本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及以ctla-4為靶點(diǎn)的免疫調(diào)節(jié)藥物在制備治療由結(jié)核分枝桿菌引起的疾病的產(chǎn)品中的應(yīng)用，具體涉及抗細(xì)胞毒性t淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4(ctla-4)單克隆抗體在制備治療結(jié)核病的產(chǎn)品中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌(mtb)引起的慢性傳染病，可侵及許多臟器，以肺部結(jié)核感染最為常見。結(jié)核病是由于機(jī)體的免疫反應(yīng)僅能夠抑制結(jié)核分枝桿菌，但是卻不能將之完全清除，導(dǎo)致體內(nèi)存在慢性、持續(xù)的抗原刺激而引起的。體內(nèi)存在多種免疫機(jī)制負(fù)責(zé)清除結(jié)核分枝桿菌，但是其中最主要的是結(jié)核分枝桿菌特異性1型cd4陽性或者cd8陽性t細(xì)胞，這類細(xì)胞能夠分泌干擾素-γ(ifn-γ)。結(jié)核病人體內(nèi)的結(jié)核分枝桿菌不能被有效清除的一個(gè)重要原因是體內(nèi)的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制抑制了結(jié)核分枝桿菌特異性1型cd4陽性或者cd8陽性t細(xì)胞的功能和mtb特異性ifn-γ的生成。體內(nèi)的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制包括調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子il-10和轉(zhuǎn)化生長因子β1(tgf-β1)等以及cd4cd25雙陽性調(diào)節(jié)性t細(xì)胞(treg)。研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)結(jié)核病人的外周血和結(jié)核部位的treg明顯增加^[1]，提示treg介導(dǎo)的免疫抑制可能是結(jié)核病發(fā)病的重要機(jī)制之一。

結(jié)核病目前仍然是威脅人類健康的一類重要疾病，全世界大約有幾百萬的患者?？ń槊缡穷A(yù)防結(jié)核病的主要手段，但是對成年人肺結(jié)核的治療效果還存在很多不確定性^[2]。成人肺結(jié)核治療方法較少，療程長，容易產(chǎn)生耐藥性和復(fù)發(fā)，因此開發(fā)新的結(jié)核病治療藥物具有重要意義。

細(xì)胞毒性t淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4(ctla-4或者cd152)屬于cd28家族成員之一，能夠與cd28競爭性結(jié)合抗原提呈細(xì)胞表面的cd80和cd86分子^[3]。ctla-4表達(dá)于cd4cd25雙陽性調(diào)節(jié)性t細(xì)胞表面，其表達(dá)水平與cd4cd25雙陽性調(diào)節(jié)性t細(xì)胞的免疫抑制功能密切相關(guān)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的之一是提供以ctla-4為靶點(diǎn)的免疫調(diào)節(jié)藥物在制備治療由結(jié)核分枝桿菌引起的疾病的產(chǎn)品中的應(yīng)用。

上述應(yīng)用中，所述疾病為結(jié)核病，優(yōu)選為肺結(jié)核。

本發(fā)明的目的之二是提供以ctla-4為靶點(diǎn)的免疫調(diào)節(jié)藥物在制備如下任一所示的產(chǎn)品中的應(yīng)用：

(1)清除cd4cd25雙陽性調(diào)節(jié)性t細(xì)胞treg的產(chǎn)品；和/或

(2)拮抗cd4cd25雙陽性調(diào)節(jié)性t細(xì)胞treg的免疫抑制作用的產(chǎn)品。

上述任一所述的應(yīng)用中，所述免疫調(diào)節(jié)藥物為抗ctla-4抗體。

上述應(yīng)用中，所述抗ctla-4抗體為抗ctla-4單克隆抗體。

上述應(yīng)用中，所述抗ctla-4單克隆抗體為全人源抗ctla-4單克隆抗體。

上述應(yīng)用中，所述全人源抗ctla-4單克隆抗體的輕鏈可變區(qū)的cdr1、cdr2、cdr3序列分別如seqidno.1的第46位至第57位、第73位至第79位、第112位至第120位所示，重鏈可變區(qū)的cdr1、cdr2、cdr3分別如seqidno.2的第45位至第51位、第70位至第76位、第118位至第126位所示。

