本發(fā)明涉及一種重組蛋白，具體涉及一種可溶性重組蛋白及其表達(dá)純化方法和用途。

背景技術(shù)：

豬圓環(huán)病毒ii型(porcinecircovirus2，pcv2)是斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(postweaningmultisystemicwastingsyndrome，pmws)的主要病原，自1991年在加拿大豬群中首次報(bào)道pmws以來(lái)，該病已世界流行。而目前疫苗免疫接種是防控pcv2感染的有效手段。國(guó)內(nèi)外已經(jīng)商品化的疫苗主要有全病毒滅活苗和亞單位疫苗兩種，全病毒滅活苗，雖已有生產(chǎn)，但因體外培養(yǎng)增值能力不強(qiáng)，病毒滴度低，有時(shí)需要濃縮才能達(dá)到要求，且存在生產(chǎn)中批間質(zhì)量難統(tǒng)一等問(wèn)題。相比之下，亞單位疫苗具有較好的安全性，并且免疫原性高，但同時(shí)存在表達(dá)量低且生產(chǎn)成本很高，難以在生產(chǎn)中使用該疫苗。因此尋找新的技術(shù)策略，提高亞單位疫苗的表達(dá)量是研制疫苗的關(guān)鍵。

圓環(huán)病毒(pcv)是目前發(fā)現(xiàn)的最小的動(dòng)物病毒。研究表明pcv2含11個(gè)開(kāi)放閱讀框(orfs)，其中orf2基因編碼病毒衣殼，唯一的結(jié)構(gòu)蛋白cap蛋白，也是主要免疫原性蛋白。pcv2cap蛋白具有在體外自我組裝成病毒樣顆粒的特點(diǎn)。該病毒樣顆粒(viruslikeparticles，vlp)的形態(tài)、大小、結(jié)構(gòu)及表面抗原和多肽表位與天然的病毒粒子相同或相似，可通過(guò)與病毒感染一樣的途徑呈遞給免疫細(xì)胞，有效地誘導(dǎo)機(jī)體的免疫應(yīng)答，具有良好的免疫原性，且無(wú)毒副作用。目前，已有部分vlps疫苗上市，如流感vlps疫苗、乙肝vlps疫苗、乳頭瘤vlps疫苗等，說(shuō)明該類(lèi)疫苗有巨大的潛力。

而大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)是目前最常用的外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)，具有產(chǎn)量高、生長(zhǎng)速度快、操作簡(jiǎn)單、成本低的優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)結(jié)合高密度發(fā)酵技術(shù)能有效提高重組大腸桿菌的菌體密度，增加重組蛋白的表達(dá)量，是非常經(jīng)濟(jì)高效的生產(chǎn)工藝。但大腸桿菌的高密度發(fā)酵表達(dá)的蛋白雜蛋白多，仍需進(jìn)一步純化來(lái)獲得目的蛋白。目前蛋白質(zhì)的純化主要依據(jù)相關(guān)蛋白質(zhì)的理化及生物學(xué)性質(zhì)不同將其與雜蛋白區(qū)分開(kāi)來(lái)，對(duì)于cap蛋白的純化，鹽析法、層析法(包括離子交換層析、疏水層析、反向?qū)游?、親和層析)以及兩種及以上方法結(jié)合應(yīng)用較多。但層析法所用原料較貴且純化量小，耗費(fèi)人力物力較多，大大增加了制備成本，不適用于工業(yè)生產(chǎn)。本發(fā)明在此基礎(chǔ)上使用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)pet28a表達(dá)cap蛋白，并通過(guò)高密度發(fā)酵技術(shù)大量培養(yǎng)表達(dá)目的蛋白，同時(shí)利用兩步梯度鹽析沉淀法獲得純度較高，免疫原性好的cap蛋白，實(shí)現(xiàn)了表達(dá)量高、純化工藝簡(jiǎn)便、成本低廉等一系列優(yōu)點(diǎn)，具有突出的推廣前景。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的主要目的在于解決現(xiàn)有pcv2病毒樣顆粒疫苗制備工藝復(fù)雜且成本高，處理量小，免疫原性差，不適于大規(guī)模生產(chǎn)等技術(shù)問(wèn)題，由此本發(fā)明提供了一種可溶性重組蛋白，本發(fā)明還提供了所述可溶性重組蛋白的表達(dá)方法和純化方法，本發(fā)明還提供了所述可溶性重組蛋白在制備pcv2病毒樣顆粒疫苗的用途。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，所采取的技術(shù)方案：一種可溶性重組蛋白，所述可溶性重組蛋白是將豬圓環(huán)病毒ii型衣殼蛋白的基因進(jìn)行原核表達(dá)得到的可溶性重組蛋白，所述豬圓環(huán)病毒ii型衣殼蛋白的氨基酸序列如seqidno:1所示。

