]TM-4在此方面(1.50、1.75和1.14)要高，這同[¹⁹F]TM-2對(duì)FAK作用酶活性抑制的IC₅₀值(0.4nM)，比[¹⁹F]TM-4在此方面(286.3nM)高得多的趨勢(shì)，是相一致的。另外，隨著[¹⁹F]TM-3對(duì)FAK酶活性抑制的IC₅₀值(286.3nM)，比[¹⁹F]TM-4在此方面(412.9nM)要高，[¹⁸F]TM-3在荷S180腫瘤小鼠的腫瘤組織內(nèi)達(dá)到的攝取值峰值(7.66±0.85％ID/g)，比[¹⁸F]TM-4在此方面(5.62±0.46％ID/g)也要高。

初步試驗(yàn)的結(jié)果表明，本發(fā)明的上述放射性標(biāo)記物在荷S180腫瘤小鼠體內(nèi)具有理想的生物分布，同樣也為這些化合物今后能開(kāi)發(fā)成放射性藥物進(jìn)行腫瘤的早期診斷研究，提供了較為充分的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。