上述任一所述的應(yīng)用中，所述全人源抗ctla-4單克隆抗體的輕鏈可變區(qū)的cdr1、cdr2、cdr3的編碼基因序列分別如seqidno.3的第136位至第171位、第217位至第237位、第334位至第360位所示，重鏈可變區(qū)的cdr1、cdr2、cdr3的編碼基因序列分別如seqidno.4的第133位至第153位、第208位至第228位、第352位至第378位所示。

上述任一所述的應(yīng)用中，所述全人源抗ctla-4單克隆抗體的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如seqidno.1的第23位至第130位所示，重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如seqidno.2的第20位至第137位所示。

上述應(yīng)用中，所述輕鏈可變區(qū)的編碼基因序列如seqidno.3的第67位至第390位所示，所述重鏈可變區(qū)的編碼基因序列如seqidno.4的第58位至第411位所示。

上述任一所述的應(yīng)用中，所述全人源抗ctla-4單克隆抗體為ibi310，ibi310由2條輕鏈和2條重鏈組成，一條輕鏈和一條重鏈之間均通過二硫鍵連接，重鏈和重鏈之間通過二硫鍵連接；其中，輕鏈的氨基酸序列如seqidno.1所示，重鏈的氨基酸序列如seqidno.2所示。

上述應(yīng)用中，所述輕鏈的編碼基因序列如seqidno.3所示，所述重鏈的編碼基因序列如seqidno.4所示。

本發(fā)明主要通過靜脈注射結(jié)核分枝桿菌誘導(dǎo)的小鼠肺結(jié)核病模型考察了抗ctla-4單克隆抗體(ibi310)對肺結(jié)核病的治療作用，并探索其作用機(jī)制。本發(fā)明的研究結(jié)果表明，抗ctla-4單克隆抗體(ibi310)能夠通過清除小鼠肺結(jié)核病模型中的cd4cd25雙陽性調(diào)節(jié)性t細(xì)胞(treg)、抑制treg中foxp3和il-10的轉(zhuǎn)錄表達(dá)、促進(jìn)il-2和ifn-γ表達(dá)、減輕結(jié)核分枝桿菌誘導(dǎo)的肺臟病變和減少肺臟肉芽腫形成而產(chǎn)生抗小鼠肺結(jié)核病的作用，提示ibi310是非常有前景的結(jié)核病治療藥物。

本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)抗ctla-4單克隆抗體能夠通過清除treg而發(fā)揮治療肺結(jié)核的作用，為ctla-4單克隆抗體用于結(jié)核病的治療提供依據(jù)，同時(shí)提示以ctla-4為靶點(diǎn)的免疫調(diào)節(jié)藥物是一類潛在的結(jié)核病治療藥物。

附圖說明

圖1為proteina親和純化后目的蛋白的sds-page檢測結(jié)果。

圖2為proteina親和純化后目的蛋白的cex-hplc檢測結(jié)果。

圖3為proteina親和純化后目的蛋白的sec-hplc檢測結(jié)果。

圖4為伊匹單抗的親和力檢測結(jié)果。

圖5為56b3-29f6的收獲液經(jīng)proteina親和純化得到的目的蛋白的親和力檢測結(jié)果。

圖6為ibi310重鏈測序片段經(jīng)dnastar-seqman軟件拼接的結(jié)果。

圖7為ibi310輕鏈測序片段經(jīng)dnastar-seqman軟件拼接的結(jié)果。

圖8為ibi310對結(jié)核分枝桿菌染毒小鼠外周血中treg細(xì)胞比例的影響(n＝10)。

圖9為ibi310對結(jié)核分枝桿菌染毒小鼠外周血中treg細(xì)胞中il-10、tgf-β1和foxp3表達(dá)的影響(n＝10)。

圖10為ibi310對結(jié)核分枝桿菌染毒小鼠脾細(xì)胞中il-2和ifn-γ表達(dá)的影響(n＝10)。

圖11為ibi310對結(jié)核分枝桿菌染毒小鼠肺臟病變的影響(×200)。

圖12為ibi310對結(jié)核分枝桿菌染毒小鼠肺臟肉芽腫指數(shù)的影響。

具體實(shí)施方式

下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

以下結(jié)合具體實(shí)施例，對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。應(yīng)理解，以下實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而非用于限定本發(fā)明的范圍。