優(yōu)選地，所述豬圓環(huán)病毒ii型衣殼蛋白的基因的核苷酸序列如seqidno:2。所述豬圓環(huán)病毒ii型衣殼蛋白的基因是使用大腸桿菌通用密碼子翻譯截短cap蛋白氨基酸序列合成的基因，同時(shí)在該基因兩端分別添加5’bamhi和3’hindiii酶切位點(diǎn)，序列如seqidno:3。

本發(fā)明提供了一種載體，所述載體表達(dá)上述所述的可溶性重組蛋白。

本發(fā)明提供了一種宿主細(xì)胞，所述含有上述所述的載體。

本發(fā)明提供了一種上述所述的可溶性重組蛋白的表達(dá)方法，所述表達(dá)方法是將豬圓環(huán)病毒ii型衣殼蛋白的基因進(jìn)行原核表達(dá)，所述豬圓環(huán)病毒ii型衣殼蛋白的氨基酸序列如seqidno:1所示。

優(yōu)選地，所述原核表達(dá)的載體是pet-28a載體。

優(yōu)選地，所述原核表達(dá)中采用iptg誘導(dǎo)表達(dá)，iptg的終濃度為1mmol/l，誘導(dǎo)培養(yǎng)溫度為30℃。

本發(fā)明提供了一種上述所述的可溶性重組蛋白的純化方法，所述純化方法包括以下步驟：

(1)將表達(dá)所述可溶性重組蛋白的菌體破碎，分離收集上清液；

(2)采用兩步梯度鹽析沉淀法純化所述可溶性重組蛋白。

優(yōu)選地，所述步驟(1)中菌體為大腸桿菌菌體。

優(yōu)選地，所述步驟(2)具體包括以下步驟：

①將硫酸銨晶體粉末緩慢加入到所述步驟(1)中的上清液中，邊加邊攪拌以使硫酸銨緩慢溶解，使硫酸銨濃度達(dá)10％；

②于搖床上16℃，100rpm/min振搖4h；后于4℃沉淀12h以上，在10000-12000rpm/min下離心10min，棄沉淀留上清；

③將硫酸銨晶體粉末緩慢加入到所述步驟②收集的上清中，邊加邊攪拌以使硫酸銨緩慢溶解，使硫酸銨濃度達(dá)35％；

④于搖床上16℃，100rpm/min振搖4h；后于4℃沉淀12h以上，在10000-12000rpm/min下離心10min，留沉淀?xiàng)壣锨澹?/p>

⑤收集沉淀，即得所述可溶性重組蛋白。

本發(fā)明提供了上述所述的可溶性重組蛋白在制備pcv2病毒樣顆粒疫苗中的用途。

本發(fā)明提供了一種pcv2病毒樣顆粒疫苗，所述pcv2類(lèi)病毒顆粒疫苗包括上述所述的可溶性重組蛋白。

進(jìn)一步地，所述pcv2病毒樣顆粒疫苗還包括佐劑。

本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果：

首先，本發(fā)明所述豬圓環(huán)病毒ii型衣殼蛋白的基因基于使用大腸桿菌通用密碼子將氨基酸序列翻譯為核苷酸序列而獲得，繼而得到目的蛋白可溶的重組表達(dá)菌株，同時(shí)結(jié)合高密度發(fā)酵罐培養(yǎng)大量表達(dá)蛋白，其中上清中目的蛋白約占總蛋白的36.6％。

一方面，使用本發(fā)明提供的純化方法制備蛋白，不僅操作簡(jiǎn)便，純度大幅提高，生產(chǎn)成本低廉，而且獲得的蛋白免疫原性好，適于大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)。