下述實(shí)施例中所采用的還原型sds-page方法如下：按《中華人民共和國藥典》(2010年版，三部)附錄ⅳc，采用還原型sds-page凝膠電泳檢測純度，面積歸一化法計(jì)算樣品純度。

下述實(shí)施例中所采用的電荷變異體檢測(cex-hplc)方法如下：按照《中華人民共和國藥典》(2010年版，三部)附錄ⅲb進(jìn)行測定，用弱陽離子分析柱對樣品進(jìn)行檢測，面積歸一化法計(jì)算樣品酸、堿和主成分純度。

下述實(shí)施例中所采用的分子排阻色譜(sec-hplc)方法如下：按照《中華人民共和國藥典》(2010年版，三部)附錄ⅲb進(jìn)行測定，用親水硅膠體積排阻色譜柱對樣品進(jìn)行檢測，用面積歸一化法計(jì)算樣品純度。

下述實(shí)施例中的伊匹單抗處方制劑的原研藥為yervoy(ipilimumab)injection，bristol-myerssquibb公司，applicationno.:125377；approvaldate:3/25/2011，下述實(shí)施例中采用的伊匹單抗為該原研藥；其仿制藥為重組全人源抗ctla-4單克隆抗體注射液(簡稱ibi310注射液)，信達(dá)生物制藥(蘇州)有限公司產(chǎn)品，其主要成分為ibi310，該ibi310注射液由溶質(zhì)和溶劑組成，溶質(zhì)為ibi310、枸櫞酸鈉、甘露醇、精氨酸、氯化鈉、edta-2na(乙二胺四乙酸二鈉)和聚山梨酯80，溶劑為注射用水；抗ctla-4單克隆抗體(ibi310)在該ibi310注射液中的濃度為5mg/ml，枸櫞酸鈉為5.88mg/ml，甘露醇為10.02mg/ml，精氨酸為4.36mg/ml，氯化鈉為5.84mg/ml，edta-2na為0.037mg/ml，聚山梨酯80為0.7mg/ml；ph為6.0。

中國倉鼠卵巢細(xì)胞系s亞型(cho-s)為invitrogen公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號(hào)為a13696-1。

cdforticho為invitrogen公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號(hào)為a11483-01。

anti-clumpingagent(防結(jié)塊劑)為invitrogen公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號(hào)為0010057ae。

mtx(氨甲喋呤)為calbiochem公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號(hào)為a6770。

puro(嘌呤霉素)為invitrogen公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號(hào)為a11138-03。

結(jié)核分枝桿菌(mycobacteriumtuberculosis)為atcc產(chǎn)品，貨號(hào)為atcc25618。

人ctla-4轉(zhuǎn)基因小鼠(c57bl/6背景，雌性，6～8周齡，18～22g)為南京銀河生物醫(yī)藥有限公司產(chǎn)品。

異煙肼為上海信誼黃河制藥有限公司產(chǎn)品，國藥準(zhǔn)字h31020495，批號(hào)068131001。

利福平為廣東華南藥業(yè)集團(tuán)有限公司產(chǎn)品，國藥準(zhǔn)字h44020771，批號(hào)151001。

重組熱休克蛋白65(heatshockprotein65mycobacteriumtuberculosisrecombinant)為prospec公司產(chǎn)品，目錄號(hào)為hsp-065。

下述實(shí)施例中的統(tǒng)計(jì)分析采用spss13.0forwindows軟件進(jìn)行單因素方差分析結(jié)合t檢驗(yàn)，p<0.05認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

實(shí)施例1、抗ctla-4單克隆抗體(ibi310)的制備

ibi310的氨基酸序列與伊匹單抗(ipilimumab)的氨基酸序列相同。

一、載體構(gòu)建

根據(jù)freedom^tmcho-s^tmkit說明書，分別將ibi310的重鏈基因(seqidno.4)和輕鏈基因(seqidno.3)插入表達(dá)載體freedom^tmpcho1.0(freedom^tmcho-s^tmkit，gibco產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號(hào)為a13696-01)的第一個(gè)和第二個(gè)目的基因表達(dá)框架，構(gòu)建成ibi310抗體表達(dá)質(zhì)粒pcho1.0-ihekr。

二、表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞

根據(jù)freestyle^tmpmaxreagent說明書，通過invitrogen化學(xué)轉(zhuǎn)染試劑(freestyle^tmpmaxreagent，貨號(hào)：16447-100)將ibi310抗體表達(dá)質(zhì)粒pcho1.0-ihekr轉(zhuǎn)入cho-s宿主細(xì)胞中，完成轉(zhuǎn)染。

三、轉(zhuǎn)染后加壓篩選

將轉(zhuǎn)染48小時(shí)后的6瓶細(xì)胞懸液過濾后分別分裝至兩個(gè)方瓶中。使用含有puro、mtx的篩選培養(yǎng)基(表1)，在培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，7天后檢測細(xì)胞活率，根據(jù)細(xì)胞活率數(shù)值完成第一、二階段加壓篩選。

表1培養(yǎng)基組分表

四、細(xì)胞群產(chǎn)量檢測

對第一和第二階段分別得到的12個(gè)細(xì)胞群采用6孔板5天靜置培養(yǎng)的方法進(jìn)行高產(chǎn)細(xì)胞群的篩選。用fortebio定量法檢測上清抗體表達(dá)量。該方法通過proteinasensor檢測不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線來計(jì)算待測樣品的濃度，選取抗體表達(dá)量最高的細(xì)胞群yy310-210/100-50/1000。

五、陽性單克隆篩選

利用有限稀釋法對選取的細(xì)胞群yy310-210/100-50/1000進(jìn)行單克隆。用克隆培養(yǎng)基(表1)，經(jīng)96孔板、6孔板兩個(gè)階段，進(jìn)行高產(chǎn)克隆的篩選。根據(jù)6孔板篩選結(jié)果，將抗體表達(dá)量最高的12個(gè)克隆擴(kuò)增培養(yǎng)并進(jìn)行補(bǔ)糖實(shí)驗(yàn)，獲得抗體表達(dá)量相對較高的細(xì)胞株56b3。

六、亞克隆細(xì)胞株的篩選

為保證構(gòu)建主細(xì)胞庫所用細(xì)胞的單克隆性，對ibi310原始克隆細(xì)胞庫內(nèi)的產(chǎn)量和穩(wěn)定性均好的細(xì)胞株56b3進(jìn)行了亞克隆。所用亞克隆方法同為有限稀釋法，經(jīng)96孔板、6孔板兩個(gè)階段篩選出3個(gè)高產(chǎn)亞克隆：56b3-25d11、56b3-26d5和56b3-29f6，建立了由該3個(gè)亞克隆構(gòu)成的原始亞克隆細(xì)胞庫。

七、確定最終生產(chǎn)用細(xì)胞株

56b3-25d11、56b3-26d5和56b3-29f6三個(gè)亞克隆的收獲液經(jīng)proteina親和純化得到目的蛋白。以伊匹單抗為對照，采用sds-page法檢測，結(jié)果如圖1所示。

圖1中，m為蛋白marker(neb產(chǎn)品，貨號(hào)為p7703)；st:伊匹單抗；25d11、26d5和29f6分別代表56b3-25d11、56b3-26d5和56b3-29f6的收獲液經(jīng)proteina親和純化得到的目的蛋白。

圖1表明，56b3-25d11、56b3-26d5和56b3-29f6亞克隆細(xì)胞株所表達(dá)的目的蛋白的相對分子量大小和純度與伊匹單抗一致。

以伊匹單抗為對照，cex-hplc法檢測各亞克隆的收獲液經(jīng)proteina親和純化得到的目的蛋白的電荷異構(gòu)，結(jié)果如圖2所示。

圖2中，亞克隆25d11、26d5和29f6分別代表56b3-25d11、56b3-26d5和56b3-29f6的收獲液經(jīng)proteina親和純化得到的目的蛋白。

圖2表明，56b3-25d11、56b3-26d5和56b3-29f6亞克隆細(xì)胞株所表達(dá)的目的蛋白與伊匹單抗相比，主峰一致。

以伊匹單抗為對照，sec-hplc法檢測各亞克隆的收獲液經(jīng)proteina親和純化得到的目的蛋白的純度，結(jié)果如圖3所示。

圖3中，亞克隆25d11、26d5和29f6分別代表56b3-25d11、56b3-26d5和56b3-29f6的收獲液經(jīng)proteina親和純化得到的目的蛋白。

圖3表明，56b3-25d11、56b3-26d5和56b3-29f6亞克隆細(xì)胞株所表達(dá)的目的蛋白的保留時(shí)間與伊匹單抗一致，純度均較高。