又一方面，應(yīng)用上述方法制備的病毒樣顆粒疫苗不帶病毒核酸，具良好安全性，制備的病毒樣顆粒疫苗對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物沒(méi)有致病性，且免疫動(dòng)物后，產(chǎn)生豬圓環(huán)病毒抗體速度快、水平高且持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例2中大腸桿菌表達(dá)的目的蛋白的sds-page電泳圖，其中，m泳道是蛋白marker；1泳道是空載體對(duì)照；2泳道為pet-28a-cap-gene菌株可溶性的表達(dá)(菌體破碎后的上清)；3泳道則是pet-28a-cap-gene菌株的非可溶性表達(dá)(菌體破碎后的沉淀)。左側(cè)數(shù)字為marker大小，單位為kda，圖中箭頭所指為融合表達(dá)的目的蛋白。

圖2為本發(fā)明實(shí)施例2中上清中目的蛋白純化前后比較(考馬斯亮藍(lán)染色)，圖中m泳道是蛋白marker；1泳道是未純化的蛋白(菌體破碎后的上清)；2泳道為純化后蛋白(純化后的菌體破碎的上清)；

圖3為本發(fā)明實(shí)施例2中上清中目的蛋白純化前后比較(westernblot),圖中m泳道是蛋白marker；1泳道是未純化的蛋白(菌體破碎后的上清)；2泳道為純化后蛋白(純化后的菌體破碎的上清)；

圖4為本發(fā)明實(shí)施例4中本發(fā)明所述pcv2病毒樣顆粒疫苗免疫小鼠后不同時(shí)間血清中抗體水平。其中1、橫坐標(biāo)代表不同組別；2、縱坐標(biāo)代表以450nm/630nm雙波長(zhǎng)檢測(cè)的樣品吸光度；3、1w、2w、3w、4w、5w分別代表一免后1、2、3、4、5周。

具體實(shí)施方式

為更好的說(shuō)明本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)，下面將結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。實(shí)施例中cap蛋白即為本發(fā)明所述豬圓環(huán)病毒ii型衣殼蛋白。

實(shí)施例1：本發(fā)明所述可溶性重組蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建

1.1cap蛋白基因的獲得

以ncbi數(shù)據(jù)庫(kù)中的pcv2流行毒株的序列為基礎(chǔ)，經(jīng)比對(duì)后，選出一株流行毒株的cap蛋白氨基酸序列，該氨基酸序列與其余流行毒株對(duì)應(yīng)序列相同或相似度很高，氨基酸如seqidno:1所示。在保證此株cap蛋白的氨基酸不變的前提下，使用大腸桿菌通用密碼子將氨基酸序列翻譯為核苷酸序列，核苷酸序列如seqidno:2所示，使其適合在大腸桿菌中表達(dá)，然后委托金唯智公司進(jìn)行基因合成，基因合成時(shí)兩端加入酶切位點(diǎn)，加入酶切位點(diǎn)后的核苷酸序列如seqidno:3，合成后的基因命名為cap-gene。

1.2重組表達(dá)載體質(zhì)粒的構(gòu)建

將cap-gene用bamhi和hindiii兩種限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切，然后回收純化。pet-28a也進(jìn)行與cap-gene同樣的處理。將處理好的pet-28a和cap-gene在16℃連接12h，之后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到e.colidh5ɑ感受態(tài)細(xì)胞，涂布含硫酸卡納霉素的lb平板，37℃培養(yǎng)12-16h。挑取平板上的單菌落，在含硫酸卡納霉素的液體lb培養(yǎng)基培養(yǎng)4h左右，然后進(jìn)行菌液pcr鑒定和送金唯智測(cè)序。將測(cè)序正確的菌液1:1000加入到新鮮的含硫酸卡納霉素的lb中，培養(yǎng)過(guò)夜，之后抽提質(zhì)粒保存待用，重組質(zhì)粒命名為pet-28a-cap-gene。

1.3重組表達(dá)菌株的構(gòu)建

pet-28a-cap-gene重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌bl-21(de3),同樣涂布到含硫酸卡納霉素的lb平板，37℃培養(yǎng)12-16h，獲得重組表達(dá)菌株pet-28a-cap-gene菌株。

實(shí)施例2：本發(fā)明所述可溶性重組蛋白的表達(dá)、純化

2.1可溶性重組蛋白的大量表達(dá)