以伊匹單抗為對照，對56b3-29f6的收獲液經(jīng)proteina親和純化得到的目的蛋白進(jìn)行親和力檢測，結(jié)果如圖4和圖5所示。

圖4和圖5表明，亞克隆56b3-29f6表達(dá)的目的蛋白的親和力與伊匹單抗相近。

對56b3-25d11、56b3-26d5和56b3-29f6這3個(gè)亞克隆細(xì)胞株進(jìn)行60天穩(wěn)定性檢測，結(jié)果顯示：56b3-29f6細(xì)胞株抗體產(chǎn)量無降低，56b3-25d11和56b3-26d5兩個(gè)細(xì)胞株的抗體產(chǎn)量有所降低。最終選定56b3-29f6為ibi310亞克隆。

八、原始細(xì)胞株的鑒定

對原始細(xì)胞株56b3-29f6進(jìn)行基因組內(nèi)目的基因測序，表達(dá)產(chǎn)物鑒定，質(zhì)譜確定分子量。對重鏈和輕鏈采用pcr產(chǎn)物測序的方法。

ibi310重鏈測序片段經(jīng)dnastar-seqman軟件拼接后(如圖6所示)，得到基因序列hcseqman，該序列與伊匹單抗重鏈目的基因的理論序列進(jìn)行blast對比，結(jié)果表明二者完全一致。

ibi310輕鏈測序片段經(jīng)dnastar-seqman軟件拼接后(如圖7所示)，得到基因序列l(wèi)cseqman，該序列與伊匹單抗輕鏈目的基因的理論序列進(jìn)行blast對比，結(jié)果表明二者完全一致。

九、細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)物的鑒定

細(xì)胞株56b3-29f6進(jìn)行搖瓶流加培養(yǎng)14天。收獲液經(jīng)proteina親和純化后進(jìn)行通過液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測樣品的分子量，ibi310的分子量和伊匹單抗的分子量完全相同，如表2所示。

表2伊匹單抗與ibi310分子量對比

抗ctla-4單克隆抗體(ibi310)由2條輕鏈和2條重鏈組成，一條輕鏈和一條重鏈之間均通過二硫鍵連接，重鏈和重鏈之間通過二硫鍵連接；輕鏈的氨基酸序列如seqidno.1所示，重鏈的氨基酸序列如seqidno.2所示；輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如seqidno.1的第23位至第130位所示，重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如seqidno.2的第20位至第137位所示；輕鏈可變區(qū)的cdr1、cdr2、cdr3序列分別如seqidno.1的第46位至第57位、第73位至第79位、第112位至第120位所示，重鏈可變區(qū)的cdr1、cdr2、cdr3分別如seqidno.2的第45位至第51位、第70位至第76位、第118位至第126位所示。

該單克隆抗體的輕鏈的編碼基因序列如seqidno.3所示，重鏈的編碼基因序列如seqidno.4所示；輕鏈可變區(qū)的編碼基因序列如seqidno.3的第67位至第390位所示，重鏈可變區(qū)的編碼基因序列如seqidno.4的第58位至第411位所示；輕鏈可變區(qū)的cdr1、cdr2、cdr3的編碼基因序列分別如seqidno.3的第136位至第171位、第217位至第237位、第334位至第360位所示，重鏈可變區(qū)的cdr1、cdr2、cdr3的編碼基因序列分別如seqidno.4的第133位至第153位、第208位至第228位、第352位至第378位所示。

實(shí)施例2、ibi310對結(jié)核分枝桿菌誘導(dǎo)的小鼠肺結(jié)核病模型的治療作用

一、將人ctla-4轉(zhuǎn)基因小鼠(c57bl/6小鼠背景，ctla-4蛋白的胞外端替換為人的氨基酸序列)隨機(jī)分為ibi31010mg/kg組、模型對照組和陽性對照組，并設(shè)立人ctla-4轉(zhuǎn)基因小鼠正常對照組，每組10只(spf級(jí)別，6～8周齡，18～22g)，對各組進(jìn)行如下處理：

ibi31010mg/kg組：小鼠靜脈注射給予結(jié)核分枝桿菌(mycobacteriumtuberculosis)5×10⁵菌落形成單位(cfu)/只，建立小鼠肺結(jié)核病模型，肺臟組織勻漿液體外培養(yǎng)可見結(jié)核分枝桿菌生長且肺臟病理可見炎癥浸潤和肉芽腫形成可判斷為模型成功。從染毒當(dāng)日開始對小鼠腹腔注射ibi310注射液給予ibi310(將ibi310注射液用0.9％生理鹽水稀釋至1mg/ml后使用，當(dāng)天配制當(dāng)天使用)進(jìn)行治療，給藥劑量為10mg/kg，每周給藥1次，連續(xù)給予10周。

正常對照組：人ctla-4轉(zhuǎn)基因小鼠，不注射結(jié)核分枝桿菌，給藥方法同ibi31010mg/kg組，僅將ibi310注射液替換為等體積的生理鹽水。

模型對照組：小鼠肺結(jié)核病模型的建立及鑒定同ibi31010mg/kg組。給藥方法同ibi31010mg/kg組，僅將ibi310注射液替換為生理鹽水。

陽性對照組(異煙肼+利福平組)：小鼠肺結(jié)核病模型的建立及鑒定同ibi31010mg/kg組。從染毒當(dāng)日開始對小鼠灌胃給予異煙肼60mg/kg聯(lián)合利福平120mg/kg進(jìn)行治療，給藥體積分別為10ml/kg，每天給藥1次，連續(xù)給予10周。

二、ibi310對外周血中treg細(xì)胞比例的影響

末次給藥后分別采集ibi31010mg/kg組、正常對照組、模型對照組和陽性對照組小鼠的外周血，分離treg細(xì)胞。大致過程如下：采用dynalcd4cd25雙陽性treg分離試劑(flowcompmousecd4+cd25+tregcells，invitrogen公司產(chǎn)品，目錄號(hào)11463d)從外周血單核細(xì)胞中分離并富集treg，用抗cd14、抗cd56、抗cd19、抗cd8和抗cd235α抗體雞尾酒和去除磁珠從外周血單核細(xì)胞中分離cd4陽性t細(xì)胞，純化的cd4陽性t細(xì)胞與cd25磁珠孵育后使treg富集于磁珠表面，經(jīng)過洗脫后收集treg(詳細(xì)過程參見使用說明書)。用流式細(xì)胞儀分析cd4cd25雙陽性調(diào)節(jié)性t細(xì)胞(treg)的比例，treg細(xì)胞比例＝(treg細(xì)胞數(shù)/cd4陽性t細(xì)胞數(shù))×100％。

結(jié)果如圖8所示。圖8中，#p<0.05，與正常對照組比較；*p<0.05，與模型對照組比較。

結(jié)果表明，結(jié)核分枝桿菌染毒小鼠10周后外周血中treg細(xì)胞比例明顯增加，給予ibi310治療的小鼠(即ibi31010mg/kg組小鼠)，外周血中treg細(xì)胞比例明顯低于模型對照組，提示ibi310能夠清除treg。陽性對照藥異煙肼聯(lián)合利福平對外周血中treg無明顯影響。

三、ibi310對結(jié)核分枝桿菌染毒小鼠外周血中treg中il-10、tgf-β1和foxp3表達(dá)的影響

(一)各組treg分離和純化同步驟二。

(二)q-rt-pcr方法測定il-10、tgf-β1和foxp3的表達(dá)

1、采用rna提取和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(powergreencells-to-ct^tmkit，thermofisher公司產(chǎn)品，目錄號(hào)4402953)從收集的各組treg中提取rna，提取的rna樣本進(jìn)一步用無rna酶的dna酶ⅰ處理以消除dna的污染。

2、在逆轉(zhuǎn)錄緩沖液中，用隨機(jī)引物將rna逆轉(zhuǎn)錄,得到cdna。

3、以各cdna為模板，分別以il-10f和il-10r引物對、tgf-β1f和tgf-β1r引物對和foxp3f和foxp3r引物對進(jìn)行pcr擴(kuò)增，分別得到il-10、tgf-β1和foxp3特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。同時(shí)以gapdhf和gapdhr為引物對，對內(nèi)參基因gapdh進(jìn)行pcr擴(kuò)增。il-10、tgf-β1和foxp3擴(kuò)增產(chǎn)物的量用甘油醛-3-磷酸脫氫酶(gapdh)的量進(jìn)行校正，然后將正常對照組的表達(dá)量定義為100％，計(jì)算每個(gè)細(xì)胞因子相對表達(dá)量計(jì)算方法為：因子x相對表達(dá)量＝[除正常對照組外的各組(因子x信號(hào)值/gapdh信號(hào)值)/正常對照組(因子x信號(hào)值/gapdh信號(hào)值)]，最后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