⑴從-20℃中取出帶有重組質(zhì)粒pet-28a-cap-gene的大腸桿菌菌種，1:1000接入硫酸卡納霉素抗性的lb液體培養(yǎng)基中37℃,220rpm搖床上過(guò)夜培養(yǎng)(12-14h)。

⑵校正5l發(fā)酵罐ph電極，配制2.5l培養(yǎng)基裝入罐中，121℃滅菌20min，冷卻后連接自動(dòng)控制系統(tǒng)，校正溶氧，調(diào)節(jié)通氣及初始轉(zhuǎn)速。

⑶10％種子液接入發(fā)酵罐，溫度37℃，手動(dòng)調(diào)節(jié)攪拌速度及通氣量，控制溶氧在30％-60％之間。

⑷當(dāng)溶氧開(kāi)始迅速上升時(shí)按流加補(bǔ)料方式加入補(bǔ)料培養(yǎng)基，流加速度5ml/min。

⑸培養(yǎng)至菌體濃度od600達(dá)到50左右時(shí)，按1mmol/l濃度加入誘導(dǎo)劑iptg，并將溫度調(diào)至30℃誘導(dǎo)培養(yǎng)7h，使終濃度od600大約至60時(shí)下罐，離心收集菌體，菌體濕重約為90g/l。樣品處理過(guò)后進(jìn)行sds-page分析，結(jié)果如圖1所示，從圖1可以看出，與泳道1的空載體pet-28a相比，2、3泳道約27kda處明顯多出一條蛋白條帶，與預(yù)期相符，表明cap蛋白能成功表達(dá)，且大部分存于上清中，為可溶性蛋白。

2.2兩步梯度鹽析沉淀法純化可溶性重組蛋白

將誘導(dǎo)完成的菌液按下述步驟處理:

⑴8000rpm離心8min，收集菌體，然后按照1:1比例加入pbs重懸菌體。

⑵重懸后的菌體利用超聲破碎儀破碎，具體破碎條件：功率200w，工作時(shí)間/間歇時(shí)間＝4sec/6sec，超聲次數(shù)根據(jù)菌液的多少?zèng)Q定(一般在光下可看到菌體呈清亮狀態(tài))。

⑶將破碎完成的菌液離心，4℃、11000-12000rpm、15min，收集上清待用。

⑷可溶性重組蛋白的純化按以下步驟進(jìn)行：

①稱(chēng)取定量磨細(xì)的硫酸銨晶體粉末往上述破碎上清液中緩慢加入，邊加邊攪拌以使硫酸銨緩慢溶解，使硫酸銨濃度達(dá)10％，此濃度能將溶解度小的雜蛋白沉淀而不影響cap蛋白溶解。

②于搖床上16℃，100rpm/min振搖4h；后于4℃沉淀過(guò)夜(12h以上)，10000-12000rpm/min，離心10min，棄沉淀留上清。

③同樣稱(chēng)取定量磨細(xì)的硫酸銨晶體粉末往步驟②收集的上清中緩慢加入，邊加邊攪拌以使硫酸銨緩慢溶解，使硫酸銨濃度達(dá)35％，此濃度下能將大部分cap蛋白沉淀析出從而與其他雜蛋白分離。

④于搖床上16℃，100rpm/min振搖4h；后于4℃沉淀過(guò)夜(12h以上)，10000-12000rpm/min，離心10min,留沉淀?xiàng)壣锨濉?/p>

⑤收集沉淀，按破碎液濃縮5倍比例加入pbs重懸，-20℃保存待用。

⑸sds-page電泳檢測(cè)、western-blot，檢測(cè)結(jié)果如圖2和圖3所示，由圖2可看出，相比未純化蛋白(泳道1)，通過(guò)本研究鹽析純化方法后蛋白純度大大提高，純度達(dá)85％(泳道2)，同時(shí)通過(guò)werstern-blot進(jìn)一步確認(rèn)cap蛋白能與pcv2單克隆抗體特異性識(shí)別，具有較好免疫原性。