特異性引物如表3所示。

表3

結(jié)果如圖9所示。圖9中，#p<0.05、##p<0.01，與正常對照組比較；*p<0.05，與模型對照組比較。

結(jié)果表明，結(jié)核分枝桿菌染毒小鼠10周后外周血中的treg中的il-10和foxp3的mrna明顯增加，tgf-β1的mrna雖然也出現(xiàn)一定程度增加，但是與正常對照組相比，不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異。ibi310治療10周后，能夠明顯降低il-10和foxp3的mrna水平，但是對tgf-β1的mrna水平?jīng)]有明顯影響。陽性對照藥異煙肼聯(lián)合利福平對外周血中treg的il-10、tgf-β1和foxp3的mrna水平無明顯影響。

四、ibi310對結(jié)核分枝桿菌染毒小鼠脾細(xì)胞il-2和ifn-γ表達(dá)的影響

末次給藥后將各組動(dòng)物處死后立即分離脾臟，制備單細(xì)胞懸液，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔含5×10⁶個(gè)細(xì)胞，同時(shí)加入重組熱休克蛋白65，終濃度為20μg/ml，每個(gè)動(dòng)物樣本設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，作用48小時(shí)后取上清液，按照說明書的操作，用elisa方法檢測il-2和ifn-γ的水平(mouseil-2elisakit(interleukin-2)為abcam產(chǎn)品，目錄號(hào)為ab100706；mouseinterferongammaelisakit(ifng)為abcam產(chǎn)品，目錄號(hào)為ab100690)。

il-2大致檢測方法如下：(1)小鼠il-2特異性抗體包被96孔板，4℃過夜；(2)加入待測樣品和標(biāo)準(zhǔn)品，4℃孵育過夜；(3)充分洗滌后，加入生物素化抗小鼠il-2抗體，室溫孵育2h；(4)充分洗滌后，加入辣根過氧化物酶偶聯(lián)鏈霉親和素，室溫孵育1h；(5)充分洗滌后，加入tmb底物，顯色后用酶標(biāo)儀在450nm處讀取吸光度值；(6)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算il-2的濃度。

ifn-γ大致檢測方法如下：(1)小鼠ifn-γ特異性抗體包被96孔板，4℃過夜；(2)加入待測樣品和標(biāo)準(zhǔn)品，4℃孵育過夜；(3)充分洗滌后，加入生物素化抗小鼠ifn-γ抗體，室溫孵育2h；(4)充分洗滌后，加入辣根過氧化物酶偶聯(lián)鏈霉親和素，室溫孵育1h；(5)充分洗滌后，加入tmb底物，顯色后用酶標(biāo)儀在450nm處讀取吸光度值；(6)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算ifn-γ的濃度。

結(jié)果如圖10所示。圖10中，***p<0.001，與模型對照組比較。

結(jié)果表明，正常對照組小鼠脾細(xì)胞在熱休克蛋白65的刺激下能夠表達(dá)少量的il-2和ifn-γ；結(jié)核分枝桿菌染毒小鼠的脾細(xì)胞雖然在體內(nèi)和體外分別受到了結(jié)核分枝桿菌和熱休克蛋白65的雙重刺激，但是可能由于treg的影響，il-2和ifn-γ的表達(dá)量仍然不高；但是結(jié)核分枝桿菌染毒小鼠接受10周的ibi310治療后，il-2和ifn-γ的表達(dá)量明顯增加，提示ibi310可能通過消除treg的抑制作用而促進(jìn)機(jī)體對外源抗原的反應(yīng)。陽性對照藥異煙肼聯(lián)合利福平對脾細(xì)胞中il-2和ifn-γ的水平無明顯影響。