實(shí)施例3：本發(fā)明所述pcv2病毒樣顆粒疫苗的制備

首先使用bca試劑盒測(cè)定上述純化好的可溶性重組蛋白，將可溶性重組蛋白濃度調(diào)至1mg/ml，然后按照1:1的體積比例將蛋白與法國(guó)賽比克公司提供的201佐劑混合，接著進(jìn)行超聲乳化。經(jīng)檢測(cè)粘度和穩(wěn)定性合格后置于4℃保存。

實(shí)施例4本發(fā)明所述pcv2病毒樣顆粒疫苗的小鼠免疫試驗(yàn)

將30只6周齡經(jīng)抗原抗體檢測(cè)雙陰性的bal/bc小鼠隨機(jī)分為3組，每組10只。各組均采用皮下注射的方式免疫，免疫一次。

第一組：每只小鼠免疫200ul滅菌后的pbs。

第二組：每只小鼠免疫200ul參考疫苗(青島易邦生物工程有限公司豬圓環(huán)病毒2型亞單位疫苗)。

第三組：每只小鼠免疫200ul由201佐劑乳化的本發(fā)明所述可溶性重組蛋白。

每周對(duì)每只小鼠進(jìn)行眼眶靜脈采血，析出的血清使用豬圓環(huán)病毒elisa檢測(cè)試劑盒進(jìn)行抗體檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖4。

結(jié)果顯示：本發(fā)明所述pcv2病毒樣顆粒疫苗免疫小鼠后能快速產(chǎn)生針對(duì)豬圓環(huán)病毒的抗體，且與商品化的亞單位疫苗(參考疫苗)相比產(chǎn)生抗體更加迅速、水平更高。

最后所應(yīng)當(dāng)說(shuō)明的是，以上實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案而非對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，盡管參照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作了詳細(xì)說(shuō)明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí)質(zhì)和范圍。

序列表

<110>華南農(nóng)業(yè)大學(xué)

<120>一種可溶性重組蛋白及其表達(dá)純化方法和用途

<130>2017

<160>3

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>194

<212>prt

<213>人工序列

<400>1

asnglyilepheasnthrargleuserargthrileglytyrthrval

151015

lyslysthrthrvalargthrprosertrpasnvalaspmetmetarg

202530

pheasnileasnasppheleuproproglyglyglyserasnproleu

354045

thrvalpropheglutyrtyrargilearglysvallysvalgluphe

505560

trpprocysserproilethrglnglyaspargglyvalglyserthr

65707580

alavalileleuaspaspasnphevalthrlysalaasnalaleuthr

859095

tyraspprotyrvalasntyrserserarghisthrilethrglnpro

100105110

phesertyrhisserargtyrphethrprolysprovalleuasparg

115120125

thrileasptyrpheglnproasnasnlysargasnglnleutrpleu

130135140

argleuglnthrthrglyasnvalasphisvalglyleuglythrala

145150155160

phegluasnseriletyraspglnasptyrasnileargilethrmet

165170175

tyrvalglnpheargglupheasnleulysaspproproleuasnpro

180185190

lys

<210>2

<211>579

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

aacggcatcttcaacacccgtctgagccgcaccatcggctataccgtgaagaaggccacc60

gtgcgcaccccgagttggaacgtggacatgatgcgcttcaacatcaacgactttctgccg120

cctggcggcggcagtaatcctctgaccgtgccgttcgagtattaccgcatccgtaaggtg180

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cagctgtggctgcgtttacagaccaccggcaatgttgaccacgtgggtctgggtaccgcc480

ttggagaacagcatctacgatcaggactacaacatccgcatcaccatgtacgtgcagttc540

cgcgagttcaacctgaaagacccgccgctgaaccctaag579

<210>3

<211>591

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

ggatccaacggcatcttcaacacccgtctgagccgcaccatcggctataccgtgaagaag60

gccaccgtgcgcaccccgagttggaacgtggacatgatgcgcttcaacatcaacgacttt120

ctgccgcctggcggcggcagtaatcctctgaccgtgccgttcgagtattaccgcatccgt180

aaggtgaaggtggagttttggccgtgcagccctattacccaaggcgaccgtggcgttggc240

agtacagccgtgatcctggatgacaacttcgtgaccaaggccaacgccctgacctacgac300

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tacttcaccccgaagcctgtgctggatcgcaccatcgactacttccagccgaacaacaag420

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accgccttggagaacagcatctacgatcaggactacaacatccgcatcaccatgtacgtg540

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