五、ibi310對結(jié)核分枝桿菌染毒小鼠肺臟病變和肉芽腫指數(shù)的影響

末次給藥后分離各組小鼠的肺臟，稱重、固定并切片，he染色，顯微鏡觀察并計(jì)算肺臟肉芽腫指數(shù)，肉芽腫指數(shù)＝(肺臟重量/動(dòng)物體重)×250(he染色參見文獻(xiàn)yoshidas,tanakat,kitay,etal.dnavaccineusinghemagglutinatingvirusofjapan-liposomeencapsulatingcombinationencodingmycobacterialheatshockprotein65andinterleukin-12confersprotectionagainstmycobacteriumtuberculosisbytcellactivation.vaccine,24:1191-1204,2006；肉芽腫指數(shù)實(shí)驗(yàn)參見文獻(xiàn)moorevl,myrvikqn,leakees.specificityofabcg-inducedpulmonarygranulomatousresponseinrabbits.infectionandimmunity,7:743-746,1973)。

he染色結(jié)果如圖11所示。

肉芽腫指數(shù)的結(jié)果如圖12所示。圖12中，##p<0.01，與正常對照組比較；**p<0.01，與模型對照組比較。

以上病理學(xué)檢測結(jié)果表明，正常小鼠的肺臟組織結(jié)構(gòu)規(guī)則，細(xì)胞排列有規(guī)律，層次清晰，未見炎癥細(xì)胞浸潤；結(jié)核分枝桿菌染毒小鼠肺臟結(jié)構(gòu)混亂，細(xì)胞排列無規(guī)律，無層次感，并且存在大量的炎性細(xì)胞浸潤和廣泛的間質(zhì)損傷以及肉芽腫形成；染毒小鼠給予ibi310治療10周后，肺臟病理損傷明顯減輕，炎癥細(xì)胞浸潤明顯減少，肉芽腫形成明顯減少；陽性對照藥異煙肼聯(lián)合利福平治療后肺臟病理損傷明顯減輕，炎癥細(xì)胞浸潤明顯減少，肉芽腫形成明顯減少，作用效果與ibi310相近。

本發(fā)明研究結(jié)果表明，抗ctla-4單克隆抗體(ibi310)能夠通過清除小鼠肺結(jié)核病模型中的cd4cd25雙陽性調(diào)節(jié)性t細(xì)胞(treg)、抑制treg中foxp3和il-10轉(zhuǎn)錄表達(dá)、促進(jìn)il-2和ifn-γ表達(dá)、減輕結(jié)核分枝桿菌誘導(dǎo)的肺臟病變和減少肺臟肉芽腫形成而產(chǎn)生抗小鼠肺結(jié)核病的作用，提示ibi310是非常有前景的結(jié)核病治療藥物，同時(shí)提示以ctla-4為靶點(diǎn)的免疫調(diào)節(jié)藥物是一類潛在的結(jié)核病治療藥物。

參考文獻(xiàn)：

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序列表

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<120>以ctla-4為靶點(diǎn)的免疫調(diào)節(jié)藥物治療結(jié)核病的應(yīng)用

<160>12

<210>1

<211>237

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>1

metasppheglnvalglnileileserpheleuleuileseralaser

151015

valilemetserargglygluilevalleuthrglnserproglythr

202530

leuserleuserproglygluargalathrleusercysargalaser

354045

glnservalglysersertyrleualatrptyrglnglnlysprogly

505560

glnalaproargleuleuiletyrglyalapheserargalathrgly

65707580

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859095

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100105110

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115120125

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130135140

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145150155160

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165170175

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225230235

<210>2

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354045

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505560

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65707580

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859095

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100105110

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325330335

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465

<210>3

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<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>3

atggacttccaggtgcagatcatctccttcctgctgatcagcgcctccgtgattatgagc60

cggggcgagatcgtgctgacccaaagccctggcacactcagcctgtcccctggagagcgg120

gctacactgtcctgcagggccagccagtccgtgggatcctcctacctggcctggtaccag180

cagaaacccggccaggctcccaggctgctgatctatggcgctttctccagggccaccgga240

atccccgataggttcagcggctccggaagcggaaccgacttcaccctgaccatcagcagg300

ctggagcccgaggactttgccgtgtattactgccagcagtacggatcctccccctggaca360

ttcggccagggcacaaaggtggagatcaagaggaccgtcgccgccccctccgtctttatc420

ttccccccctccgacgagcaactgaagagcggcacagcctccgtggtctgcctcctgaac480

aacttctaccccagggaggccaaggtccagtggaaagtggacaacgccctgcagtccggc540

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<210>4

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<213>人工序列

<220>

<223>

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